CN114427003A

CN114427003A - Nhp2在预测癌症放疗敏感性和预后中的应用

Info

Publication number: CN114427003A
Application number: CN202210102997.6A
Authority: CN
Inventors: 王雪涔; 陈勇; 彭振维; 岳欣; 刘然义; 孟媛
Original assignee: First Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University; Sun Yat Sen University Cancer Center
Current assignee: First Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University; Sun Yat Sen University Cancer Center
Priority date: 2022-01-27
Filing date: 2022-01-27
Publication date: 2022-05-03
Anticipated expiration: 2042-01-27
Also published as: CN114427003B

Abstract

本发明提供了一种用于检测评估癌症放疗敏感性的试剂盒，包括检测NHP2基因表达水平的引物和/或检测NHP2蛋白含量的试剂。本发明对通过大量研究和筛选，发现NHP2是一个与结直肠癌放疗耐受极为相关的基因，在临床回顾性研究分析和体内外功能分析中发现，NHP2较高的表达水平与肿瘤退缩不良存在明显的正相关性，可以用以预测结直肠癌放疗耐受以及敏感程度，为患者接受术前治疗的联系提供提前评估。本发明通过揭示NHP2基因与结直肠癌放疗耐受的关联性，其对于解决个体间临床疗效差异与退缩效果/预后评估空白的难题，更好地实现精准治疗具有重要的现实意义。为人类攻克NHP2提供了一个新的药物治疗靶点，从而为后续的药物研发、临床治疗等提供了一个新的方向。

Description

NHP2在预测癌症放疗敏感性和预后中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及NHP2在预测癌症放疗敏感性和预后中的应用。

背景技术

随着社会经济快速发展，人们的生活方式和膳食结构发生改变，老龄化进程加快，近年来，我国结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）发病率持续升高，严重威胁着人民的健康。结直肠癌主要采用手术、放疗、化疗以及靶向治疗在内的综合治疗。基于常规长程放疗的新辅助治疗能显著降低肿瘤分期，提高手术切除率及保肛率，降低局部复发率。但是，患者对新辅助治疗的反应差异较大，放疗耐受常常使部分患者治疗效果不佳，甚至错失手术根治的机会。精准的早期预测对治疗方案的选择尤为重要，但目前可用的判断指标仍是以肿瘤原发部位、分期、直肠系膜筋膜受累程度等临床因素为准，敏感度和特异性均较低。因此，挖掘更多的放疗敏感性调控因子并且阐明其作用机制，将为提高CRC放疗疗效、精准选择治疗方案、改善预后提供重要的理论依据。

放疗是结直肠癌综合治疗中的重要手段之一，在直肠癌中，放疗的应用广泛。NCCN指南及ESMO指南均推荐“新辅助放化疗+根治性手术+辅助化疗”作为局部进展期直肠癌（Locally Advanced Rectal Cancer，LARC，临床分期T3/T4或N⁺）标准的治疗方案。LARC的新辅助放化疗通常采用调强放疗（IMRT）的常规分割放疗（即长疗程放疗，总剂量约50.4Gy）+氟尿嘧啶为基础的化疗。对于不耐受长程放疗的患者，也可采用短程放疗（5Gy/天，连续5天）替代。新辅助放化疗能提高LARC的局部控制率、保肛率以及远期生存率。另外，在结肠癌中，NCCN指南提示，对可切除的非转移T4期结肠癌，术前行以氟尿嘧啶为基础化疗的同期放疗有助于提高手术切除率。

对于新辅助放化疗的疗效评价，德国直肠癌研究组的结果表明，接受新辅助放化疗的LARC患者的预后取决于放化疗后的病理分期而不是治疗前的临床分期。总体而言，目前多用肿瘤退缩分级（Tumor Regression Grade, TRG）作为放化疗疗效评价指标，它根据肿瘤组织中残留肿瘤细胞及纤维化浸润比例判断肿瘤的退缩程度。事实上，部分患者并未在新辅助放化疗中获益，甚至出现进展，这就说明利用治疗前临床分期来预估放化疗敏感性，以及制定治疗方案是有局限性的。因此，筛选鉴定出能够预测新辅助放化疗敏感性的标志物是临床上亟待解决的难题和重点，这将有助于为患者制定精准治疗方案，改善预后。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中利用治疗前临床分期来预估放化疗敏感性所存在的局限性，从而提供了一种用于检测评估癌症放疗敏感性的试剂盒。通过检测体内生物标记物NHP2的表达情况，从而预期放疗耐受情况，为后期的治疗方案的制订以及预后评估提供辅助诊断依据。

为了解决上述技术问题，本发明是通过如下技术方案得以实现的。

本发明第一方面提供了一种用于检测癌症放疗敏感性和/或疗效的试剂盒，包括检测NHP2基因表达水平的引物和/或检测NHP2蛋白含量的试剂；以及PCR酶、PCR缓冲液、dNTPs、荧光底物中的一种或多种。

作为优选地，所述检测NHP2基因表达水平的引物选自下列引物对中的至少一对：

引物对1：上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物序列如SEQ ID NO：2所示；

引物对2：上游引物序列如SEQ ID NO：3所示，下游引物序列如SEQ ID NO：4所示；

引物对3：上游引物序列如SEQ ID NO：5所示，下游引物序列如SEQ ID NO：6所示；

引物对4：上游引物序列如SEQ ID NO：7所示，下游引物序列如SEQ ID NO：8所示；

引物对5：上游引物序列如SEQ ID NO：9所示，下游引物序列如SEQ ID NO：10所示。

作为优选地，所述检测NHP2蛋白含量的试剂选自NHP2单克隆抗体和/或NHP2多克隆抗体。

作为优选地，所述检测NHP2蛋白含量的试剂选自Anti-NHP2 antibody（Abcam，货号：ab180498）。

作为优选地，所述荧光底物选自Syber Green或荧光标记的探针。

作为优选地，所述癌症选自结直肠癌、肝癌中的一种或多种。

作为优选地，所述结直肠癌选自局部进展期结直肠癌。

本发明第二方面提供了一种检测NHP2表达水平的试剂在制备用于检测癌症放疗敏感性和/或疗效预测的组合物中的应用。

作为优选地，所述检测NHP2表达水平的试剂包括检测NHP2基因表达水平的引物和/或检测NHP2蛋白含量的试剂。

作为优选地，所述结直肠癌选自局部进展期结直肠癌。

本发明第三方面提供了一种组合物在制备检测癌症放疗敏感性和/或疗效预测的试剂盒中的应用，所述组合物包括检测NHP2基因表达水平的引物和/或检测NHP2蛋白含量的试剂。

作为优选地，所述结直肠癌选自局部进展期结直肠癌。

本发明第四方面提供了NHP2抑制剂在制备提高癌症放疗敏感性的产品中的应用。

作为优选地，所述NHP2抑制剂选自基于NHP2设计的shRNA（shNHP2）。

作为优选地，所述shRNA序列选自SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12中的一种或多种。

作为优选地，所述结直肠癌选自局部进展期结直肠癌。

在没有特别说明的情况下，在本发明上下文中，所述引物和/或引物对组是指用于在PCR中合成NHP2基因cDNA链的PCR引物，从而用于检测NHP2基因的表达水平。

利用shRNA或sgRNA文库结合二代测序构建高通量筛选模型筛选功能基因，是一种广泛公认且行之有效的方法。发明人选择两株CRC遗传背景不同的细胞（HCT116/HT29），利用全基因组shRNA文库（针对约15000个基因，共75000条shRNA）进行放疗耐受基因高通量筛选，设置放射组和非放射组，进行二代测序分析后，将两个细胞的结果取交集，最终筛选出了可能与放疗耐受相关基因NHP2，初步推测NHP2的表达下调可能使结直肠癌细胞对放疗增敏。

进一步地，发明人在体外细胞水平进行了功能验证，在HCT116细胞中，经放射干预后，发现稳定敲NHP2能显著提升放疗敏感性。在HT29细胞中进一步验证功能，发现稳定敲降NHP2均能增敏放疗。此后的体内实验也验证了NHP2与放疗耐受的相关性。基于以上功能结果可以明确NHP2为CRC放疗耐受相关基因。

本发明相对于现有技术具有如下技术效果：

（1）本发明对通过大量研究和筛选，发现NHP2是一个与结直肠癌放疗耐受极为相关的基因，在临床回顾性研究分析和体内外功能分析中发现，NHP2较高的表达水平与肿瘤退缩不良存在明显的正相关性，可以用以预测结直肠癌、肝癌等放疗耐受以及敏感程度，为患者接受术前治疗的联系提供提前评估。

（2）本发明通过揭示NHP2基因与结直肠癌放疗耐受的关联性，其对于解决个体间临床疗效差异与退缩效果/预后评估空白的难题，更好地实现精准治疗具有重要的现实意义。为人类攻克NHP2提供了一个新的药物治疗靶点，从而为后续的药物研发、临床治疗等提供了一个新的方向，具有极高的社会价值和市场应用前景。

附图说明

图1为不同肿瘤中NHP2表达情况示意图。

图2为在各类结直肠癌中NHP2表达情况示意图。

图3为HCT116和HT29细胞中NHP2基因的shRNA拷贝数变化示意图。

图4为NHP2对放射后不同时间点γH2AX蛋白水平影响示意图。

图5为NHP2对放射后不同时间点γH2AX蛋白水平影响定量分析结果示意图。

图6为HCT116细胞放射前后NHP2的核定位情况示意图。

图7为HCT116细胞放射干预后NHP2影响H2B泛素化修饰的情况示意图。

图8为NHP2对HCT116细胞放射敏感性结果示意图。

图9为NHP2对HCT116细胞放射敏感性定量分析结果示意图。

图10为NHP2对HT29细胞放射敏感性结果示意图。

图11为NHP2对HT29细胞放射敏感性定量分析结果示意图。

图12为NHP2对SK-Hep1细胞放射敏感性结果示意图。

图13为NHP2对SK-Hep1细胞放射敏感性定量分析结果示意图。

图14为NHP2对MHCC97H细胞放射敏感性结果示意图。

图15为NHP2对MHCC97H细胞放射敏感性定量分析结果示意图。

图16为NHP2对荷瘤小鼠放射治疗肿瘤生长体积影响示意图。

图17为NHP2对荷瘤小鼠放射治疗肿瘤肿瘤及抑瘤率影响示意图。

图18为NHP2对荷瘤小鼠放射治疗生存情况影响结果示意图。

图19为NHP2对LARC患者生存情况影响示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

在无特别说明的情况下，本发明上下文中所列出的包括HCT116、HT29、SK-Hep-1及MHCC97H等细胞系均按照现有技术进行培养，所有细胞系均通过中国典型培养物保藏中心（武汉）短串联重复分析鉴定，并使用PCR检测试剂盒（上海Biothrive Sci）验证是否存在支原体污染，同时在液氮中冷冻保存并用于后续实验。本发明所使用的试剂中，均通过市售获得。对于临床标本的使用，均与患者签署了知情同意书，相关程序及方法符合医学伦理学要求以及药物临床试验质量管理规范。本发明所使用的实验方法，例如DNA提取、全基因组测序、引物设计、免疫组化、Western blot、细胞实验、动物实验等均为本领域的常规方法和技术。

生物学实验重复中选择具有代表性的结果呈现在上下文附图中，数据按照图示中规定的以mean±SD和mean±SEM展示。所有体外实验至少重复三次，动物实验重复两次。数据采用GraphPad Prism 8.0或SPSS 22.0软件进行分析。采用t检验、卡方检验、方差分析等常规医学统计学方法比较两组或两组以上的平均值差异。p＜0.05被认为是一个显著的差异。

实施例1 结直肠癌放疗耐受基因的筛选

通过检索Oncomine网站发现，在多个数据库中，NHP2在结直肠癌中有表达上调的现象（参见图1）；更进一步地利用TCGA数据库发现，NHP2在结直肠癌中的表达水平较正常组织明显升高（参见图2）。

进一步地，为了明确NHP2与结直肠癌发生发展尤其是放疗敏感的相关性，利用全基因组shRNA文库对结直肠癌细胞放疗耐受相关基因进行筛选和验证，具体步骤如下：

（1）将全基因组shRNA文库（MISSION LentiPlex^TM Human Pooled shRNA，针对约15000个基因，共75000条shRNA）利用慢病毒载体转染至两株遗传背景不同的CRC细胞（HCT116和HT29）中；

（2）经过嘌呤霉素稳定筛选后，将细胞分为实验组和对照组，其中实验组用6Gy射线放射处理，对照组不进行处理；

（3）放射处理7天后提取细胞全基因组DNA进行PCR扩增，富集shRNA后进行高通量二代测序分析后，采用MAGeCK分析法进行分析，筛选出可能的放疗耐受相关基因，具体筛选条件如下：

（a）log2（fold change）＜-2.0；

（b）FDR（用Benjamin-Hochberg程序校正后的P值）≤0.05且FDR由小到大排名在1000名之内；

（c）放射后至少有3条shRNA拷贝数较非放射组降低。

筛选结果如图3所示。通过筛选发现，在放射后有关NHP2的shRNA拷贝数出现了显著降低，从而提示NHP2可能与结直肠癌放疗耐受存在明显相关性，通过NHP2基因的表达下调可能使结直肠癌细胞对放疗增敏。

实施例2 NHP2对结直肠癌放疗后DNA双链断裂损伤修复的影响

放射最直接的作用是导致DNA双链断裂（DSBs），DSBs损伤修复主要存在两种机制，非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）修复。为了验证NHP2是否影响结直肠癌DNA DSBs，对DSBs关键蛋白γH2AX的动态变化进行了检测，具体步骤如下：

（1）将HCT116细胞消化、收集，加入裂解液，冰上裂解1h；

（2）4℃ 15000×g离心15min，取上清加入loading buffer（至1×），95℃水浴5min；

（3）取步骤（2）制备得到的样品进行蛋白凝胶电泳；

（4）电泳完成后取蛋白凝胶进行转膜操作（PVDF膜，200mA恒流转膜2h）；

（5）转膜完成后取出PVDF膜置于封闭液中，于垂直摇床10rpm室温封闭2h；

（6）封闭完成后清洗PVDF膜，浸入一抗（γH2AX：货号：2577，品牌：Cell SignalTechnology；GAPDH：货号：2188，品牌：Cell Signal Technology）中，置于垂直摇床上10rpm4℃孵育过夜；

（7）一抗孵育完成后，清洗PVDF膜，随后浸入二抗（HRP-linked anti-rabbit IgG（抗兔）：货号：7074，品牌：Cell Signal Technology；HRP-linked anti-mouse IgG （抗鼠）：货号：7076，品牌：Cell Signal Technology）中，置于垂直摇床上10rpm室温孵育2h；

（8）二抗孵育完成后，清洗PVDF膜，利用化学发光仪对目标蛋白进行检测。

结果如图4-5所示。结果显示，与对照组相比，NHP2能够明显降低放射处理后1h、2h时的γH2AX水平，加快DSBs损伤修复.

为了明确放射干预后NHP2在核内的定位与状态，在HCT116细胞中通过免疫荧光检测放射诱导下的foci（IR-induced foci，IRIF）情况，具体步骤如下：

（1）试剂配置：

封闭液：先用PBS配置0.3% Triton-X 100（v/v），然后量取0.3% Triton-X-PBS950𝜇L，加入正常羊血清50𝜇L；

抗体稀释液：称取BSA 0.01g，用0.3% Triton-X-PBS 1mL将其溶解；

一抗：按照抗体说明书按比例用抗体稀释液配置一抗；

二抗：按1:1000的比例用抗体稀释液配置荧光二抗；

DAPI：用PBS将DAPI配置成1μg/mL；

（2）细胞处理：干预过程需在玻璃底培养皿中进行，干预结束后，弃培养基，用PBS清洗3次；

（3）弃PBS，加入多聚甲醛1mL，室温固定20min；

（4）弃多聚甲醛，加入PBS 1mL，垂直摇床60rpm室温洗涤5min，重复3次；

（5）弃PBS，加入封闭液，37℃封闭1h；

（6）弃封闭液，加入一抗（Flag：货号：8146，品牌：Cell Signal Technology），4℃孵育过夜；

（7）回收一抗，加入PBS 1mL，垂直摇床60rpm室温洗涤5min，重复3次；

（8）弃PBS，加入二抗（goat anti-rabbit Alexa Fluro-488：货号：A11034，品牌：Invitrogen公司），避光室温孵育1h；

（9）弃二抗，加入PBS 1mL，垂直摇床60rpm避光室温洗涤5min，重复3次；

（10）弃PBS，加入DAPI，避光室温孵育2min；

（11）弃DAPI，加入PBS 1mL，垂直摇床60rpm避光室温洗涤5min，重复3次；

（12）用激光共聚焦显微镜观察、拍照。

结果如图6所示，结果显示，放射干预后NHP2在核内IRIF数量显著增多，聚集效应明显，且能持续存在一段时间。

H2B是组蛋白亚型之一，能使未损伤细胞转录延长。H2B可以发生磷酸化、乙酰化、泛素化等多种翻译后修饰，进而调控染色质的致密性。DNA损伤时，H2B单泛素化能使染色质松弛，有利于DNA修复蛋白及时被招募到DNA断端发挥功能。而且，在DSBs损伤修复中，断端附近的组蛋白泛素化是促进NHEJ而非HR修复的重要事件。因此，进一步探究NHP2是否能使H2B进行泛素化修饰，采用Co-IP-WB进行实验，具体步骤如下：

（1）试剂配置：

细胞裂解液：用ddH₂O将10×cell lysis buffer稀释至1×，加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂；

中度盐浓度TBS：称取NaCl 6g，加入1L TBS溶液中；

1×loading buffer：用ddH₂O将5×loading buffer稀释至1×备用；

（2）将HCT116细胞消化、收集，加入裂解液，冰上裂解1h；

（3）4℃ 15000×g离心15min，取上清加入loading buffer（至1×），95℃水浴5min；

（4）一抗孵育：

若目的蛋白带Flag标签，取 M2 anti-flag agarose 30μL，加入提前预冷的 TBS溶液1mL，然后4℃ 5000×g离心1min，弃上清，然后加入蛋白溶液，4℃垂直摇床10-12rpm翻转过夜；

若目的蛋白不带Flag标签，则向蛋白溶液中加入目的蛋白的 IP 级抗体（1μg抗体:1mg蛋白），4℃垂直摇床10-12rpm翻转过夜。次日，每组样品中再加入 Protein G PLUS-Agarose 50μL，于4℃垂直摇床 10-12rpm 孵育3-4h；

洗珠子：将上述样品4℃ 3000×g离心5min，小心吸除上清，注意不要吸到珠子；加入中度盐浓度TBS 1mL，4℃垂直摇床中速清洗5min，然后4℃ 3000×g离心5min，小心弃上清，重复至少5次；

（5）每个样品加入1×loading buffer 40μL，95℃水浴5min；

抗体：Myc-tag：货号：2276，品牌：Cell Signal Technology。

蛋白质免疫印迹技术（Western Blot）完成步骤同上。

一抗：Ubiquitin：货号：MAB1510，品牌：Merk。H2B:货号：12799，，品牌：CellSignal Technology。

二抗：HRP-linked anti-rabbit IgG （抗兔）：货号：7074，品牌：Cell SignalTechnology；HRP-linked anti-mouse IgG （抗鼠）：货号：7076，品牌：Cell SignalTechnology。

结果如图7所示，结果显示，放射诱导下NHP2能够促使H2B单泛素化。

结合上述研究结果可以明确，NHP2降低DSBs后细胞内γH2AX水平、加快DSBs损伤修复、与组蛋白H2B相互作用进而使H2B单泛素化是NHP2发挥促进结直肠癌放疗耐受功能的关键因素。

实施例3 NHP2敲降对肿瘤细胞放疗敏感性的影响

（1）利用shRNA在HCT116、HT29、SK-Hep-1及MHCC97H细胞中构建NHP2敲降稳定细胞株；

（2）将对数生长期的细胞按1000/孔接种于6孔板；

（3）24小时后进行0-5Gy放疗干预；继续培养10～14天；

（4）弃培养基，每孔加入含0.5%结晶紫的甲醇1mL，染色30min；弃甲醇，用水清洗残留的甲醇，即可观察到细胞克隆；显微镜下观察，细胞数＞50个才计为一个有效克隆，计数各组的克隆总数。

结果如图8-15所示。结果显示，敲降NHP2能够显著提高结直肠癌细胞及肝癌细胞对放疗的敏感性，即抑制细胞内NHP2的表达能够有效提高放疗的治疗效果，抑制放疗耐受的产生。

实施例4 NHP2对荷瘤小鼠放疗敏感性研究

（1）选取5周龄雌性BALB/c-nu/nu小鼠分为两组，其中一组于皮下注射正常HCT116（NHP2-WT）细胞，另一组于皮下注射由shNHP2 慢病毒构建的NHP2稳定敲降HCT116（NHP2-KO）细胞；

（2）待成瘤后，将NHP2-WT组小鼠随机分为两组，每组10只，分别为组1和组2；NHP2-KO组小鼠同样随机分为两组，每组10只，分别为组3和组4；

（3）对组1和组3小鼠不作任何治疗处理，对组2和组4小鼠采用瘤区辐照方式（RS2000 X线辐射仪，源皮距以100cm为标准，采用中长程日均等剂量放射；非瘤区采用小鼠专用铅制配套容器遮挡）进行治疗，10Gy/天，连续治疗七天；治疗期间定期测量肿瘤体积，治疗后5周处死小鼠，剥离肿瘤，承重计算抑瘤率。

结果如图16-17所示。结果显示，对于未经放射治疗的小鼠，NHP2敲降型荷瘤小鼠肿瘤生长速度、肿瘤体积或是肿瘤重量相对于NHP2野生型荷瘤小鼠并没有明显差别，二者差异无统计学意义；而在经过放射治疗后，NHP2敲降型荷瘤小鼠相对于NHP2野生型荷瘤小鼠肿瘤生长速度明显更慢，肿瘤体积明显更小，抑瘤率显著提高，二者差异具有统计学意义。由上述可知，单纯地抑制结直肠癌细胞内的NHP2表达水平，并不能显著抑制肿瘤细胞的生长；然而，在进行对结肠癌细胞放射治疗时，NHP2的敲降则能够显著提高肿瘤细胞对放射治疗的敏感性，降低肿瘤细胞的生长速度和体积，明显提高了抑瘤效果，可有效防止放疗耐受的发生。

进一步地，选取新的BALB/c-nu/nu小鼠，重复上述成瘤及治疗实验，区别在于不对小鼠进行人工处死，而是观察各组小鼠生存情况。结果如图18所示，结果显示，NHP2敲降型荷瘤小鼠总体生存情况相对于NHP2野生型荷瘤小鼠并没有明显差别，二者差异无统计学意义。而在经过放射治疗后，NHP2敲降型荷瘤小鼠相对于NHP2野生型荷瘤小鼠总体生存时间显著延长，二者差异具有统计学意义。由上述可知，单纯地抑制结直肠癌细胞内的NHP2表达水平，并不能有效提高荷瘤小鼠生存率；然而，在进行对结肠癌细胞放射治疗时，NHP2的敲降则能够显著提高肿瘤细胞对放射治疗的敏感性，增加治疗效果，延长小鼠的整体生存率，可有效防止放疗耐受的发生。

实施例5 NHP2对直肠癌患者生存情况研究

（1）选取中山大学附属第一医院局部进展期直肠癌（LARC）治疗前活检样本118例；对于每个入选病例，患者入选要求为确诊直肠腺癌；距离肛门10cm下肿瘤；术前分期肿瘤浸润突破肠壁肌层（T3），或与直肠肠壁全层（T4a），或经直肠腔内超声显示肠周淋巴结受累（N1-2）；既往未接受过放化疗，未接受直肠手术；无肿瘤出血、急慢性感染及肠梗阻等合并症状。对于所有纳入研究的病例，其临床病理资料均来自于中山大学肿瘤防治中心病案报告，相应的随访资料来自于中心随访科。患者的肿瘤分级均按照UICC/AJCC（第八版）的标准分级。手术病人在术后两年内每三个月随访一次，术后三到四年内每半年随访一次，术后五年及以后每一年随访一次，随访记录患者复发/转移/死亡情况并记录日期；

（2）将活检新鲜组织包埋于石蜡封存，石蜡标本室温保存，切取的白片保存于4℃冰箱。实验时取出145例石蜡切片白片，经过二甲苯脱蜡、梯度酒精水化、0.3% H₂O₂溶液去除组织中过氧化物酶、枸橼酸盐溶液微波修复、Invitrogen公司anti-NHP2抗体（1：200）和相应种属二抗孵育、DAB与苏木素显色、盐酸酒精分化、梯度酒精脱水，二甲苯通透两次后，中性树胶封片；

（3）组织标本的染色评估由100-200×倒置显微镜拍照，整个组织面取5-10个视野/病例。评分方式：把染色的深浅分为阴性、弱阳性、阳性和强阳性，分别标记为0、1、2、3分。在显微镜下观察组织切片，评定各部分肿瘤组织所占的比例及各自的染色评分，然后进行加权，得到评分结果；

（4）所有患者术前采用新辅助放化疗方案进行治疗，具体如下：常规长疗程放疗（2Gy/次/天×5次/周，5周，总剂量为50Gy）+同期化疗；化疗方案均为以氟尿嘧啶为基础的方案：（A）氟尿嘧啶单药（卡培他滨 825mg/m²/天，随放疗1-5天口服，每周重复；或5-FU400mg/m²静脉输注）；（B）氟尿嘧啶+奥沙利铂：XELOX（奥沙利铂100mg/m²，第1天静脉滴注；第1-14天卡培他滨850mg/m²/天，一天两次口服；每3周重复1次）或者FOLFOX方案（奥沙利铂100mg/m², 第1天静脉滴注；亚叶酸钙400mg/m²，第1天静脉滴注；5-氟尿嘧啶400mg/m²，第1天静脉推注；5-氟尿嘧啶2400mg/m²，持续48 h泵注；每2周重复1次）；

（5）根据118例LARC病例的总生存期数据，利用ROC曲线最高特异性和最强灵敏度的点来确定NHP2的表达临界值（H-score＝5），将NHP2分为高表达和低表达两个等级，然后使用SPSS 20.0软件中的Kaplan-Meier方法对病人预后进行分析。

其中高水平表达是指H-Score评分≥5；H-Score指免疫组化染色强度×阳性比率。

结果如图19所示，结果显示，肿瘤组织中低表达NHP2（H-score＜5）的患者其总生存率显著长于肿瘤组织中高表达NHP2（H-score≥5）的患者，进一步表明NHP2高表达水平与结直肠癌放疗效果存在明显相关性，并且与不良预后正相关，阐明了NHP2是结直肠癌新辅助放疗的耐受因素，能够指示患者对放疗的敏感程度。

由上述可以明确，NHP2是一个与结直肠癌、肝癌等放疗耐受极为相关的基因，NHP2较高的表达水平与肿瘤退缩不良存在明显的正相关性，可以用以预测结直肠癌、肝癌等放疗耐受以及敏感程度，为患者接受术前治疗的联系提供提前评估。同时，本发明通过揭示NHP2基因与结直肠癌、肝癌等放疗耐受的关联性，其对于解决个体间临床疗效差异与退缩效果/预后评估空白的难题，更好地实现精准治疗具有重要的现实意义。为人类攻克NHP2提供了一个新的药物治疗靶点，从而为后续的药物研发、临床治疗等提供了一个新的方向，具有极高的社会价值和市场应用前景。

以上具体实施方式部分对本发明所涉及的分析方法进行了具体的介绍。应当注意的是，上述介绍仅是为了帮助本领域技术人员更好地理解本发明的方法及思路，而不是对相关内容的限制。在不脱离本发明原理的情况下，本领域技术人员还可以对本发明进行适当的调整或修改，上述调整和修改也应当属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 中山大学附属第一医院

中山大学肿瘤防治中心(中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所)

<120> NHP2在预测癌症放疗敏感性和预后中的应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccccacctgt gtgataatgg t 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcactcatcg taagcctcct 20

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taaaggcaga tcccgac 17

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tagagcttcc gcgtga 16

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gagcgcacct accagga 17

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cagtgtgtct cctgccaa 18

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cagtcatgtg tgaggaccga 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acctcctcca ggcactcatc 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cccacctgtg tgataatggt c 21

<210> 10

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcagggactg cacct 15

<210> 11

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccgggtcatg tgtgaggacc gaaatctcga gatttcggtc ctcacacatg actttttg 58

<210> 12

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccggcccatt gaggtatact gccatctcga gatggcagta tacctcaatg ggtttttg 58

Claims

1.一种用于检测癌症放疗敏感性和/或疗效的试剂盒，其特征在于，包括检测NHP2基因表达水平的引物和/或检测NHP2蛋白含量的试剂；以及PCR酶、PCR缓冲液、dNTPs、荧光底物中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述检测NHP2基因表达水平的引物选自下列引物对中的至少一对：

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述癌症选自结直肠癌、肝癌中的一种或多种。

4.检测NHP2表达水平的试剂在制备用于检测癌症放疗敏感性和/或疗效预测的组合物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述检测NHP2表达水平的试剂包括检测NHP2基因表达水平的引物和/或检测NHP2蛋白含量的试剂。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述检测NHP2基因表达水平的引物选自下列引物对中的至少一对：

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述癌症选自结直肠癌、肝癌中的一种或多种。

8.NHP2抑制剂在制备提高癌症放疗敏感性的产品中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述NHP2抑制剂选自基于NHP2设计的shRNA。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述癌症选自结直肠癌、肝癌中的一种或多种。