CN114668846B - 去泛素化酶usp45在制备治疗食管癌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了去泛素化酶USP45在制备治疗食管癌药物中的应用,属于生物医药技术领域。本发明发现USP45在食管癌组织中的mRNA表达水平上调,并且与食管癌患者的总生存期存在联系,USP45在食管癌组织中的蛋白表达水平增高;USP45敲降能够显著抑制食管癌细胞的增殖。本发明提供了以USP45作为食管癌分子诊断标志物或预后预测标记物,以及以USP45作为靶点在制备治疗食管癌药物中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,具体涉及去泛素化酶USP45作为食管癌细胞增殖调控分子及USP45作为靶点在制备治疗食管癌药物中的应用。
背景技术
根据全球肿瘤流行病学调查,食管癌是世界上常见的肿瘤之一,在中国,尽管随着食管癌诊疗措施的不断进步,但是食管癌患者的预后仍然较差,5年生存率从10%到25%不等。因此,深入探讨食管癌的发病机制,寻找食管癌潜在的治疗靶点是刻不容缓的研究课题。
USP45是去泛素化酶USPs(泛素特异性蛋白酶)家族的成员之一。泛素化控制了大多数细胞内蛋白的稳定性,泛素化失控能够导致多种疾病。去泛素化酶在泛素化途径中扮演重要的角色,通过裂解切断泛素链与底物蛋白之间的连接及泛素化链之间的连接,使泛素分子从蛋白质底物中脱离出来。抑制去泛素化酶能够导致蛋白选择性降解,并可能影响其他“无成药性”靶点。因此,USPs可能是有潜力的药物靶点,目前已经有多个USPs抑制剂被开发,并且展现出良好的治疗效果。但是,目前尚无研究揭示USP45在肿瘤发生发展中的作用机制。
发明内容
本发明的目的是为克服现有技术的不足,提供去泛素化酶USP45在制备治疗食管癌药物中的应用,即将USP45作为食管癌细胞增殖的调控分子和将USP45作为靶点,应用在食管癌治疗药物中。本发明还提供了去泛素化酶USP45在制备食管癌诊断试剂或预后预测试剂中的应用。
为实现上述目的,本发明采用下述技术方案:
去泛素化酶USP45在制备治疗食管癌药物中的应用。
所述的治疗食管癌药物包括USP45敲降的基因治疗药物或USP45的抑制剂。其中,USP45 敲除的基因治疗药物包括靶向USP45 mRNA的敲降质粒、siRNA等,USP45的抑制剂包括靶向抑制USP45表达水平或活性的化学药物、多肽药物和蛋白质药物。
去泛素化酶USP45作为食管癌分子诊断标志物或食管癌预后预测标记物的应用。
去泛素化酶USP45在制备食管癌诊断试剂或食管癌预后预测试剂中的应用,所述的食管癌诊断试剂或食管癌预后预测试剂为检测去泛素化酶USP45的mRNA或蛋白表达水平的试剂,通过检测食管组织中的mRNA或蛋白表达水平,以辅助诊断食管癌或进行预后预测。进一步地,所述的食管癌诊断试剂或食管癌预后预测试剂为检测去泛素化酶USP45的mRNA或蛋白表达水平的引物、探针或抗体等。
去泛素化酶USP45作为食管癌进展调控分子的应用。USP45作为去泛素化酶,可以通过调控其靶蛋白的稳定性来影响食管癌的进展,特别是对于某些不可成药的靶蛋白,通过USP45 可以调控这些靶蛋白的表达水平,进而影响食管癌的进展。
本发明通过生物信息学分析发现相对于正常组织,USP45在食管癌组织中的mRNA表达水平上调,并且与食管癌患者的总生存期存在联系。另外,通过食管癌组织芯片的免疫组化进一步确认USP45在食管癌组织中的蛋白表达水平增高,并通过体外和体内实验揭示USP45 可以作为一种新的食管癌细胞增殖相关的调控因子,不仅为食管癌的发病机制提供新的理论依据。更重要的是,可以为食管癌药物研制提供新的途径。因此,去泛素化酶USP45可以用来作为食管癌诊断的生物标志物,同时USP45还可以作为新的食管癌治疗靶点。
附图说明
图1为用于构建USP45过表达质粒的慢病毒表达载体pReceiver-Lv120质粒图谱。
图2为用于构建USP45敲降质粒的shRNA慢病毒表达载体psi-LVRU6GP质粒图谱。
图3为通过生物信息学分析USP45在正常组织和食管癌组织中的mRNA表达水平。
图4为通过生物信息学分析USP45的mRNA表达水平与食管癌患者总生存期的相关性。
图5为利用食管癌组织芯片的免疫组化检测食管癌和癌旁组织中USP45的蛋白表达水平。
图6为通过western blot检测USP45过表达或敲降组,及其对照组中的USP45蛋白表达水平。其中,图A为USP45过表达组及其对照组中USP45蛋白的表达水平;图B为USP45 敲降组及其对照组中USP45的表达水平。
图7为通过克隆形成实验观察USP45过表达对食管癌细胞KYSE140和KYSE410增殖能力的影响。
图8为通过克隆形成实验观察USP45敲降对食管癌细胞KYSE140和KYSE410增殖能力的影响。
图9为通过裸鼠皮下成瘤实验观察USP45敲降对食管癌细胞KYSE410增殖能力的影响。其中,图A为分别在第0、5、10、15、20、25天测量对照组和USP45敲降组肿瘤的体积并绘制肿瘤生长曲线;图B为对照组和USP45敲降组小鼠皮下肿瘤;图C为对照组和USP45 敲降组肿瘤体积的统计结果;图D为对照组和USP45敲降组肿瘤重量的统计结果。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所述说明是对本发明内容的解释,而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
下面给出支持本发明所保护内容的依据。
一、实验手段及实验操作
1、生物信息学分析
通过UCSC Xena(https://xena.ucsc.edu/)从TCGA数据库下载了食管癌的标准化RNA-Seq数据。从GTEx数据库(https://commonfund.nih.gov/GTEx)下载人类正常组织的RNA-Seq数据。我们根据正常实体组织、原发性实体瘤、原发性肿瘤和正常组织的过滤原则,进一步提取了每个样本中ENSG00000123552(USP45)基因的表达数据。然后,对每个表达值进行log2(x+1)变换。最后,我们采用Wilcoxon秩和检验和符号秩检验比较两组之间的表达水平,使用R软件的ggplot2包将分析结果可视化。
通过在线数据库和生存分析工具Kaplan-Meier Plotter (http://kmplot.com/analysis/index.php?p=service&cancer=pancancer_rnaseq)分析USP45在TCGA 数据库中与食管癌患者预后的相关性。为了评估食管癌患者的总生存期,将食管癌患者样本按照最佳截断值自动分为USP45高表达组和低表达组,并使用Kaplan-Meier分析和Log rank-P检验。
2、免疫组化分析
(1)烤片。将组织芯片置于60℃烤箱中烤片60min。
(2)脱蜡。烤箱中取出组织芯片,分别置于二甲苯I、II中各15min——100%乙醇I、II 各10min——95%乙醇I、II各10min——80%乙醇10min——70%乙醇10min。
(3)取出组织芯片,用PBS(pH 7.2-7.6)冲洗2次,5min/次。
(4)抗原修复-蒸汽修复法。将组织芯片放于0.01M枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)中,放入蒸锅,使组织芯片在缓冲液中95℃保持20min,取出组织芯片,自然冷却至室温。(组织芯片需仍置于缓冲液中,随缓冲液冷却)。
(5)待冷却至室温后,取出组织芯片,用PBS(pH 7.2-7.6)漂洗2次,5min/次。
(6)灭活内源性过氧化物酶。组织芯片置于保湿盒中,滴加约50微升的3%过氧化氢溶液于组织芯片,室温放置5-10min,若室温较低,可延长时间至20-30min。
(7)组织芯片置于PBS(pH 7.2-7.6)中漂洗3次,5min/次。
(8)抗原封闭。除去组织芯片上的PBS(pH 7.2-7.6),用免疫组化笔在组织周围画一圆圈,滴加山羊血清约50微升于组织上,以浸没组织为益。保湿盒置于37℃恒温箱中15min。
(9)添加一抗anti-USP45。甩去组织芯片上的山羊血清,以1:200稀释一抗,每个组织芯片滴加约50微升稀释后的一抗。组织芯片放于保湿盒中置于4℃环境下孵育过夜。
(10)取出组织芯片,用PBS(pH 7.2-7.6)冲洗3次,2min/次。
(11)添加二抗,生物素标记的山羊抗兔IgG(Beyotime,Jiangsu)每个组织芯片滴加约 50微升。将组织芯片放于保湿盒中置于37℃恒温箱中20min。
(12)PBS(pH 7.2-7.6)漂洗3次,2min/次。
(13)添加链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶约50微升于组织上。保湿盒中37℃放置 20min。
(14)用PBS(pH 7.2-7.6)清洗漂洗4次,5min/次。
(15)DAB显色。配制DAB底物溶液,滴加至组织芯片上,镜下控制反应时间。
(16)用蒸馏水漂洗3次,5min/次。
(17)苏木素复染(染细胞核)。将组织芯片置于苏木素溶液中约30s,蒸馏水漂洗。
(18)分化(去除多余的及细胞质中的苏木素)。配制盐酸酒精溶液(37%浓盐酸:7%乙醇=1:99),将组织芯片放入盐酸酒精溶液后迅速取出,动作需快。蒸馏水漂洗。
(19)脱水。分别置于70%乙醇10min——80%乙醇10min——95%乙醇Ⅰ、Ⅱ各10min——100%乙醇Ⅰ、Ⅱ各10min——二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各15min。
(20)封片。滴加一滴中性树脂,放置盖玻片。
(21)镜下观察。
3、利用慢病毒感染构建USP45敲降和过表达的稳定细胞系
将USP45的开放阅读框序列克隆至慢病毒表达载体pReceiver-Lv120(GeneCopoeia公司,载体图谱如图1所示)构建USP45过表达质粒,该质粒委托郑州乐睿生物科技有限公司构建获得。靶向USP45 mRNA中的5’-CCAACATGTAAGTCATGCTAT-3’序列,通过化学合成5’ -GATCCGCCAACATGTAAGTCATGCTATTCAAGAGATAGCATGACTTACATGTTGGTTTTTTGGAATT-3’和5’-AATTCCAAAAAACCAACATGTAAGTCATGCTATCTCTTGAATAGCATGACTTACATGTTGGCGGATC-3’两段序列,然后将这两段序列混合后退火形成双链DNA结构,再利用BamHI和EcoRI酶切shRNA慢病毒表达载体psi-LVRU6GP(购买自GeneCopoeia公司,载体图谱如图2所示),最后将酶切后的psi-LVRU6GP空载体与双链DNA结构,以及T4 DNA连接酶混合,构建得到USP45敲降质粒。构建的USP45敲降质粒可通过正向测序引物5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'和反向测序引物5'-CTGGAATAGCTCAGAGGC-3'进行测序验证。另外,pReceiver-Lv120和psi-LVRU6GP空载体分别作为USP45过表达和敲降质粒的阴性对照。利用GeneCopoeia公司的Lenti-PacTM HIV表达包装系统分别将USP45过表达和敲降质粒及其阴性对照质粒转染至Lenti-PacTM 293Ta包装细胞系中,轻轻混匀放置于恒温培养箱中48小时,收集上清液,然后利用GeneCopoeia公司的Lenti-PacTM慢病毒浓缩试剂收集慢病毒颗粒,并利用GeneCopoeia公司的Lenti-PacTM HIV qRT-PCR慢病毒滴度检测试剂盒检测病毒滴度。将收集到的慢病毒感染食管癌细胞KYSE140和KYSE410,挑取单克隆细胞在完全培养基中加入嘌呤霉素进行筛选并扩大培养,最后通过western blot检测确认US P45敲降和过表达及其阴性对照稳定细胞系构建成功。
4、Western blot实验
制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶,将配好的蛋白样品加入上样孔中。通过电泳、转膜将蛋白质结合到PVDF膜上,用5%牛奶封闭膜上的非特异性位点后,用5%的牛血清白蛋白按比例稀释GAPDH一抗(Affinity Biosciences公司,稀释比例1:5000),USP45一抗(AffinityBiosciences 公司,稀释比例1:1000),摇床孵育过夜。次日,回收抗体,用1×TBST洗去多余抗体,常温孵育二抗,两小时后洗膜三次。在膜上加入ECL发光液后显影,并分析结果。
5、克隆形成实验
将USP45敲降和过表达KYSE140和KYSE410稳定细胞系及其对照组细胞分别以每孔100个细胞的密度接种到六孔板中,然后分别在1、3、5、8天时观察固定视野的细胞克隆形成情况,每组选取3个视野,通过比较细胞克隆大小观察USP45敲降和过表达对食管癌细胞增殖能力的影响。
6、裸鼠皮下成瘤实验
分别将2×106个阴性对照和USP45敲降的KYSE410稳定细胞系悬浮于100微升的PBS 溶液中,种植于各组小鼠右侧背部皮下。实时观察并记录每组小鼠背部皮下肿瘤的生长情况 (大小,性状,质地等),按照时间和肿瘤体积绘制肿瘤生长曲线。待背部肿瘤生长至适当大小时,将各组小鼠处死,观察并记录皮下肿瘤的外观形态、体积、重量。
所有动物实验均由南阳理工学院伦理委员会批准。
二、实验结果
1、USP45在食管癌组织中的表达水平上调,与患者预后存在联系
为了探讨USP45在食管癌发生发展过程中所扮演的角色,我们分析了USP45在正常食管组织和食管癌组织中的表达水平。如图3所示,通过生物信息学分析,我们发现在TCGA和GTEx数据库中,相对于1456例正常组织,USP45在162例食管癌组织中的mRNA表达水平显著上调(p<0.001)。另外,我们通过生物信息学分析了USP45的mRNA表达水平与食管癌患者预后的相关性,结果如图4所示,在食管癌中,分析结果显示USP45的mRNA 表达水平越低,在整体水平上患者的总生存期相对越长。为了进一步验证食管癌发生发展过程中USP45表达水平的变化,我们在包含36例食管癌组织及其配对癌旁组织的组织芯片中,通过免疫组化染色检测USP45的蛋白表达水平。如图5所示,相对于癌旁组织,USP45蛋白在23例食管癌组织中的表达水平显著增高。这个结果与生物信息学分析结果(图3)相一致,表明在食管癌发生发展过程中USP45表达水平上调,因此泛素化酶USP45可以用来作为食管癌分子诊断以及预后预测标志物。
2、体外实验显示USP45能够调控食管癌细胞的增殖能力
通过生物信息学分析和免疫组化实验,我们已经证明了USP45在食管癌发生发展过程中表达水平上调。为了进一步探讨USP45在食管癌发生发展过程中的作用机制,我们通过慢病毒感染构建了USP45过表达和敲降的KYSE140和KYSE410稳定细胞系,并通过westernblot 检测了过表达和敲降组及其对照组的USP45蛋白表达水平,以证明稳定细胞系被成功构建,结果如图6所示。然后通过克隆形成实验检测USP45过表达和敲降对食管癌细胞增殖能力的影响,结果如图7所示,USP45过表达能够显著促进KYSE140和KYSE410细胞的增殖能力。如图8所示,USP45敲降能够显著抑制KYSE140和KYSE410细胞的增殖能力。
3、体内实验表明USP45敲降能够抑制食管癌细胞的生长
为了进一步验证USP45对食管癌细胞增殖能力的调控作用,我们构建了裸鼠荷瘤模型来观察USP45敲降对食管癌细胞增殖能力的影响。结果如图9A所示,肿瘤生长曲线表明USP45 敲降能够显著抑制肿瘤生长速度。如图9B-D所示,相对于对照组,USP45敲降组的肿瘤体积和重量显著下降。
基于上述检测结果,本发明提出以下应用:
去泛素化酶USP45在食管癌发生发展过程中,对食管肿瘤的生长有着非常重要的调控作用,该分子可作为食管癌的诊断和预后预测标志物分子。
去泛素化酶USP45为食管癌提供了新的发病机制理论依据和治疗靶点。
去泛素化酶USP45作为靶分子在制备治疗食管癌药物中的应用,进一步的,所述治疗食管癌药物包括USP45敲除的基因治疗药物或者USP45的抑制剂。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明,但本发明创造并不限于所述实施例,熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换,这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
序列表
<110> 南阳理工学院
<120> 去泛素化酶USP45在制备治疗食管癌药物中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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1. 靶向USP45 mRNA的敲降质粒在制备治疗食管癌药物中的应用。
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