CN112791182A - 二甲双胍和抗pd-1抗体药物组合物在制备肝癌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了二甲双胍和抗PD‑1抗体药物组合物在制备肝癌药物中的应用，本发明通过对肝癌患者组织样本进行免疫组化染色，检测并分析肝癌巢组织中PSPH标志物蛋白分子在肝癌组织中的表达水平，指导PSPH阳性病人联合二甲双胍与抗PD‑1抗体用药，提高治疗效果目的。PSPH高表达患者联合二甲双胍与抗PD‑1抗体用药，其治疗效果远远好于单独使用其中一种的治疗效果，实现精准治疗，以达到良好的治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体地，涉及二甲双胍和抗PD-1抗体药物组合物在 制备肝癌药物中的应用。
背景技术
原发性肝癌是世界第六大癌症，其死亡率位于各类恶性肿瘤死亡率的第三位。中国是 肝癌高发区，乙型肝炎病毒感染是我国肝癌高发的主要因素，严重危害人类的生命健康。 目前，临床上对于肝癌的治疗手段多为根治性切除，对于不可以进行手术切除的患者，多 采用临床上常用的靶向药物治疗，但是治疗效果不甚理想。与此同时，在肿瘤的发生发展 过程中，免疫系统对肿瘤的发生发展也起着重要的作用，然而以免疫系统为靶点的治疗方 法及其效果也有待进一步提高。
目前，临床上对于肝癌的靶向药物治疗响应率较低，深究其原因是没有对症下药。肝 癌的发生与发展是及其复杂的一个过程，同时肝癌病人癌巢的异质性也很强，因此，不同 病人实施不同的靶向药物治疗方案及其重要。而为了判定不同的病人需要哪种用药方案， 最有效的方法就是依赖于肿瘤标志物的筛查。而现阶段在实际诊疗中应用的肿瘤标记物也 比较匮乏，例如甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)、 血小板衍生生长因子受体(PDGFR)，准确性与实用性不能同时满足，不利于临床的推广 与应用。因此，发现新的准确有效的肿瘤标志物用来对病人做一个区分，指导临床精准运 用靶向药物，增强肝癌靶向药物的治疗效果，提高病人对药物的响应率迫在眉睫。
与此同时，近年来越来越多学者关注肿瘤细胞代谢重塑对肿瘤发生发展的影响，大量 文献报道，肿瘤细胞除了上调糖酵解代谢通路之外，丝氨酸的从头合成以及下游的一碳代 谢途径在肿瘤细胞中得到显著地上调，丝氨酸的从头合成以及下游的一碳代谢途径可以为 肿瘤细胞提供快速增殖的核酸底物，可以维持细胞的氧化还原稳态以及行使表观遗传调控 的功能，共同促进肿瘤的进展。
结合肿瘤代谢与肿瘤的发生发展，发现新的代谢相关肿瘤标志物，指导病人靶向联合 用药，提高肝癌的治疗效果，实施精准治疗势在必行。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种二甲双胍和抗PD-1抗体药 物组合物在制备肝癌药物中的应用，通过对肝癌患者组织样本进行免疫组化染色，根据肝 癌中PSPH的表达强度分为PSPH阳性和PSPH阴性两组，PSPH阳性患者联合二甲双胍 与抗PD-1抗体用药，阴性则单独使用抗PD-1抗体用药。
本发明的第一个目的是提供一种药物组合物。
本发明的第二个目的是提供所述的药物组合物在制备治疗肝癌的药物中的应用。
本发明的第三个目的是提供PSPH蛋白的检测试剂在制备评估使用所述的药物组合物 和/或中所述的治疗肝癌的药物的试剂盒中的应用。
本发明的第四个目的是提供PSPH蛋白和/或PSPH基因作为肝癌的治疗药物筛选的靶 点的应用。
本发明的第五个目的是提供PSPH蛋白的抑制剂和/或PSPH基因的抑制剂在制备治疗 肝癌的药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
本发明通过对肝癌患者组织样本进行免疫组化染色，发现在肝癌病人的癌巢组织， PSPH(磷酸丝氨酸磷酸酶)上调表达，进一步发现以的高表达Hepa1-6细胞株和敲除PSPH 的Hepa1-6细胞株，建立了小鼠皮下PSPH阳性以及阴性肿瘤模型，PSPH阳性肿瘤模型联合二甲双胍和抗PD-1抗体可以显著提高抗PD-1抗体的疗效，而PSPH阴性性肿瘤模型 则可以单独使用抗PD-1抗体进行治疗。
因此本发明要求保护一种药物组合物，含有二甲双胍和抗PD-1抗体。
本发明要好球保护所述的药物组合物在制备治疗肝癌的药物中的应用。
优选地，所述肝癌的癌巢组织PSPH蛋白阳性。
优选地，所述肝癌的癌巢组织PSPH蛋白阳性为利用免疫组化方法检测癌巢组织中的 PSPH蛋白，PSPH表达强度大于4*106/mm2为PSPH蛋白阳性。
PSPH蛋白的检测试剂在制备评估使用所述的药物组合物和/或所述的治疗肝癌的药 物的试剂盒中的应用，也属于本发明的保护范围。
优选地，所述试剂盒为免疫检测试剂盒。
优选地，肝癌的癌巢组织PSPH蛋白阳性，使用所述的药物组合物和/或所述的治疗肝 癌的药物进行治疗。
本发明还要求保护PSPH蛋白和/或PSPH基因作为肝癌的治疗药物筛选的靶点的应用。
本发明还要求保护PSPH蛋白的抑制剂和/或PSPH基因的抑制剂在制备治疗肝癌的药 物中的应用。
优选地，所述抑制剂为二甲双胍。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过对肝癌患者组织样本进行免疫组化染色，检测并分析肝癌巢组织中PSPH 标志物蛋白分子在肝癌组织中的表达水平，指导PSPH阳性病人联合二甲双胍与抗PD-1 抗体用药，提高治疗效果目的。PSPH阳性患者联合二甲双胍与抗PD-1抗体用药。其治 疗效果远远好于单独使用其中一种的治疗效果，能够实现精准治疗，以达到良好的治疗效果。
附图说明
图1为肝癌患者中PSPH的表达。
图2为PSPH阴性肿瘤响应抗PD-1抗体治疗。
图3为二甲双胍可以抑制PSPH蛋白的表达。
图4为PSPH阳性肿瘤响应二甲双胍与抗PD-1抗体联合用药治疗。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用 于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说 明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂 和材料。
本实验所用的小鼠品系为C57B/L6小鼠，购自广东省医学实验动物中心(广州，中国)； 均保种于中山大学肿瘤防治中心的实验动物中心，该实验室动物中心符合无特定病原体 (Specific pathogen free，SPF)级环境。所有动物的饲养、繁育及保种，以及动物实验均 严格按照国家相关规定和指南加以执行，并得到了中山大学肿瘤防治中心的实验动物管理 委员会(IACUC)的批准。
实施例1一种肝癌组织中PSPH蛋白分子的检测方法
1、样本检测
(1)选取包含肿瘤区域的肝癌石蜡切片，并确保无大片坏死；
(2)获取4μm的石蜡切片，在60℃烤片2小时，取出，略冷；
(3)室温下用二甲苯脱蜡2次，每次10分钟；
(4)在100％乙醇中洗去二甲苯，再依次经过95％酒精、80％酒精、70％酒精，每次5分钟；
(5)双蒸水中洗5分钟；
(6)用0.3％H2O2封闭内源性过氧化物酶活性，室温10分钟；
(7)双蒸水中洗4次，每次5分钟；
(8)抗原修复：10mM柠檬酸钠缓冲液(pH6.0)，微波高火5分钟，中低火25分 钟；
(9)室温自然冷却30分钟；
(10)PBS缓冲液中洗4次，每次3分钟；
(11)将第一抗体PSPH(购自Proteintech公司，货号为14513-1-AP)滴加在组织切片上，4℃孵育16小时；
(12)PBS缓冲液冼4次，每次5分钟；
(13)滴加带辣根过氧化物酶标记的第二抗体，37℃孵育30分钟；
(14)PBS洗4次，每次5分钟；
(15)双蒸水中洗3次，每次5分钟；
(16)滴加苏木素细胞核染料，染色3分钟；
(17)双蒸水中洗3次，每次5分钟；
(18)风干后，中性树脂封片剂封片。
2、图像分析
(1)利用徕卡全自动组织扫片机进行组织片拍摄；
(2)采用徕卡分析软件分析PSPH单位面积(mm2)的表达强度；
(3)最终结果为癌巢PSPH的单位面积表达强度，表达强度小于4*106/mm2为PSPH 阴性，大于则为PSPH阳性。
实施例2大部分肝癌患者癌巢中上调表达PSPH
一、实验方法
用实施例1的方法检测新鲜肝癌病人癌巢组织石蜡切片中PSPH的表达情况。
二、实验结果
结果如图1所示，结果显示大部分肝癌患者癌巢中上调表达PSPH(磷酸丝氨酸磷酸酶)。
实施例3小鼠体内实验发现PSPH阳性组对抗PD-1抗体治疗不响应
一、实验方法
1、小鼠肝癌皮下成瘤模型建立方法如下：
通过慢病毒转染体系，敲除了Hepa1-6细胞中PSPH的表达，获得稳定低表达PSPH的Hepa1-6细胞株。其中使用了pLKO.1-TCR Cloning Vector质粒载体，通过Age1和EcoR1分别对载体的sh片段填充区域和shPSPH序列进行双酶切处理，再进行shPSPH和载体的 连接，构建完整敲除质粒，使其可以稳定对Hepa1-6细胞系进行PSPH蛋白的敲除，shPSPH 的具体序列为 PSPH-shF-CCGGAGGCTGAAGTTCTACTTTAATCTCGAGATTAAAGTAGAACTTCAGCCTTTTTTG-(核苷酸序列如SEQ OD NO:1所示)， PSPH-shR-AATTCAAAAAAGGCTGAAGTTCTACTTTAATCTCGAGATTAAAGTAGAACT TCAGCCT-(核苷酸序列如SEQ OD NO:2所示)。
由于Heap1-6本来就是高表达PSPH的细胞株，在此作为高表达PSPH的细胞株。
皮下注射高表达PSPH的Hepa1-6小鼠肝细胞癌细胞株，以及敲除PSPH的Hepa1-6细胞株，建立了小鼠皮下PSPH阳性以及阴性肿瘤模型，对成瘤小鼠进行抗PD-1抗体治 疗，通过测量动物皮下肿瘤的大小与肿瘤质量，以反映治疗效果。
(1)用于建立皮下肿瘤的细胞株为Hepa1-6，培养于DMEM培养基+10％胎牛血清(均购自Thermo Fisher Scientific公司)，37℃，5％CO2的体系中，培养至第3代，收取 细胞，用于成瘤；
(2)将5×105Hepa1-6细胞混入50％基质胶(购自Trevigen，货号：3432-001-01)中，制备成细胞悬液，再将该细胞悬液移植入C57B/L6小鼠的右侧大腿皮下；
(3)在荷瘤后的第6天时，对小鼠进行分组，并在第9天进行给药治疗，实验分组 及给药方法如表1。
表1C57B/L6皮下成瘤小鼠抗肿瘤治疗实验分组：
| 实验组名称 | 给予药物 | 给药方式和剂量 |
| PSPH阳性 | 抗PD-1抗体 | 腹腔注射αPD-1，25μg/只/3天，共4次 |
| PSPH阴性 | 抗PD-1抗体 | 腹腔注射αPD-1，25μg/只/3天，共4次 |
(4)从第3天开始，每隔3天对小鼠的肿瘤大小进行检测；
(5)在最后一次测量肿瘤大小后，给予小鼠安乐死，并运用实施例1的方法检测检测癌巢组织PSPH的表达，测量皮下肿瘤质量，通过公式计算肿瘤体积，计算公式如下：
肿瘤体积(mm3)＝0.5×长度(mm)×宽度2(mm2)
二、实验结果
结果如图2所示，用敲除PSPH的Hepa1-6细胞株建立成瘤模型的小鼠，PSPH蛋白 呈阴性，其响应抗PD-1抗体的治疗，而用高表达PSPH的Hepa1-6小鼠肝细胞癌细胞株 建立成瘤模型的小鼠，PSPH蛋白呈阳性，其不响应抗PD-1抗体的治疗。
实施例4指导PSPH阳性病人联合二甲双胍与抗PD-1抗体用药对肝癌的治疗
一、实验方法
通过皮下注射高表达PSPH的Hepa1-6小鼠肝细胞癌细胞株，建立了小鼠皮下PSPH阳性肿瘤模型，通过腹腔注射二甲双胍与抗PD-1抗体进行联合治疗，通过测量动物皮下 肿瘤的大小与质量，以反映治疗效果。
小鼠肝癌皮下成瘤模型建立方法如下：
(1)本实验用于建立皮下肿瘤的细胞株为Hepa1-6，培养于DMEM培养基+10％胎 牛血清(均购自Thermo Fisher Scientific公司)，37℃，5％CO2的体系中，培养至第3代， 收取细胞，用于成瘤；
(2)将5×105Hepa1-6细胞混入50％基质胶(购自Trevigen，货号：3432-001-01)中，制备成细胞悬液，再将该细胞悬液移植入C57B/L6小鼠的右侧大腿皮下；
(3)在荷瘤后的第6天时，对小鼠进行分组，并进行给药治疗，实验分组及给药方法如表2；
表2C57B/L6皮下成瘤小鼠抗肿瘤治疗实验分组：
(4)从第3天开始，每隔3天对小鼠的肿瘤大小进行检测；
(5)在最后一次测量肿瘤大小后，给予小鼠安乐死，并运用实施例1的方法检测检测癌巢组织PSPH的表达，测量皮下肿瘤质量，通过公式计算肿瘤体积，计算公式如下：
肿瘤体积(mm3)＝0.5×长度(mm)×宽度2(mm2)。
二、实验结果
结果显示，给药前荷瘤小鼠癌巢组织PSPH均为阳性，使用二甲双胍的治疗降低了肿 瘤细胞PSPH的表达(图3)，同时联合二甲双胍与抗PD-1抗体可以显著抑制小鼠皮下 肿瘤的发生发展(图4)。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范 围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它 不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神 和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围 之内。
序列表
<110> 中山大学
<120> 二甲双胍和抗PD-1抗体药物组合物在制备肝癌药物中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccggaggctg aagttctact ttaatctcga gattaaagta gaacttcagc cttttttg 58
<210> 2
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aattcaaaaa aggctgaagt tctactttaa tctcgagatt aaagtagaac ttcagcct 58
Claims (10)
1.一种药物组合物，其特征在于，含有二甲双胍和抗PD-1抗体。
2.权利要求1所述的药物组合物在制备治疗肝癌的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肝癌的癌巢组织PSPH蛋白阳性。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肝癌的癌巢组织PSPH蛋白阳性为利用免疫组化方法检测癌巢组织中的PSPH蛋白，PSPH表达强度大于4*106/mm2为PSPH蛋白阳性。
5.PSPH蛋白的检测试剂在制备评估使用权利要求1所述的药物组合物和/或权利要求2中所述的治疗肝癌的药物的试剂盒中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为免疫检测试剂盒。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，肝癌的癌巢组织PSPH蛋白阳性，使用权利要求1所述的药物组合物和/或权利要求2中所述的治疗肝癌的药物进行治疗。
8.PSPH蛋白和/或PSPH基因作为肝癌的治疗药物筛选的靶点的应用。
9.PSPH蛋白的抑制剂和/或PSPH基因的抑制剂在制备治疗肝癌的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述抑制剂为二甲双胍。
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