CN109999184A - Tak1蛋白在制备食管癌预后评估试剂或试剂盒中的应用 - Google Patents
Tak1蛋白在制备食管癌预后评估试剂或试剂盒中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物技术和医学诊断领域，具体是转化生长因子β激活激酶1(TAK1)在制备食管癌预后评估试剂或试剂盒中的应用。本发明还提供TAK1蛋白在制备治疗食管癌的药物中的应用。本发明研究发现TAK1能够特异性负向调控食管鳞癌细胞株ECA109细胞的增殖、迁移和侵袭，食管癌患者肿瘤组织中TAK1表达水平明显低于癌旁正常组织。由此本发明进一步提供了TAK1在食管癌患者预后评估中的应用。本发明提供了TAK1在制备食管癌预后评估试剂或试剂盒中的应用，以及相应的检测试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和医学诊断领域，具体地说，是转化生长因子β激活激酶1(TGF-β activated protein kinase 1，TAK1或称MAP3K7、MAPKKK)在制备食管癌预后评估试剂或试剂盒中的应用。
背景技术
食管癌是世界上最常见的八大恶性肿瘤之一。在全球范围内，其发病率排名第八位，死亡率排名第六位，严重威胁着人类健康。全世界每年新增食管癌患者约45万人，每年大约有20万人死于食管癌。我国是食管癌的高发地区，其发病率和死亡率均位于世界之首。根据WHO的统计，全世界每年因食管癌死亡的患者中，约有一半是中国人，我国每年约有15万人死于食管癌。
食管癌的病理类型主要包括食管鳞状细胞癌、腺癌、腺鳞癌、燕麦小细胞癌等，其中95％以上的为鳞状细胞癌。我国食管癌患者主要表现为食管鳞状细胞癌(ESCC)。食管癌很难早期发现，病程进展迅速，预后较差，治疗以手术、化疗、放疗相结合的方式为主，5年生存率仅为15％～25％。到目前为止，对于食管鳞癌的治疗仍无突破性进展，因此，食管癌的早期诊断和治疗成为急救医学的研究热点之一。为了更加有效地治疗和预防食管癌，研究者越来越关注食管癌的早期诊断、治疗及病情发展预判。目前，发现可评估食管癌患者预后的生物标记物是亟需解决的问题。
本领域迫切需要发现在食管癌中能预测术后患者疗效的生物标志物，这方面的研究对临床治疗食管癌具有重要意义。
转化生长因子β激活激酶1(TGF-β activated protein kinase 1，TAK1或称MAP3K7、MAPKKK)是细胞内的分子中心，1995年最先由Matsumoto及其同事在酵母双杂交实验中发现的色氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于MAP3K家族成员之一。TAK1调控着NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶MAPK信号通路，在细胞生存，免疫应答，新陈代谢和致癌中起到关键作用。现有的研究表明TAK1在肿瘤的发生、发展和转移过程中作为一个肿瘤促进子或肿瘤抑制子发挥着重要的作用。该基因由17个外显子和16个内含子构成，在生物信息传递过程中可形成4个在组织中分布存在显著差异的剪接体，其表达的蛋白由606个氨基酸构成，分子量为67kD；其N末端为经典的激酶结构域。TAK1发挥活性需要通过TGF-β受体信号通路、IL-1受体通路、Toll样受体(TLR)信号通路、脂多糖(LPS)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、TNFR1信号通路和B细胞受体(BCR)信号通路激活；首先TAK1需要被募集并和其连接蛋白TAB1、TAB2、TAB3结合形成聚泛素链---TAK1-TAB1/TAB2/TAB3复合体；然后再根据不同的结合蛋白激活下游的信号通路，其次TAK1的激活需要有Thr184和Thr187在其激活环内磷酸化，突变了的Thr184和Thr187残留物能降低TAK1激酶的活性，此种情况提示这些残留物的自动磷酸化对于TAK1的激活来说是必需的。在有机体内，TAK1的激活受到TAB1，TAB2和TAB3的调控，它们各自对调控的贡献是复杂的，依赖于组织的类型和细胞所处的外部环境。研究发现，当TAK1被敲除或是通过特异性抑制剂阻滞其生物学功能时，TAK1的激活能够抑制caspase-8与caspase-3的激活，凋亡蛋白酶的失活从而阻止了凋亡细胞的死亡。TAK1抑制caspase的激活主要的机制：TAK1-NF-κB途径。现在已明确TAK1是NF-κB上游的激酶，NF-κB转录上调抗凋亡蛋白如c-FLIP和IAP家族蛋白而IAP家族包括cIAP1，cIAP2和XIAP，能够抑制caspase激活。当TAK1缺失时，细胞对数种应激导致的细胞凋亡变得敏感；激活的TAK1可通过NF-κB途径和MAPK途径促进细胞的生存，因此，TAK1在有机体内有促进生存的作用，当其表达异常时可能会引起机体细胞对各种生物因子导致的细胞死亡变得敏感。
现有的资料表明，TAK1的异常表达几乎在人类所有系统的肿瘤中都能发现。在食管癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、胃癌等等不同的恶性肿瘤中呈现出异常表达，并与恶性肿瘤的发生发展及其预后有着密切的关系。尽管如此，该基因在食管癌生物学行为中的作用国内外却未见研究，
目前为止，TAK1在食管癌中的研究尚无文献报道，其在食管癌发生、发展中的分子机制仍不清楚。
目前还未见TAK1蛋白在制备食管癌术后疗效评估试剂及试剂盒中应用的研究报道。
而本领域迫切需要寻找到可有效用于食管癌治疗、诊断和预后评估分子，并将其用于这些用途中。
发明内容
本发明的目的在于提供TAK1蛋白的新应用，特别是在制备食管癌预后评估试剂或试剂盒中的应用。本发明还提供TAK1蛋白在制备治疗食管癌的药物中的应用。
本发明的第一方面，提供TAK1蛋白在制备食管癌预后评估试剂或试剂盒中的应用。
本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现，采用免疫组化方法检测TAK1蛋白在食管癌患者术后食管癌组织中的表达量，基于TAK1蛋白的表达量与食管癌的这种相关性，以该蛋白作为分子标志物，对其表达量进行检测可以作为评估食管癌病人预后的指标。
进一步的，所述的试剂或试剂盒检测TAK1蛋白在术后食管癌组织或者原发灶穿刺组织中的表达量。
进一步的，食管癌组织或者原发灶穿刺组织中TAK1高表达的食管癌病人预后更好，生存期长，复发率低，TAK1低表达的食管癌病人预后不佳。
进一步的，所述的试剂或试剂盒采用免疫组化方法检测TAK1蛋白在术后食管癌组织或者原发灶穿刺组织中的表达量。
更进一步的，所述的试剂或试剂盒是将TAK1蛋白作为分子标记，利用TAK1单克隆抗体或多克隆抗体，以及免疫组化试剂，分析TAK1蛋白在术后食管癌组织或者原发灶穿刺组织中的表达量，预测食管癌患者预后情况。
所述的TAK1单克隆抗体，为商品化抗体，如兔TAK1单克隆抗体(ab109526)。
进一步的，所述的免疫组化试剂包括二甲苯，乙醇，3％H2O2溶液，1％BSA封闭液，DAB显色试剂，苏木素和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG。
本发明的第二方面，提供一种评估食管癌患者预后的方法，所述的方法为检测TAK1蛋白在术后食管癌组织或者原发灶穿刺组织中的表达量。
进一步的，所述的检测TAK1蛋白在术后食管癌组织或者原发灶穿刺组织中的表达量的方法，包括以下步骤：
(a)利用免疫组化试剂二甲苯，乙醇，3％H2O2溶液，1％BSA封闭液，DAB显色试剂，苏木素和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG将食管癌组织切片进行免疫组化染色；
(b)利用显微镜和成像装置拍摄为数码照片；
(c)根据免疫组化染色结果人工评分原则，给出评分。
优选的，所述的方法具体步骤如下：
(1)制备食管癌组织石蜡切片，60℃烤箱4h；
(2)切片脱腊至水；
(二甲苯Ⅰ①10min→二甲苯Ⅱ②10min→二甲苯Ⅲ③10min→100％乙醇①5min→100％乙醇②5min→95％乙醇①5min→95％乙醇②5min→85％乙醇5min→75％乙醇5min→0.01M PBS洗5min)
(3)抗原修复：切片放入0.01M柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中煮沸20min；(4)自然冷却至室温，0.01M PBS洗10min×3；
(5)3％H2O2溶液，室温放置20min；
(6)0.01M PBS洗10min×3；
(7)1％BSA封闭30min，37℃；
(8)甩去封闭液，不洗，直接加一抗(兔TAK1单克隆抗体，购自Abcam公司，稀释比例1：50)。置入湿盒中4℃冰箱过夜；
(9)4℃取出，室温复温15min，然后0.01M PBS洗10min×3；
(10)滴加二抗(辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG，购自丹麦DAKO公司，即用型，无需稀释)1h，37℃；
(11)0.01M PBS洗10min×3，DAB显色2-10min，镜下观察；
(12)双蒸水终止显色，苏木素复染3min；
(13)分化后自来水返蓝，蒸馏水浸泡；
(14)脱水透明，盖玻片封片；
(15)显微镜下观察阳性染色，于食管癌组织随机选取3个视野并拍照；
(16)采用高倍镜下综合染色强度和阳性细胞所占比例进行半定量测定。具体评分如下：
1.染色强度评分标准：不着色0分，黄色1分，棕黄色2分；黄褐色3分。
2.阳性细胞所占比例评分标准:阳性细胞数≤5％为0分；5％～25％为1分；25％～50％为2分；50％～75％为3分；75％以上为4分。
3.两种评分相乘，0-4分为阴性；4-8为弱阳性；8分以上为强阳性。
根据上述方法检测病人食管癌组织中TAK1表达情况，进行评分，阴性和弱阳性组为低表达，强阳性为高表达，食管癌组织中TAK1高表达的食管癌病人预后更好。
本发明的TAK1蛋白与食管癌相关性的发现，为预测食管癌患者预后提供了全新的生物标志物。TAK1蛋白高表达的食管癌病人术后治疗后预后较好。
本发明利用免疫组化技术、显微镜拍照和人工半定量测定肿瘤组织中TAK1蛋白的表达量，并结合术后随访信息，确定TAK1蛋白表达量与食管癌术后病人的生存期存在相关性，TAK1蛋白能用于评估食管癌患者预后的生物标志物，对于食管癌病人术后治疗具有重要的指导意义。对于失去手术时机的食管癌患者，可以利用穿刺获得食管癌组织进行TAK1表达水平的检测，或者通过收集患者血液中的循环肿瘤细胞进行TAK1基因扩增的检测，从而评估其对患者预后的影响。
本发明人经过长期而深入的研究发现：死亡的食管癌患者癌组织中TAK1分子的表达水平明显低于幸存的患者。发明人在此基础上进行进一步的研究发现：TAK1分子可在体、内外有效抑制食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭，从而发挥抗肿瘤作用。由此，发明人发现了TAK1分子在食管癌预后评估中的新用途，从而在此基础上完成了本发明。
本发明的第三方面，提供一种评估食管癌患者预后的试剂盒，所述的试剂盒中包含检测TAK1蛋白在术后食管癌组织或者原发灶穿刺组织中的表达量的试剂。
进一步的，所述的试剂盒中包含：TAK1单克隆抗体或多克隆抗体，以及免疫组化试剂。
进一步的，所述的免疫组化试剂包括二甲苯，乙醇，3％H2O2溶液，1％BSA封闭液，DAB显色试剂，苏木素和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG。
本发明的评估食管癌患者预后的试剂盒可用于食管癌治疗病情发展预判：
通常，可利用本发明的试剂盒，采用如下方法进行食管癌发展判断、治疗方案选择和/或预后评估：(a)从对象获得待测样品；(b)使待测样品与本发明检测试剂盒中的检测试剂接触；(c)检测该待测样品中TAK1分子的水平，并将该水平与对照水平相比较；(d)根据检测结果进行食管癌预后评估：如检测结果显示对象组织中的TAK1分子的水平低于对照水平，则提示所述对象更可能病情恶化及死亡。
如本文所用，术语“正常对照”是指用作参照的TAK1分子的水平，其包括但不限于：由同一对象的食管癌旁正常生物样品中测得的TAK1分子水平、通过统计学确定的群体标准水平、或经标准化的水平。
本发明的第四方面，提供TAK1蛋白在制备治疗食管癌的药物中的应用。
进一步的，所述的TAK1蛋白抑制食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭。
在本发明的一个优选实施方式中，通过EdU细胞增殖实验和Transwell实验证明，TAK1蛋白过表达体外抑制食管癌细胞株ECA109细胞的增殖、迁移和侵袭。
进一步的，所述的TAK1蛋白抑制体内食管癌细胞的成瘤速度。
在本发明的一个优选实施方式中，在ECA109细胞系中，过表达TAK1能够抑制裸鼠体内食管癌细胞的成瘤速度，敲低TAK1能够促进裸鼠体内食管癌细胞的成瘤速度。
本发明的第五方面，提供促进或上调TAK1蛋白表达的试剂在制备治疗食管癌的药物中的应用。
进一步的，所述的促进或上调TAK1蛋白表达的试剂是指任何可增加TAK1蛋白的活性、增加TAK1蛋白的稳定性、促进TAK1蛋白的表达、增加TAK1蛋白的有效作用时间、或促进TAK1蛋白的转录和加工的物质等。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的促进或上调TAK1蛋白表达的试剂为靶向TAK1的过表达质粒，重组菌，重组病毒等。
本发明的第六方面，提供一种治疗食管癌的药物，所述的治疗食管癌的药物的活性成分是TAK1蛋白，或促进或上调TAK1蛋白表达的试剂。
如本文所用，术语“预后”是指预测疾病的可能病程和结局，其包括判断疾病的特定后果(如康复，某种症状、体征和并发症等其它异常的出现或消失及死亡)。本发明中所述的预后不良包括但不限于：生存期缩短、多器官衰竭出现比例增加、病程延长等。在预测了患者预后情况后，可结合降低TAK1蛋白的表达的治疗方法改善患者的预后。
本发明的有益效果在于：
本发明揭示了TAK1分子在食管癌预后评估中的新用途，为TAK1的研究和开发利用提供了新的思路和途径；
本发明的TAK1分子可有效用于食管癌预后评估，从而为本领域提供了一种新颖的食管癌诊断剂和/或治疗剂，具有一定的临床应用前景。
附图说明
图1为TAK1过表达对食管癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用。A，TAK1过表达及阴性对照组食管癌细胞增殖情况；B，上述细胞增殖实验统计图；C，TAK1过表达及阴性对照组食管癌细胞迁移和侵袭实验；D，上述细胞迁移和侵袭统计图；结果显示为平均值±标准差，**，P<0.01，***P<0.001。
图2为TAK1的表达与食管癌细胞增殖的相关性。结果显示为平均值±标准差。A，TAK1敲低及阴性对照组食管癌细胞裸鼠皮下成瘤情况；B，TAK1敲低及阴性对照组食管癌细胞裸鼠皮下种瘤后30d内种肿瘤体积的大小；C，TAK1过表达及阴性对照组食管癌细胞裸鼠皮下成瘤情况；D，TAK1过表达及阴性对照组食管癌细胞裸鼠皮下种瘤后30d内种肿瘤体积的大小。
图3为200例经手术治疗的食管癌患者癌组织中TAK1的免疫组化染色的代表性图，可见肿瘤组织中TAK1表达高低情况。
图4为TAK1表达与200例患者总体生存时间的Kaplan-Meier生存曲线；可见TAK1高表达组患者预后更好。P值使用GraphPad Prism中的Wilcoxon检验计算。
图5为TAK1在病例1的食管癌组织中免疫组化染色结果图，可见肿瘤组织中TAK1着色很弱。
图6为TAK1在病例2的食管癌组织中免疫组化染色结果图，可见肿瘤组织中TAK1没有着色。
图7为TAK1在病例3的食管癌组织中免疫组化染色结果图，可见肿瘤组织中TAK1着色较强。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1：TAK1体外抑制食管癌细胞株ECA109细胞的增殖、迁移和侵袭
靶向TAK1的过表达质粒及对照质粒pcDNA3.1由永联生物科技有限公司公司合成。
ECA109细胞购自ATCC(American Type Culture Collection美国菌种保藏中心)。使用lipo2000转染试剂(Invitrogen公司)转染质粒，6h后更换新鲜培养基。转染24小时后，消化细胞进行计数并种板，进行下一步实验检测。
EdU细胞增殖实验：
a.在24孔板中(20μM)培养适当数量的细胞。细胞培养过夜并且恢复到正常状态后，进行转染。
b.转染24h后，配制2X的EdU工作液：由于EdU工作液是与培养液等体积加入到24孔板中，所以需要配制成2X的工作液。推荐的EdU终浓度为10μM(1X)，用细胞培养液1:500稀释EdU(10mM)即可得到2X的EdU工作液(20μM)。
c.将37℃预热的2X的EdU工作液(20μM)，等体积加入24孔板中，使24孔板中的EdU终浓度变为1X。
d.继续孵育细胞2小时。
e.EdU标记细胞完成后，去除培养液，并加入1ml 4％的多聚甲醛，室温固定15分钟。
f.去除固定液，每孔用1ml洗涤液洗涤细胞3次，每次3-5分钟。
g.去除洗涤液，每孔用1ml通透液(0.3％Triton X-100的PBS)，室温孵育10-15分钟。
h.去除通透液，每孔用1ml洗涤液洗涤细胞1-2次，每次3-5分钟。
i.EdU检测：24孔板中每孔的反应体系为100μl的反应混合物。
j.配制Click Additive Solution：对于C0078S，用1.3ml去离子水溶解一管ClickAdditive，混匀至全部溶解，即为Click Additive Solution；对于C0078L，加入10.4ml去离子水溶解试剂盒中提供的一瓶Click Additive，混匀至全部溶解，即为Click AdditiveSolution。配制后可以适当分装，并-20℃保存。
k.配制Click反应液。Click Reaction Buffer：86μl；CuSO4：4μl；Azide 594：0.2μl；Click Additive Solution：10μl
l.去除上一步骤中的洗涤液。
m.每孔加入100μl Click反应液，轻轻摇晃培养板以确保反应混合物可以均匀覆盖样品。
n.室温避光孵育30分钟。
o.吸除Click反应液，用洗涤液洗涤3次，每次3-5分钟。
p.对细胞核进行染色，为了检测细胞增殖的比例，使用Hoechst 33342进行细胞核染色。每孔加1X Hoechst 33342溶液1ml，室温避光孵育10分钟。用洗涤液洗涤3次，每次3-5分钟。
q.荧光显微镜下观察，拍照，Azide 594的最大激发波长是590nm，最大发射波长是615nm。Hoechst 33342为蓝色荧光，最大激发波长为346nm，最大发射波长为460nm。
EdU试剂盒货号及来源：C0078S，购自碧云天生物技术公司。
如图1A所示，TAK1过表达后的ECA109细胞增殖数量减少。
该结果表明：TAK1过表达抑制ECA109细胞的增殖。
Transwell实验：
1.侵袭实验：按1:5比例用无血清的预冷基础培养基稀释matrigel胶，取100μl稀释胶加到24孔transwell上室中，37℃孵育5h，基础培养液轻洗凝胶，水花基底膜，上室加200μl细胞悬液(含1×105)，下室加入500μl的含10％胎牛血清的完全培养基。37℃、5％CO2培养24h后，移去下室。取一块新的24孔板，4℃预冷0.01M PBS洗1-2次，每次10min。加入0.1％结晶紫染色液500μl，将小室置于其中，使膜浸没在染色液中，37℃孵育30min后取出，0.01M PBS清洗。ZEISS倒置显微镜下20倍光镜随机取5个视野，拍摄，计数。
2.迁移实验：除了不用matrigel胶外，其他方法同上。
细胞计数后统计发现TAK1过表达的细胞迁移和侵袭能力减弱(如图1B)。
该结果表明：TAK1在体外抑制ECA109细胞的迁移和侵袭。
上述结果表明：TAK1能够抑制食管癌细胞株ECA109细胞的增殖、迁移和侵袭。
实施例2：TAK1体内抑制食管癌细胞株ECA109细胞的增殖
在ECA109细胞中转染TAK1shRNA慢病毒、TAK1过表达慢病毒及对应对照病毒，24小时后开始使用嘌呤霉素(2.5ug/ml)进行筛选。2-3周后，建立稳定敲低/过表达TAK1细胞系和对照细胞系。
裸鼠成瘤实验：BALB/c裸鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司，在SPF级环境中饲养。
a.选择稳定过表达/敲降TAK1的ECA109细胞系，构建裸鼠皮下(3×106cells/只)食管鳞癌肿瘤模型；
b.种瘤后，每隔3天用游标卡尺测量皮下瘤体生长大小，计算肿瘤体积(肿瘤体积＝1/2长×宽2)，观察裸鼠体重变化及裸鼠生存期的差异；28天后处死裸鼠，对肿瘤进行拍照、称重和固定；
c.免疫组化检测肿瘤组织中TAK1的表达水平及阳性率、染色强度。
裸鼠成瘤实验检测稳定过表达/敲降TAK1后ECA109细胞在裸鼠皮下成瘤情况；结果如图2所示。
结果显示：在ECA109细胞系中，过表达TAK1能够抑制裸鼠体内食管癌细胞的成瘤速度，敲低TAK1能够促进裸鼠体内食管癌细胞的成瘤速度。
上述结果表明：TAK1能够抑制食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭。
实施例3：免疫组化染色检测食管癌组织与癌旁组织中TAK1的表达
随机选取100例食管癌患者术后的食管癌组织石蜡切片(食管癌组织切片均来南通大学附属医院，由2名病理科医生确诊为食管癌)，采用免疫组化方法检测TAK1蛋白在食管癌组织中的表达量并计算免疫组化评分，具体步骤如下：
(1)制备食管癌组织石蜡切片，60℃烤箱4h；
(2)切片脱腊至水；
(二甲苯Ⅰ①10min→二甲苯Ⅱ②10min→二甲苯Ⅲ③10min→100％乙醇①5min→100％乙醇②5min→95％乙醇①5min→95％乙醇②5min→85％乙醇5min→75％乙醇5min→0.01M PBS洗5min)
(3)抗原修复：切片放入0.01M柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中煮沸20min；(4)自然冷却至室温，0.01M PBS洗10min×3；
(5)3％H2O2溶液，室温放置20min；
(6)0.01M PBS洗10min×3；
(7)1％BSA封闭30min，37℃；
(8)甩去封闭液，不洗，直接加一抗(兔TAK1单克隆抗体，购自Abcam公司，稀释比例1：50)。置入湿盒中4℃冰箱过夜；
(9)4℃取出，室温复温15min，然后0.01M PBS洗10min×3；
(10)滴加二抗(辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG，购自丹麦DAKO公司，即用型，无需稀释)1h，37℃；
(11)0.01M PBS洗10min×3，DAB显色2-10min，镜下观察；
(12)双蒸水终止显色，苏木素复染3min；
(13)分化后自来水返蓝，蒸馏水浸泡；
(14)脱水透明，盖玻片封片；
(15)显微镜下观察阳性染色，于食管癌组织随机选取3个视野并拍照；
(16)采用高倍镜下综合染色强度和阳性细胞所占比例进行半定量测定。具体评分如下：
1.染色强度评分标准：不着色0分，黄色1分，棕黄色2分；黄褐色3分。
2.阳性细胞所占比例评分标准:阳性细胞数≤5％为0分；5％～25％为1分；25％～50％为2分；50％～75％为3分；75％以上为4分。
3.两种评分相乘，0-4分为阴性；4-8为弱阳性；8分以上为强阳性。
采用以上免疫组化方法的试验步骤检测TAK1蛋白在100例术后食管癌组织中表达情况，并依据评分标准进行评分。结果表明：根据评分将患者分为阴性63例、弱阳性22例、强阳性15例；将阴性和弱阳性定义为低表达组，强阳性定义为高表达组，其中低表达组85例，高表达组15例(见图3)。
实施例4：TAK1的表达与患者生存期的关系分析
结合预后信息，对实施例3的200例病人中TAK1蛋白低表达的食管癌患者进行生存分析，数据分析采用SPSS软件23.0，生存曲线分析使用Kaplan-Meier法，两组之间比较用log-rank检验。结果发现TAK1低表达患者生存和TAK1高表达患者之间具有显著地统计学差异(P＝0.187)(见图4)。结果提示：TAK1低表达组患者预后更差。
实施例5：病例1的TAK1表达及预后情况
病例1：某食管癌患者肿瘤的组织切片，采用以上免疫组化方法的试验步骤检测TAK1蛋白的表达量，结果发现TAK1低表达(食管癌组织染色结果的显微图片如图5所示)。
经术后随访知，该患者术后预后差，其总生存时间为3个月，并且术后1个月出现复发转移。
实施例6：病例2的TAK1表达及预后情况
病例2：某食管癌患者肿瘤的组织切片，采用以上免疫组化方法的试验步骤检测TAK1蛋白的表达量，结果发现TAK1较低表达(食管癌组织染色结果的显微图片如图6所示)。
经术后随访知，该患者术后预后较差，其总生存时间为7个月，并且术后3个月出现复发转移。
实施例7：病例3的TAK1表达及预后情况
病例3：某食管癌患者肿瘤的组织切片，采用以上免疫组化方法的试验步骤检测TAK1蛋白的表达量，结果发现TAK1较高表达(食管癌组织染色结果的显微图片如图7所示)。
经术后随访知，该患者术后预后较好，总生存时间为48个月，并且术后未发现复发转移。
由以上试验结果可知，通过采用免疫组化的方法检测TAK1蛋白分子表达量能评估患者预后。当免疫组化染色为TAK1高表达的食管癌患者，其预后更好。显然，TAK1蛋白的表达量与食管癌患者的预后具有相关性，因此，以TAK1蛋白作为分子标志物，对其表达量进行检测能评估患者术后生存期和危险系数。相应的，特异性抗TAK1蛋白的抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体，能用于制备评估食管癌预后的试剂或试剂盒，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (10)
1.TAK1蛋白在制备食管癌预后评估试剂或试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的TAK1蛋白在制备食管癌预后评估试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的试剂或试剂盒检测TAK1蛋白在术后食管癌组织或者原发灶穿刺组织中的表达量。
3.根据权利要求2所述的TAK1蛋白在制备食管癌预后评估试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的试剂或试剂盒采用免疫组化方法检测TAK1蛋白在术后食管癌组织或者原发灶穿刺组织中的表达量。
4.根据权利要求3所述的TAK1蛋白在制备食管癌预后评估试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的试剂或试剂盒是将TAK1蛋白作为分子标记，利用TAK1单克隆抗体或多克隆抗体，以及免疫组化试剂，分析TAK1蛋白在术后食管癌组织或者原发灶穿刺组织中的表达量，预测食管癌患者预后情况。
5.一种评估食管癌患者预后的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含检测TAK1蛋白在术后食管癌组织或者原发灶穿刺组织中的表达量的试剂。
6.TAK1蛋白在制备治疗食管癌的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的TAK1蛋白在制备治疗食管癌的药物中的应用，其特征在于，所述的TAK1蛋白抑制食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭。
8.根据权利要求6所述的TAK1蛋白在制备治疗食管癌的药物中的应用，其特征在于，所述的TAK1蛋白抑制体内食管癌细胞的成瘤速度。
9.促进或上调TAK1蛋白表达的试剂在制备治疗食管癌的药物中的应用。
10.一种治疗食管癌的药物，其特征在于，所述的治疗食管癌的药物的活性成分是TAK1蛋白，或促进或上调TAK1蛋白表达的试剂。
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