CN111323586A - 一种用于食管鳞癌早期诊断的elisa试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药生物技术领域，具体公开了一种用于食管鳞癌早期诊断的ELISA试剂盒，该试剂盒包括固相载体和包被于固相载体上的肿瘤相关抗原，所述肿瘤相关抗原由HMGB1、TLR4、TAK1、ATG5、SLC22A3和CD38组成。进一步地，所述试剂盒还包括样品稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、阳性对照血清、阴性对照血清、显色液、终止液和洗涤液。本发明的ELISA试剂盒可以有效检测食管鳞癌，尤其是早期食管鳞癌，其检测灵敏度高达92.7%，特异度高达84.0%，可用于食管鳞癌高发区无症状人群的大规模筛查、诊断，有利于无症状高危人群筛查和早期发现。

Description

一种用于食管鳞癌早期诊断的ELISA试剂盒

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种用于食管鳞癌早期诊断的ELISA试剂盒。

背景技术

食管鳞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是发生于人食管上皮组织的一种恶性肿瘤，它降低人们的生活质量，严重危及人们是生命健康，给患者家庭带来沉重的灾难，给国家带来沉重的负担。ESCC是全球范围内常见的消化系统恶性肿瘤，世界各国均存在典型的食管鳞癌高发区。中国的食管鳞癌高发区域聚集特性突出，70年代以来陆续发现许多典型食管鳞癌高发区，如河南林县、河北磁县、山东肥城、山西阳泉等，而食管鳞癌正是该地区肿瘤相关死亡的主要原因。现有研究已经发现了几个与ESCC发生发展相关的风险因素，包括生活方式(吸烟、饮酒、吃热烫食物、常吃腌制食物、蛋白质或维生素摄入量低、吃霉变食物)和疾病状况(肥胖、胃肠道炎症、胃食管返流、幽门螺杆菌感染)等。

由于缺乏特异度强、敏感度高、经济简便的早期诊断食管鳞癌和高危人群筛查指标和方法，导致初次就诊的病人中，80％都是中晚期患者，预后极差，5年生存率仅为10％左右。肿瘤细胞的分化程度、淋巴结转移等被认为是影响食管鳞癌患者术后生存期的主要因素。肿瘤细胞的浸润侵袭和恶性转移则是导致食管鳞癌复发和死亡的主要原因。目前对食管鳞癌早期筛查最常见的方法是胃镜检查。但是，因内镜筛查有创伤、高成本和低效率(例如，常规高发区内镜筛查如上“高危人群”，早期癌的发现率仅2％左右，约90％以上的无症状“高危人群”均为“陪伴检查”)，限制了内镜筛查在无症状高危人群食管鳞癌早期发现中的推广应用。因此，筛选高效、特异的食管鳞癌分子标志物对于食管鳞癌患者的早期发现、早期筛查不仅有助于提高食管鳞癌生存期，而且可以为食管鳞癌生物防治提供新的思路。这是目前所要解决的首要问题。

肿瘤相关抗原(Tumor-associated Antigen，TAA)是与病理生理过程相关的可测量的变化。近年的研究发现了一系列恶性肿瘤的相关抗原，其中一些已经应用于临床辅助诊断，比如当甲胎蛋白已作为肝癌诊断的一项生物学指标、CA125已应用于卵巢癌的普查和筛选，癌胚抗原(CEA)已作为早期诊断肠道腺癌特异度标志物。本研究团队在前期利用全基因组关联分析、全基因组测序和全基因组外显子测序等技术建立的基因组学数据库的基础上，应用自身抗体芯片技术筛选出6种TAA，分别为HMGB1、TLR4、TAK1、ATG5、SLC22A3和CD38，并且发现在食管粘膜鳞状上皮发生癌变之前就能够检测到上述6种TAA的自身抗体存在，这些自身抗体对于食管鳞癌和癌前病变患者具有较高的特异度和敏感性。因此，本研究用这6种TAA制成的试剂盒能够应用于高发区无症状人群早期食管鳞癌筛查并预测其转归。

发明内容

针对现有技术中存在的问题和不足，本发明旨在提供一种用于食管鳞癌早期诊断的ELISA试剂盒。

为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：

肿瘤相关抗原HMGB1、TLR4、TAK1、ATG5、SLC22A3和CD38的组合在制备用于食管鳞癌诊断的试剂盒中的应用。

一种用于食管鳞癌早期诊断的ELISA试剂盒，所述试剂盒包括固相载体和包被在固相载体上的肿瘤相关抗原，所述肿瘤相关抗原由HMGB1、TLR4、TAK1、ATG5、SLC22A3和CD38组成。

根据上述的ELISA试剂盒，优选地，所述试剂盒还包括样品稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、阴性对照血清、阳性对照血清、洗涤液、显色液和终止液。更加优选地，所述样品稀释液为含有1％(W/V)BSA的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液；所述第二抗体稀释液为含有1％(W/V)BSA的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液；所述显色液由显色液A和显色液B组成，所述显色液A为0.02％(W/V)TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)，所述显色液B为0.006％(W/V)过氧化脲素；所述终止液为10％的硫酸；洗涤液为含0.05％吐温20的pH7.4的0.01M的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液。

根据上述的ELISA试剂盒，优选地，所述第二抗体带有可检测的标记物。

根据上述的ELISA试剂盒，优选地，所述标记物为辣根过氧化物酶。

根据上述的ELISA试剂盒，优选地，所述第二抗体为RecA蛋白。

根据上述的ELISA试剂盒，优选地，所述阳性对照血清为CD38阳性对照血清，所述阴性对照血清为CD38阴性对照血清。

根据上述的ELISA试剂盒，优选地，所述CD38阳性对照血清是使用间接ELISA和Western blot方法检测CD38抗体均为阳性的食管鳞癌患者血清，所述CD38阴性对照血清是使用间接ELISA和Western blot方法检测PCNA抗体表达水平为正常人群血清抗体平均含量的正常人的血清。大量研究已明确表明CD38抗原在食管鳞癌的发生发展过程中起十分重要的调节作用，并且抗CD38抗体在食管鳞癌患者血清中具有较高的阳性率。本发明选择CD38抗体阳性血清作为阳性对照，同一ELISA试剂盒的其他抗原抗体反应的强弱可以据此作为参照，达到质控的目的。

根据上述的ELISA试剂盒，优选地，所述固相载体为酶标板。更加优选地，所述固相载体优选为为48孔酶标板(共6行8列)；所述48孔酶标板按照精心设计的布局图(参见图1)包被HMGB1、TLR4、TAK1、ATG5、SLC22A3和CD38这6种肿瘤相关抗原，其中每行包被有一种抗原，每种抗原包被于7个点样孔中。同一检测对象的血清样品经过稀释后加入本发明ELISA试剂盒的48孔酶标板的一列，可达到同时检测出该血清样品中6种抗TAA抗体表达水平的目的。所述48孔酶标板上设有空白对照孔、阳性对照孔和阴性对照孔，所述空白对照孔中包被不含抗原的包被液，所述阳性对照孔和阴性对照孔中均包被CD38抗原。

根据上述的ELISA试剂盒，优选地，所述试剂盒的检测对象为人类血清。同一检测对象的血清样品经过稀释后加入本发明ELISA试剂盒的48孔酶标板的一列，可达到同时检测出该血清样品中6种抗TAA抗体表达水平。

本发明中六种肿瘤相关抗原的基本信息如下：

高迁移率族蛋白(HMGB1)是一种非组蛋白染色体结合蛋白，主要存在于细胞核中，其在从活化的巨噬细胞、单核细胞、树突细胞或如NK细胞等其他细胞主动分泌时充当蛋白促炎性细胞因子，HMGB1充当炎症触发物从而吸引炎性细胞，并充当组织修复触发物从而募集干细胞并促进其增殖。而且，HMGB1使树突细胞(DC)活化并促进其功能性成熟以及其对淋巴结趋化因子的响应。当外界环境发生改变时，HMGB1可以主动或被动释放至细胞外，引起下游信号通路的激活，促使肿瘤细胞发生转移、浸润。因此HMGB1可以作为食管鳞癌早期筛查的新靶点。

Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)，主要有TLR2、TLR4和TLR9。HMGB l与TLR结合后，主要通过髓样分化因子(myeloid differentiation factors 88，MyD88)依赖信号通路转导，激活核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)活性，引起肿瘤坏死因子-α(tumornecrosis factor-α，TNF-α)、白介素(interleukin，I L)-1、I L-6、I L-8等促炎细胞因子的基因表达上调并大量释放。有研究证实TLR表达的上调与胃癌、肺癌、卵巢癌等发生、发展有密切关系，且TLR4是目前发现与肿瘤发病关系最密切的TLR家族成员之一。

转化生长因子β激活激酶1(TGF-βactivated protein kinase 1，TAK1或MAP37、MAPKKK)是细胞内的分子中心，1995年最先由Matsumoto及其同事在酵母双杂交实验中发现的色氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于MAP3K家族成员之一。TAK1调控着NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶MAPK信号通路，在细胞生存、免疫应答、新陈代谢和致癌中起到关键作用。现有的研究表明TAK1在肿瘤的发生、发展和转移过程中作为一个肿瘤促进子或肿瘤抑制子发挥着重要的作用。TAK1发挥活性需要通过TGF-β受体信号通路、IL-1受体通路、Toll样受体(TLR)信号通路、脂多糖(LPS)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、TNFR1信号通路和B细胞受体(BCR)信号通路激活；首先TAK1需要被募集并和其连接蛋白TAB1、TAB2、TAB3结合形成聚泛素链——TAK1-TAB1/TAB2/TAB3复合体；然后再根据不同的结合蛋白激活下游的信号通路，其次TAK1的激活需要有Thr184和Thr187在其激活环内磷酸化，突变了的Thr184和Thr187残留物能降低TAK1激酶的活性，此种情况提示这些残留物的自动磷酸化对于TAK1的激活来说是必需的。

ATG5是自噬体形成过程中所必需的一种自噬相关蛋白质。细胞自噬是一个高度保守的代谢途径，能通过降解异常蛋白质和细胞器来维持细胞稳态。在正常情况下，自噬的活性处于基础水平，而当细胞处于饥饿状态、低氧应急或激素剥夺等情况时，自噬活性迅速上调。而当自噬发生异常时经常会导致各种疾病，如心血管疾病、神经退行性病变以及癌症等。鉴于肿瘤的高发病率及难治性，自噬与肿瘤的的研究越来越多，结果发现作为维持细胞自稳态的自噬在肿瘤的进展及治疗中有着重要的意义。研究表明自噬相关基因ATG5在部分肿瘤中表达上调，尤其几种胃癌细胞株中，ATG5蛋白表达均高于正常胃粘膜上皮细胞株。另外，在人类已知的16种ATG基因中有4种(ATG2B、ATG5、ATG9B和ATG12)具有7个或更多核苷酸的单核苷酸重复序列，而具有单核苷酸重复的基因的移码突变是具有微卫星不稳定性(MSI)的癌症的特征，其中具有单核苷酸重复的ATG5的移码突变在在具有高微卫星不稳定性(MSI-H)的胃癌和结直肠癌中常见的，并且表明这些突变可能通过放松自噬过程来促成癌症发展。

SLC22A3基因：溶质转运体超家族(Super family of solute carriers，SLC)又叫有机阳离子转运体(Organic cation transporters，OTCs)，是一类介导有机阳离子跨细胞膜转运的多特异度转运蛋白，由于SLC22A3编码的阳离子转运蛋白功能的特殊，使得SLC22A3在药理学和疾病关联研究领域受到极大的关注，尤其是在新型肿瘤诊断标志物和增加抗肿瘤药物作用以及预防药物的毒副反应等方面，且这种蛋白对清除体内的药物和环境毒素起重要作用。对该基因的结构研究表明，SLC22A3的启动子区域位于CpG岛，提示表观遗传学改变可能调控该基因表达水平。更新的研究表明，SLC22A3在前列腺癌患者的非肿瘤及肿瘤组织中出现的低表达与位于人类染色体6q22.3上的高风险位点rs9364554有密切相关性。更有趣的是，SLC22A3的这种基因-表达关联性只在祖籍欧洲人群中出现，祖籍日本及非洲的人群中都观察不到该种现象，提示基因-基因之间、基因-环境之间的潜在相互作用。

CD38蛋白是可以催化NAD⁺转化为环状ADP核糖(cADPR，cyclic ADP-ribose)并将cADPR水解成ADP核糖的双功能外切酶。通常情况下，CD38由造血细胞和实体组织表达。大多数髓质胸腺细胞为CD38⁺，静止和循环的T和B细胞为CD38^-，活化的细胞为CD38⁺。CD38蛋白是恶性浆细胞上表达的抗原之一，在各种恶性血液病细胞中表达，包括但不限于多发性骨髓瘤细胞，B细胞慢性淋巴细胞白血病细胞，B细胞急性淋巴细胞性白血病细胞。从功能上来看，CD38蛋白参与受体介导，作用于粘附，信号传递以及外部(ecto-)酶活等活动。CD38具有多种环化酶活性作用，它能够催化细胞代谢的中间产物NAD⁺转化成第二信使环化二磷酸腺苷核糖(cADPr)，后者可激活理阿诺碱受体(ryanodine recep tors,RyRs)，而促进Ca 2+释放。同时，CD38蛋白分子还具有脱氢酶活性，催化cADPr生成二磷酸腺苷核糖(ADPr)。除通过a2⁺传递信号外，CD38蛋白还可通过与T和B细胞的抗体-受体复合物或其他类型的受体复合物，例如MHC分子，进行信号交叉传递。通过这种方式，CD38蛋白参与了多种细胞反应以及免疫球蛋白G1(Immunoglobulin G 1，IgG1)的转化与分泌。

与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果为：

(1)本发明首次HMGB1、TLR4、TAK1、ATG5、SLC22A3和CD38这6种TAA作为一个组合，联合检测人血清中上述6种TAA的抗体表达水平，可以有效检测食管鳞癌，尤其是早期食管鳞癌，其检测灵敏度高达92.7％(即早期食管鳞癌患者中应用这6个肿瘤相关抗原进行诊断时被正确的诊断为早期食管鳞癌的比率为92.7％)，特异度(特异度又称真阴性率，即实际无病按该诊断标准被正确的判为无病的百分比，较高的特异度意味着较低的误诊率)达到了84.0％(即非食管鳞癌患者用这6种肿瘤相关抗原联合检测时，被确定为未患食管鳞癌者的比率为84.0％)；因此，本发明试剂盒在将食管鳞癌检测灵敏度提高到92.7％的同时，能够将特异度保持在84.0％，很大程度上提高了早期食管鳞癌的检出率以及正确率，同时也大大降低了早期食管鳞癌的误诊率，极大地提高了早期食管癌诊断的准确性。

(2)本发明试剂盒的检测灵敏度和特异度远高于现有临床内镜筛查食管鳞癌的检出率，可用于食管鳞癌高发区无症状人群的大规模筛查，能够大大提高早期食管鳞癌的检出率，有利于无症状高危人群筛查和早期发现，从而大大降低了食管鳞癌患者的死亡率，为食管鳞癌患者和家庭带来极大的福祉。

(3)本发明制备的ELISA试剂盒可同时检测血清样品中6种TAA抗体的表达水平，与6种TAA抗体的单独检测相比，6种TAA抗体联合检测，检出成功率高，技术重现性好，耗材少，成本低，操作简单，使用方便、快捷，极大地提高了临床食管鳞癌的检测效率和诊断效率，能够在普通实验室推广使用，有很好的应用前景。

附图说明

图1为本发明ELISA试剂盒中48孔酶标板的抗原包被布局图(其中，抗原名称代表了该孔包被了此抗原，加入的是待测血清，用来检测待测血清中相应抗体的表达水平；“+”代表阳性对照孔，加入的是阳性对照血清；“-”代表阴性对照孔，加入的是阴性对照血清；“空白”代表空白对照孔，该孔加入不含血清的样本稀释液，其它操作均相同，该空白对照用于反应实验过程中的背景值)。

图2为间接酶联免疫吸附实验原理图。

图3为6种TAA的自身抗体在食管鳞癌血清中的分布图。

图4为6种TAA自身抗体在对照组血清中的分布图。

图5为6种TAA自身抗体在食管鳞癌组和对照组中的阳性率结果图。

图6为6种TAA自身抗体检测食管鳞癌的ROC曲线图。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明作进一步详细说明，但并不限制本发明的范围。

下列实施例所述的实验方法，如无特殊说明，均为本技术领域常规技术，或按照生产厂商所建议的条件；所用试剂、材料和仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：试剂盒的制备

本发明根据间接酶联免疫法的原理制备了一种用于食管鳞癌多联快速检测ELISA试剂盒。间接酶联免疫法的原理是将抗原连接到固相载体上，样品中待测抗体与之结合成固相抗原-受检抗体复合物，再用酶标二抗与固相抗原-受检抗体复合物中的抗体结合，形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，然后测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量(参见图2)。

1.实验材料及试剂：

(1)6种肿瘤相关抗原蛋白(HMGB1、TLR4、TAK1、ATG5、SLC22A3、CD38)，购买于武汉艾美捷科技有限公司；

(2)48孔酶标板：3590(costar.美国)；

(3)包被液：50mM碳酸盐缓冲液，pH＝9.6；

(4)封闭液：含2％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

(5)样品稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

(6)第二抗体稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

(7)酶标第二抗体：辣根过氧化物酶标记的RecA蛋白(Invitrogen公司)；

(8)洗涤液：含0.05％吐温20的PH7.4的0.01M的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液；

(9)阳性对照血清：CD38阳性对照血清，即使用间接ELISA和Western blot方法检测CD38抗体均为阳性的食管鳞癌患者血清；

(10)阴性对照血清：CD38阴性对照血清，即使用间接ELISA和Western blot方法检测CD38抗体表达水平为正常人群血清抗体平均含量的正常人的血清；

(11)显色液A：0.02％(W/V)TMB，配制：取甲基联苯胺(TMB)0.005g，溶解于25ml去离子水中；

(12)显色液B：0.006％(W/V)过氧化脲素，配制：取柠檬酸4.665g、Na₂HPO₄ 18.40g，充分溶解于400ml去离子水中，加0.75％过氧化氢脲素3.2ml，调整pH值至5.0-5.5，加去离子水定容至终体积500ml，混匀4℃保存；

(13)终止液：10％的硫酸；

(14)酶标仪：Star Fax 2100(Awareness.美国)。

2.制备抗原包被的酶标板：

(1)制备6种肿瘤相关抗原溶液：

将6种肿瘤相关抗原蛋白分别溶解于包被液中，充分混匀，配制成6种不同浓度的抗原溶液。其中，HMGB1溶液的浓度为0.125μg/ml，TLR4溶液的浓度为0.25μg/ml，TAK1溶液的浓度为1.0μg/ml，ATG5溶液的浓度为1.0μg/ml，SLC22A3溶液的浓度为0.75μg/ml，CD38溶液的浓度为0.35μg/ml。

(2)包被酶标板：

将制备好的6种肿瘤相关抗原溶液按照图1所示的布局分别加入到48孔酶标板的点样孔中，加样量为100μl/孔；阳性对照孔和阴性对照孔中加入CD38抗原溶液，空白对照孔加入包被液，37℃恒温培养箱孵育1h，4℃过夜后去除包被液，然后用洗涤液洗涤3次，每次洗涤3min。

(3)封闭：

向包被后的48孔酶标板的点样孔中加入封闭液(加样量为300μl/孔)，室温孵育2小时，然后除去封闭液。

(4)干燥、包装：

将封闭处理后的48孔酶标板放置37℃烘干箱烘干后，包装，得到抗原包被的48孔酶标板，4℃保存备用。

3.本发明试剂盒的组成如下：

(1)步骤2制备的抗原包被的48孔酶标板；

(2)样品稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

(3)第二抗体稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

(4)酶标第二抗体：辣根过氧化物酶标记的RecA蛋白(Invitrogen公司)；

(5)显色液：显色液由显色液A和显色液B组成，其中，显色液A为0.02％(W/V)TMB，显色液B为0.006％(W/V)过氧化脲素；使用时将显色液A和显色液B按照1:1等体积混合均匀；

(6)终止液：10％的硫酸；

(7)洗涤液：含0.05％吐温20的PH7.4的0.01M的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液；

(8)阳性对照血清：CD38阳性对照血清；

(9)阴性对照血清：CD38阴性对照血清。

试剂(2)-(9)分别包装后与抗原包被的48孔酶标板构成试剂盒。

实施例2：试剂盒的使用方法

1.血清样本孵育：

将待检测的血清样本用样品稀释液按1:100的比例进行稀释，然后将稀释后的血清样本加入已包被抗原的48孔酶标板的反应孔中，加样量为100μl/孔，置于37℃恒温培养箱孵育1h，然后弃去反应孔中液体，用洗涤液洗涤3次，每次洗涤3min。

2.酶标二抗孵育：

将辣根过氧化物酶标记的RecA蛋白用第二抗体稀释液按1:80000的比例进行稀释，然后将稀释后的辣根过氧化物酶标记的RecA蛋白加入48孔酶标板的反应孔中，加样量为100μl/孔，置于37℃恒温培养箱孵育50min，然后弃去点样孔中液体，用洗涤液洗涤3次，每次洗涤3min。

3.显色及终止反应：

将显色液A和显色液B按照1:1等体积混合均匀，然后将混合后的显色液迅速加入48孔酶标板的反应孔中，加样量为100μl/孔，置于37℃避光反应15min，然后向每个反应孔中再加入50μl终止液，终止显色反应，于20分钟内用酶标仪器读取OD450光密度值，并用空白对照孔调零。

4.结果判定：

以阴性对照孔所测OD值的平均数加两个标准差(Mean+2SD)为截断值(cut-off值)，反应孔中OD值读数大于等于截断值的判断为阳性，反应孔中OD值读数小于截断值的判断为阴性。

实施例3：本发明试剂盒的诊断价值分析

用本发明实施例1所述的试剂盒检测早期食管鳞癌患者和正常人的血清样本，以评估和分析本发明试剂盒用于早期食管鳞癌筛查和诊断的价值。

1.样本来源

收集来自郑州大学第一附属医院河南省食管鳞癌重点开放实验室份血清样本，其中正常人血清150份(对照组)，早期食管鳞癌患者血清150份(早期食管鳞癌组)。150例正常人中，男性79例，女71例，平均年龄为55.8±9.1岁，年龄范围为39-80岁。150例食管鳞癌患者中，男性82例，女性68例，平均年龄58.9±7.3岁，年龄范围48-80岁。所有食管鳞癌患者血清都是在患者最初诊断为早期食管鳞癌并尚未受任何放化疗时收集的，被诊断的时间为2015年1月至2018年12月。正常人血清来自门诊胃镜并经活检病理确诊为非癌或非癌前病变的健康人群。

2.血清制备

抽取空腹静脉血5ml至离心管中，室温中静置30分钟，离心(2000转/min)，吸取上层血清分装，每管100μl，-80℃冰箱储存。

3.实验方法

采用本发明实施例1制备的试剂盒和实施例2所述试剂盒的使用方法对150例食管鳞癌患者血清(食管鳞癌组)和150例正常人血清(对照组)中6种肿瘤相关抗原自身抗体的含量进行检测。应用MedCalc软件绘制6种肿瘤相关抗原自身抗体在食管鳞癌组和对照组中的平均表达水平分布图(结果见图3和图4)；以实施例2步骤4中的结果判断标准为标准，分别计算食管鳞癌组和对照组中6种肿瘤相关抗原自身抗体的阳性率(每组中检测出的阳性对象例数除以该组被检测对象总例数即为阳性率)，并应用Excel软件绘制6种肿瘤相关抗原自身抗体在早期食管鳞癌组和对照组中阳性率的柱形图(结果见图5)；应用SPSS22.0软件进行统计学检验，采用两独立样本卡方检验方法比较食管鳞癌组和对照组抗体阳性率，检验水准α＝0.05，当P＜0.05时，结果具有统计学意义，然后采用筛检试验的评价方法评价自身抗体检测食管鳞癌的诊断价值(结果参见表1和图6)。

4.结果分析

图3为6种肿瘤相关抗原自身抗体在食管鳞癌组血清中的分布图，从该图中可以看出，6种肿瘤相关抗原自身抗体在食管鳞癌组中平均表达水平较高平均OD值在0.5附近浮动。图4为6种肿瘤相关抗原自身抗体在150例对照组血清中的分布图，从该图中可以看出，这6种肿瘤相关抗原自身抗体在对照组中平均表达水平比较低，平均OD值为0.2左右。由图3和图4可知，食管鳞癌组患者血清中6种TAA自身抗体的平均水平均明显高于对照组，说明6种TAA自身抗体可以用于食管鳞癌的诊断。

图5为6种肿瘤相关抗原自身抗体在食管鳞癌组和对照组中的阳性率结果图，由该图可知，早期食管鳞癌组患者血清中这6种TAA自身抗体阳性率在39％～48％范围内，而在对照组中的阳性率仅为5％～10％。而且，经统计学检验，这6种TAA自身抗体在食管鳞癌组中的阳性率均高于对照组。由此证明，这6种TAA自身抗体可以作为食管鳞癌早期诊断的检测指标，用于食管鳞癌的早期诊断。

表1 不同肿瘤相关抗原自身抗体组合联合检测结果

由表1知，随着抗原组合数目的增加，早期食管鳞癌诊断的灵敏度也随之增加；当6种肿瘤相关抗原组合时，灵敏度高达92.7％，也就是说食管鳞癌患者中应用该方法能够正确的诊断为食管鳞癌的比率为92.7％；虽然随着抗原数目的增加，检测特异度逐渐降低，但当6种肿瘤相关抗原组合时，其特异度仍然能够达到84.0％，这一结果表明非食管鳞癌患者采用6种肿瘤相关抗原联合检测时，被正确的诊断为未患食管鳞癌的百分比为84.0％；因此，使用HMGB1、TLR4、TAK1、ATG5、SLC22A3和CD38这6种肿瘤相关抗原组合进行早期食管鳞癌诊断，可以在保证诊断特异度的前提下大幅度的提高诊断的灵敏度。此外，约登指数在统计学中是指敏感度和特异度之和减去1，其数值范围是0～1，约登指数越接近于1，其诊断价值越大，表明该方法的应用价值越高。随着抗原数目的增加，约登指数在不断增大且逐渐趋向于1，表明6种肿瘤相关抗原组合用于诊断和筛查早期食管鳞癌的方法具有较好的诊断价值。因此，采用HMGB1、TLR4、TAK1、ATG5、SLC22A3和CD38这6种肿瘤相关抗原的自身抗原联合检测待测血清中相应自身抗体表达水平的方法，既能保持较高的特异度又能提高诊断的敏感度，对评估待测对象患食管鳞癌的风险具有很好的诊断和应用价值，是较为理想的早期食管鳞癌的筛查方法和手段。

图6为6种肿瘤相关抗原自身抗体检测食管鳞癌的ROC曲线图。由图6可知，采用单一TAA检测时，ROC曲线下面积均较低，其中，单独采用CD38进行检测时，ROC曲线下面积达到最大0.6322(95％CI 0.5694 to 0.6951，P value<0.0001)；随着抗原组合数目的增加，ROC曲线下面积逐渐增大，其中，采用CD38+HMGB1这一组合进行检测时，ROC曲线下面积为0.7089(95％CI 0.6507 to 0.7672，P value<0.0001)；采用CD38+HMGB1+TLR4这一组合进行检测时，ROC曲线下面积为0.7448(95％CI 0.6879 to 0.8017，P value<0.0001)；采用CD38+HMGB1+TLR4+TAK1这一组合进行检测时，ROC曲线下面积为0.7700(95％CI 0.7160 to0.8240，P value<0.0001)；采用CD38+HMGB1+TLR4+TAK1+ATG5这一组合进行检测时，ROC曲线下面积为0.8250(95％CI 0.7781 to 0.8719，P value<0.0001)；采用CD38+HMGB1+TLR4+TAK1+ATG5+SLC22A3这一组合进行检测时，ROC曲线下面积达到了最大，为0.8752(95％CI0.8357 to 0.9146，P value<0.0001)。由此说明，使用本发明ELISA试剂盒对于食管鳞癌具有较高的诊断价值，进一步证实了本发明ELISA试剂盒是较为理想的食管鳞癌早期诊断和筛查方法和手段。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，但不仅限于上述实例，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.肿瘤相关抗原HMGB1、TLR4、TAK1、ATG5、SLC22A3和CD38的组合在制备用于食管鳞癌诊断的试剂盒中的应用。

2.一种用于食管鳞癌早期诊断的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括固相载体和包被在固相载体上的肿瘤相关抗原，所述肿瘤相关抗原由HMGB1、TLR4、TAK1、ATG5、SLC22A3和CD38组成。

3.根据权利要求2所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样品稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、阴性对照血清、阳性对照血清、洗涤液、显色液和终止液。

4.根据权利要求3所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述第二抗体带有可检测的标记物。

5.根据权利要求4所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述标记物为辣根过氧化物酶。

6.根据权利要求3～5任一所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述第二抗体为RecA蛋白。

7.根据权利要求6所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述阳性对照血清为CD38阳性对照血清，所述阴性对照血清为CD38阴性对照血清。

8. 根据权利要求7所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述CD38阳性对照血清是使用间接ELISA和Western blot方法检测CD38抗体均为阳性的食管鳞癌患者血清，所述CD38阴性对照血清是使用间接ELISA和Western blot方法检测PCNA抗体表达水平为正常人群血清抗体平均含量的正常人的血清。

9.根据权利要求8所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述固相载体为酶标板。

10.根据权利要求9所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测对象为人类血清。

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