CN110305962A - DKC1与HIF-1α在协同治疗结直肠癌中的应用 - Google Patents

DKC1与HIF-1α在协同治疗结直肠癌中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了DKC1与HIF‑1α在协同治疗结直肠癌中的应用。本发明实验证明HIF‑1α和VEGF表达与DKC1表达呈正相关。DKC1通过调节HIF‑1α/VEGF信号通路抑制血管生成进而抑制肿瘤迁移和侵袭，因此DKC1、HIF‑1α、VEGF均可成为治疗结直肠癌的药物靶标，同时抑制DKC1和HIF‑1α/VEGF对治疗结直肠癌可产生协同增效作用。

Description

DKC1与HIF-1α在协同治疗结直肠癌中的应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及DKC1与HIF-1α在协同治疗结直肠癌中的应用。
背景技术
结直肠癌(CRC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一。CRC的发病率在人类肿瘤中排名第三，死亡率在恶性肿瘤中排名第二。大多数CRC患者已经处于初步诊断的晚期阶段，5年生存率较低。大约25％的CRC患者在初次就医时有肝转移。数据显示，大约45％的CRC患者由于常规治疗后的耐药性和肿瘤转移而最终死于该疾病，并且患有CRC的患者的80％-90％的肝转移未能进行根治性切除。因此，寻找CRC的潜在生物标志物的研究对于早期CRC诊断和治疗是重要的。
先天性角化不良1(DKC1)基因，因其突变导致先天性角化不良症(DC)而被发现。先天性角化不良症这是一种罕见的遗传性综合征，表现为口腔粘膜白斑，指甲营养不良和非自然网状皮肤色素沉着。许多研究表明，DC的发生可以增加许多疾病的发病率，如再生障碍性贫血，骨髓衰竭综合征(BMFSs)和肺纤维化。由DKC1编码的Dyskerin是一种核仁蛋白，位于Xq28。Dyskerin是端粒酶核糖核蛋白复合物的重要组成部分，对端粒酶核糖核蛋白复合物的功能稳定性有重要影响。这种现象主要是由于DKC1参与端粒酶和端粒酶逆转录酶的产生。DC患者的端粒长度明显短于正常人。DKC1在H/ACA小核仁核糖核蛋白的加工中也起着重要作用，是正常核糖体生物合成所必需的。
当恶性肿瘤迅速增殖时形成缺氧区域。在适应缺氧微环境时，肿瘤细胞激活多种信号通路，并产生大量调节因子，促进肿瘤对缺氧的耐受性，肿瘤转移能力降低了对放疗和化疗的敏感性。缺氧诱导因子1(HIF-1)是由缺氧激活的转录因子。HIF-1由两个亚基组成，即α和β。HIF-1α亚基可以通过氧浓度调节，其表达与缺氧程度呈正相关。HIF-1α在肿瘤转移，增殖和血管生成中也起着至关重要的作用。随着恶性肿瘤继续生长，实体瘤的缺氧状态变得严重，这增加了HIF-1α的表达。HIF-1α过表达进一步诱导其下游靶基因VEGF的表达并参与肿瘤血管生成和转移。在CRC中，HIF-1α表达异常增加并在CRC的恶性进展中起重要作用。
现有技术未报道DKC1和HIF-1α在抑制肿瘤方面具有协同增效作用。
发明内容
为了填补现有技术空白，本发明提供了一种治疗结直肠癌的药物靶标，所述药物靶标包括DKC1，该药物靶标可用于开发治疗结直肠癌的药物。
进一步，所述药物靶标还包括HIF-1α或其靶基因。
在本发明的具体实施方案中，所述靶基因是VEGF。
本发明还提供了一种治疗结直肠癌的药物，所述药物包括抑制DKC1的试剂。
本发明所涉及的上述试剂包括抑制DKC1本身或其上下游分子的表达或活性的试剂。
本发明所涉及的上述试剂种类不限，只要其能抑制DKC1本身或其上下游分子的表达或活性即可，这样的试剂包括化学物质、RNAi、反义寡核苷酸和天然提取物。
进一步，所述药物包括抑制HIF-1α或其靶基因的试剂。上述试剂种类不限，只要其能抑制HIF-1α或其靶基因的表达或活性即可。
更进一步，所述药物包括抑制HIF-1α或VEGF的试剂。上述试剂种类不限，只要其能抑制HIF-1α或VEGF表达或活性即可。
除了前面提到的所述试剂作为本发明的活性成分之外，本发明的药物可以使用药学适用的和生理学可接受的辅剂制备。辅剂可以包括赋形剂、崩解剂、甜味剂、粘合剂、包衣剂、膨胀剂(expander)、润滑剂、助流剂、香味剂、增溶剂等。为了给药，除活性成分之外，本发明的药物可以优选地使用至少一种药用载体配制。当药物配制为液体溶液时，其可以含有至少一种选自以下各项的药用载体：盐水溶液、无菌水、林格溶液、缓冲盐水、可注射白蛋白溶液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇和其混合物。如果需要，可以加入其他常规添加剂，包括抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂等。此外，可以进一步加入稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂以制备可注射制剂(如水溶液、悬浮液或乳状液等)、丸剂、胶囊、颗粒剂或片剂。
本发明的药物可以以活性化合物的颗粒、粉末、包衣片剂、片剂、胶囊、栓剂、糖浆、果汁、混悬剂、乳剂、滴剂、可注射液体或缓释制剂的形式配制。本发明的药物可以根据常规方法通过静脉内、动脉内、腹内、肌肉内、胸骨内、经皮、鼻内、吸入、局部、直肠、口服、眼内或皮内途径施用。根据本发明的药物的活性成分有效量意为预防或治疗疾病所需的量。因此，有效量可以根据各种因素确定，包括疾病的类型、疾病的严重度、活性成分和组合物中含有的其他成分的类型和含量、制剂的类型、患者的年龄、重量、一般健康状况、性别和膳食、施用时间、施用途径、组合物的分泌率、治疗期和同时使用的药物。对于成人，组合物可以每天施用一次或数次。当每天施用一次或数次时，施用剂量可以是对于化合物0.1ng/kg-10g/kg，对于多肽、蛋白或抗体0.1ng/kg-10g/kg，和对于反义核苷酸、siRNA、shRNAi或miRNA0.01ng/kg-10g/kg，但本发明的范围不限于此。
本发明还提供了DKC1，和/或，HIF-1α或其靶基因在制备治疗前面所述的药物中的应用。
进一步，所述靶基因包括VEGF。
本发明还提供了一种筛选治疗结直肠癌的药物的方法，所述方法包括检测药物处理前后DKC1，和/或，HIF-1α或其靶基因的表达或活性；优选地，所述靶基因包括VEGF。
具体地，本发明提供了一种筛选治疗结直肠癌的药物的方法，包括步骤：
测试组中，在细胞的培养体系中添加测试药物，并观察所述测试组的结直肠癌细胞中DKC1，和/或，HIF-1α或其靶基因的表达量和/或活性；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试药物，并观察对照组的所述细胞中DKC1，和/或，HIF-1α或其靶基因的表达和/或活性；
其中，如果测试组中细胞的DKC1，和/或，HIF-1α或其靶基因的表达和/或活性小于对照组，就表明该测试药物是对DKC1，和/或，HIF-1α或其靶基因的表达和/或活性有抑制作用的治疗结直肠癌的候选药物。
本发明可用于测量基因表达水平的分析方法的实例包括反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、竞争性RT-PCR、实时RT-PCR、核糖核酸酶保护测定(RPA)、RNA印迹法和DNA芯片，但不限于此。
用于测量基因表达水平的试剂包含与基因的mRNA特异性结合的引物、探针或反义核苷酸。本领域技术人员可基于该信息设计与编码所述蛋白的基因的mRNA特异性结合的引物、探针或反义核苷酸。
如本文所用的术语“引物”是识别靶基因序列的短核酸序列的链，其包括一对正反向引物。具体地，所述”引物”包括一对提供特异性和灵敏度的分析结果的引物。引物被认为在用于扩增靶基因序列时提供高度特异性，但并不引起与靶基因序列不一致或不互补的非靶序列的扩增。
本文所用的术语“探针”是指特异性结合至样品中待检测的靶标的物质。通过所述结合，探针可确定样品中靶标的存在。只要它通常用于本领域中，任何探针均可用于本公开内容。特别地，所述探针可以是PNA(肽核酸)、LNA(锁核酸)、肽、多肽、蛋白质、RNA或DNA，最优选PNA。具体而言，所述探针是可来自生物或可在活体外合成的生物材料或其模拟物。例如，所述探针可以是酶、蛋白、抗体、微生物、动物或植物细胞或器官、神经元、DNA或RNA。所述DNA可包括cDNA、基因组DNA和寡核苷酸。基因组RNA、mRNA和寡核苷酸也可落入所述RNA的范围内。所述蛋白的实例包括抗体、抗原、酶和肽。
本文所用的术语“反义核苷酸”是指具有核苷酸碱基序列和亚基-亚基骨架的寡聚体，所述骨架允许反义核苷酸通过Watson-Crick碱基配对与RNA中的靶序列杂交，以在所述靶序列中形成RNA：核苷酸异源双链核酸分子。所述核苷酸可具有与所述靶序列精确或接近的序列互补性。
本发明可用于测定蛋白表达水平的方法的实例包括，但不限于，蛋白芯片测定、免疫测定、配体结合测定、MALDI-TOF(基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱)、SELDI-TOF(表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱)、放射免疫测定、放射免疫扩散、双向免疫扩散(Ouchterlony immunodiffusion)、火箭免疫电泳、免疫组化染色、补体结合试验、2-D电泳、液相色谱-质谱(LC-MS)、液相色谱-质谱/质谱(LC-MS/MS)、蛋白质印迹法及ELISA(酶联免疫吸附试验)。
用于测量蛋白表达水平的试剂可包含可特异性结合至蛋白的抗体、寡肽、配体、PNA(肽核酸)或适体。
本文所用的术语“抗体”是指特异性结合抗原以引发抗原-抗体反应的物质。对于本公开内容的目的，术语“抗体”意指特异性结合至蛋白的抗体。落入本公开内容的抗体范围的是多克隆抗体、单克隆抗体和重组抗体。这些抗体可使用本领域熟知的技术容易地制得。例如，如本领域中熟知的，可通过将作为抗原的CENPQ蛋白注入动物中并从所述动物获得含有抗体的血清而制备多克隆抗体。多克隆抗体可使用任何动物(例如，山羊、兔、绵羊、猴、马、猪、牛、狗等)而制得。单克隆抗体可通过杂交瘤方法(Kohler和Milstein(1976)European Journal ofImmunology 6：511-519)，或噬菌体抗体库技术(Clackson等人，Nature，352：624-628，1991；Marks等人，J.Mol.Biol.，222：58，1-597，1991)获得。所述抗体可使用凝胶电泳、透析、盐沉淀、离子交换层析、亲和层析等来进行分离和纯化。此外，适用于本公开内容的抗体可以是由两条全长轻链和两条全长重链组成的完整抗体，或是完整抗体分子的功能片段。术语抗体分子的“功能片段”意指保留抗体结合功能的片段，例如Fab、F(ab′)、F(ab′)2及Fv。
如本文所用的术语“PNA(肽核酸)”是指与DNA或RNA相似的人工合成的聚合物，1991年由Nielsen、Egholm、Berg和Buchardt(丹麦哥本哈根大学)教授首次引入。DNA具有磷酸-核糖骨架，而PNA的骨架由通过肽键连接的重复的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元构成。由于这种结构，PNA显著增强DNA或RNA的结合亲合性及稳定性，因此有效地用于分子生物学研究、诊断和反义疗法。对于PNA的详细说明，可参考文献[Nielsen PE，Egholm M，Berg RH，Buchardt O(1991年12月).″Sequence-selective recognition of DNA bystranddisplacement with a thymine-substituted polyamide″.Science 254(5037)：1497-1500]。
本文所用的“适体”是结合至特定靶分子的寡核苷酸或肽分子。对于适体的详细说明，可参考文献[Bock LC等人，Nature 355(6360)：5646(1992)；Hoppe-Seyler F，Butz K″Peptide aptamers：powerful new tools for molecular medicine″.J Mol Med.78(8)：42630(2000)；Cohen BA，Colas P，Brent R.″An artificial cell-cycleinhibitorisolated from a combinatorial library″.Proc Natl Acad Sci USA.95(24)：142727(1998)]。
上述方法中所述的核酸探针可用体外重组或化学合成的方法获得，这在文献中已有报道。另外，杂交探针可用不同的标记方法来标记，例如放射性同位素、荧光物质、报告系统酶、生物素和其他配体。这些可探测的标记物还可以偶联光学检测物质，进而可以用光化学方法来检测。标记和探测的探针在文献中也有报道。
如本文所用，术语“RNAi”是指RNA干扰(RNA interference，RNAi)，是由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域。
RNAi试剂可以是小干扰RNA分子，通常是一条理论上可以形成小发夹(smallhairpin)结构的单链脱氧寡核苷酸(shRNA)，其长度一般不会超过100个核苷酸，典型的不会超过75个核苷酸；或者是一条15-30bp的双链脱氧寡核苷酸(siRNA)，最典型的是20-23bp。
在一些应用中，RNAi试剂也可以是编码shRNA或者siRNA的模板DNA。这些模板DNA可能存在于载体，比如质粒载体或病毒载体等载体中；也可以不存在与载体中，只是一段编码shRNA或者siRNA的模板DNA加一个控制其转录的常见启动子序列片段。
在本发明中，抑制DKC1的RNAi为针对DKC1的小干扰RNA；优选地，所述小干扰RNA含有至少一个修饰的核苷酸基团(修饰方式可以参照反义寡核苷酸部分)；更优选地所述修饰的核苷酸基团为二甲氧基修饰的核苷酸基团和/或短肽修饰的核苷酸基团。
关于本文中的筛选方法使用的术语“测试药物”意为用于筛选以检测其是否影响基因的表达水平或其是否影响蛋白的表达或活性的未知候选物质。
本文所用的术语“治疗”指减少症状的严重性和/或频率、消除症状和/或根本原因、预防症状的发生和/或它们的根本原因、以及改善或消除损伤。例如，通过给予本发明的药物来治疗患者包含易发展癌症的患者(例如，由于基因倾向、环境因素等引起的高风险)和/或有癌症复发风险的癌症幸存者中的药物预防，以及通过抑制紊乱或疾病或使之消退以双重治疗癌症患者。
本发明的有益效果和优势：
本发明首次发现了DKC1可以通过调节HIF-1α/VEGF通路以抑制结直肠癌血管生成而抑制结直肠癌迁移和侵袭，由此可知DKC1、HIF-1α、VEGF均可作为治疗结直肠癌的药物靶标。
本发明发现DKC1和HIF-1α可以产生协同增效作用，同时抑制两者表达，可显著抑制VEGF表达、抑制结直肠癌血管生成，抑制肿瘤转移和侵袭，效果优于单独使用两者中的任一个。
本发明的研究成果为临床治疗结直肠癌提供了一种新的治疗策略。
附图说明
图1显示利用Western blot检测DKC1表达对HIF-1α蛋白表达影响的结果图；
图2显示利用Western blot检测DKC1表达对HIF-1α蛋白和VEGF的蛋白表达影响的结果图；
图3显示利用QPCR检测DKC1表达对HIF-1α和VEGF的mRNA表达影响的结果图；
图4显示利用Western blot检测HIF-1α过表达对VEGF表达影响的结果图；
图5显示HIF-1α过表达对细胞迁移影响的结果图，其中，A：细胞图；B：统计图；
图6显示HIF-1α过表达对细胞侵袭影响的结果图，其中，A：细胞图；B：统计图；
图7显示HIF-1α过表达对血管形成影响的结果图，其中，A：细胞图；B：统计图；
图8显示DKC1稳定敲除细胞系中DKC1蛋白表达的结果图；
图9显示DKC1敲除对肿瘤重量和体积影响的结果图，其中，A：肿瘤实物图，B：体积统计图，C：重量统计图；
图10显示利用IHC检测DKC1稳定敲除细胞系中HIF-1α和VEGF蛋白表达的结果图；
图11显示HIF-1α稳定过表达细胞系中HIF-1α蛋白表达的的结果图；
图12显示利用视觉分析研究HIF-1α过表达对肿瘤转移数量影响的结果图，其中，A：细胞图；B：统计图；
图13显示利用HE染色检测HIF-1α过表达对肿瘤转移数量影响的结果图；
图14显示利用IHC检测HIF-1α过表达对VEGF表达影响的结果图；
图15显示干扰DKC1后进一步干扰HIF-1α对血管形成影响的统计图；
图16显示干扰DKC1后进一步干扰HIF-1α对迁移侵袭能力影响的统计图，其中，图A：迁移能力；图B：侵袭能力；
图17显示过表达DKC1的质粒图谱。
具体实施方式
下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明作出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围内。
通过参阅下述实施例可以更容易地了解本发明的内容，这些实施例只是为进一步说明本发明，并不意味着限定本发明的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1研究DKC1对HIF-1α及其靶基因表达的调控作用
1、实验方法
(1)细胞系和细胞培养条件
结直肠癌细胞系DLD1和HCT116获自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所(中国上海)。DLD1细胞在RPMI-1640培养基中培养，HCT116在含有10％胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基中培养。将所有细胞系在37℃、5％CO2培养箱中培养。
(2)RNAi和瞬时转染细胞
针对DKC1、HIF1A的siRNA(siDKC1、siHIF-1α)和乱序siRNA(siCtrl)购自上海吉玛制药技术有限公司。当细胞汇合度为30％时，使用siLentFect TM脂质试剂(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA，USA)将siRNA转染到细胞中。
siRNA靶序列如下：
siCtrl：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3'(SEQ ID NO.1)，
siDKC1#1：5'-GCGGAUGCGGAAGUAAUUA-3'(SEQ ID NO.2)，
siDKC1#2：5'-CCGGCUGCACAAUGCUAUU-3'(SEQ ID NO.3)，
siHIF-1a：5'-AUCCAGAGUCACUGGAACU-3'(SEQ ID NO.4)
shRNA靶序列如下：
shDKC1：5'-CCGGCUGCACAAUGCUAUU-3'(SEQ ID NO.5)。
(3)RNA提取和qRT-PCR
根据制造商的说明书，使用Trizol试剂(Invitrogen)进行总RNA提取。在测量RNA纯度后，使用PrimeScript TM RT试剂盒以及gDNAEraser(Vazyme)进行逆转录反应。
引物序列如下：
HIF-1α
正向引物：5’-TGATGACCAGCAACTTGAGG-3’(SEQ ID NO.6)，
反向引物：5’-CTGGGGCATGGTAAAAGAAA-3’(SEQ ID NO.7)；
VEGF
正向引物：5’-GAAGGACTTTACCTTCCAGGA-3’(SEQ ID NO.8)，
反向引物：5’-ATGATTCTGCCCTCCTCCTTC-3’(SEQ ID NO.9)；
GAPDH
正向引物：5’-AAGGTCGGAGTCAACGGATTTG-3’(SEQ ID NO.10)，
反向引物：5’-CCATGGGTGGAATCATATTGGAA-3’(SEQ ID NO.11)。
通过ABI7500 qRT-PCR系统热循环仪(Vazyme Biotech，Nanjing，China)和SYBRGreen PCR Master Mix一式三份进行qRT-PCR。选择GAPDH mRNA作为内部对照。CT方法用于计算靶标mRNA水平，归一化为GAPDH。
(4)质粒转染
质粒转染：细胞提前一天铺板，转染前一小时换无双抗培养基。质粒：Lipofectamine 2000＝1(ug):2(μl)。先加入96μl无双抗及血清培养基到EP管，再加入4μl脂质体，缓慢混匀，室温孵育5min；加入98μl无双抗及血清培养基到EP管，再加入2μl(2ug)质粒，混匀；将含有质粒的100μl培养基混入含有脂质体的100μl EP管，室温孵育20min；滴加到六孔板中；六小时后换液。过表达DKC1的质粒图谱如图17所示。
(5)Western blot
按照以前描述的方法进行(参考文献：Hou P,Li L,Chen F,Chen Y,Liu H,Li J,et al.PTBP3-Mediated Regulation of ZEB1 mRNA Stability Promotes Epithelial-Mesenchymal Transition in Breast Cancer.Cancer research 2018,78(2):387-398)，兔anti-DKC1(1:1500,ab64667,Abcam,USA),兔anti-HIF-1α(1:1000,ab51608,Abcam,USA),兔anti-VEGF(1:1000,19003-1-AP,Proteintech,USA)，鼠anti-GAPDH(1:200000,Proteintech,USA)作为一抗；HRP-羊抗兔，HRP-羊抗鼠作为二抗。光密度法检测检测蛋白质条带密度(tanon，上海，中国)。
2、统计分析
统计分析使用统计软件20.0进行(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)和GraphPadPrism 7。不成对t检验是用于确定组间差异的统计显著性。数据表示为平均值±标准差。p<0.05被认为具有统计学意义。
3、结果
Western blot显示HCT116和DLD1细胞中DKC1表达下调导致在含氧量正常(21％O2)或缺氧(1％O2)环境中HIF-1α蛋白表达抑制(图1A)；当过表达DKC1时，HIF-1α蛋白水平也显着增加(图1B)。Western blot和QPCR结果显示，干扰DKC1表达时，HIF-1α和VEGF的蛋白和mRNA水平显著下调；过表达DKC1时，HIF-1α和VEGF的蛋白和mRNA水平显著升高(图2和图3)。以上数据表明，HIF-1α和VEGF的蛋白和mRNA表达受DKC1的正调控。
实施例2研究DKC1与HIF-1α对肿瘤血管生成、肿瘤迁移和侵袭的影响
1、实验方法
(1)稳定转染细胞系构建
使用包装DKC1 shRNA载体和相应对照载体的慢病毒(购自上海吉玛制药技术有限公司，货号分别为：D01005及D01002)构建DKC1稳定敲除HCT116细胞系和对照细胞系。然后用HIF-1α过表达慢病毒(吉凯基因，货号：G0150)感染DKC1稳定敲除HCT116细胞以建立HIF-1α稳定过表达细胞系。用慢病毒转染这些靶细胞48小时，然后用5μg/ml嘌呤霉素(SantaCruz Biotechnology，Inc.，Dallas，TX，USA)选择2周。
(2)免疫组化(IHC)
将石蜡包埋的CRC组织和相应的癌旁组织固定到1.5mm直径的芯上。先前描述了TMA免疫染色的标准方案(参见文献：Shi M,Cao M,Song J,Liu Q,Li H,Meng F,etal.PinX1 inhibits the invasion and metastasis of human breast cancer viasuppressing NF-kappaB/MMP-9 signaling pathway.Molecular cancer 2015,14:66)。将多克隆兔抗DKC1(1：100，ab64667；Abcam，Cambridge，MA，USA)用作一抗4℃孵育过夜。对于其他一抗，抗HIF-1α抗体(兔多克隆，ab51608，Abcam，USA)以1：400稀释应用，抗VEGF抗体(兔多克隆，19003-1-AP，Proteintech，USA)以1：100稀释应用。在一抗孵育时使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)代替抗体作为阴性对照。
免疫组织化学评估
在没有临床数据下的情况下由两名病理学家独立评估DKC1染色评分。他们讨论了每个分歧的核心，最后达成了统一的意见。通过评估免疫反应评分(IRS)来评估DKC1在CRC组织和相应正常组织中的表达评分，IRS通过乘以DKC1染色强度和DKC1免疫阳性细胞的百分比来计算。DKC1免疫染色的强度分级为0-3(0，阴性；1，弱；2，中等；3，强)。免疫阳性细胞的百分比分为4级：1为0至25％，2为26％至50％，3为51％至75％，4为76％至100％。在IRS的基础上，DKC1表达水平被分类为低(IRS：0,1,2,3,4,6)和高(IRS：8,9,12)表达。
(3)细胞迁移和侵袭测定
通过使用transwell室进行细胞迁移和侵袭测定。基质胶(BD Biosciences，Mississauga，Canada)分别不包被或包被transwell filter inserts用于细胞迁移或细胞侵袭测定。用无FBS的培养基重悬2×105个细胞接种在顶室中，并在37℃，5％CO2下孵育12或24小时。然后用90％甲醇将细胞固定在膜上20分钟，并用结晶紫染色。在顶室中不能穿过膜的细胞同时用棉签擦除。穿过膜的细胞用倒置显微镜计数。
(4)血管形成测定
将1×106个处理组细胞与各自的对照细胞接种在60mm平板中，用2ml新鲜无FBS培养基温育1天，然后保存处理过的培养基。对于血管形成测定，将涂有180μL基质胶(BDBiosciences)的48孔板在37℃培养箱中保持2小时以凝固基质胶。然后将200μL经处理的培养基悬浮的4×104个HUVEC细胞接种到预先涂有基质胶的48孔板中并培养4小时。使用倒置显微镜计数血管形成。
(5)细胞增殖分析
使用细胞计数试剂盒-8制造商的方案(Dojindo)进行CCK-8测定以检测细胞增殖。简单来说，将200μL完全培养基悬浮的4000个细胞接种到96孔板中培养。当达到规定时间时，将10μL CCK-8溶液与100μL培养基混合，加入到96孔板中，并在37℃下培养2小时。在450nm处测量吸光度。
(6)皮下肿瘤模型和体内肺转移模型
动物实验经徐州医科大学动物保护委员会批准。雌性BALB/c裸鼠(6-8周龄)购自北京维通利华实验动物技术有限公司，并在无特定病原体的条件下饲养。将20只雌性BALB/c裸鼠随机分为两组：DKC1敲除组和对照组。将DKC1稳定敲除HCT116细胞(5×106个)和对照HCT116细胞(5×106个)用200μL PBS悬浮并皮下注射到腋窝中。六天后，可以通过视觉观察皮下肿瘤。每两天测定肿瘤长直径和宽直径，长直径乘以宽直径获得肿瘤体积。两周后，处死所有小鼠并切除肿瘤。将每个肿瘤称重并用4％多聚甲醛固定以进行进一步的免疫组织化学测定。通过小鼠尾静脉注射建立肺转移模型。将21只雌性BALB/c裸鼠(6-8周龄)随机分成三组：对照细胞组、DKC1稳定敲除HCT116细胞组，和HIF-1α稳定过表达细胞组。通过小鼠尾静脉注射2×106个用200μL PBS悬浮的HCT116细胞。四十五天后，处死所有小鼠并切除肺。每个肺用4％多聚甲醛固定，进一步用HE染色和免疫组织化学分析，对每个肺表面的转移性结节计数。
2、结果
(1)HIF-1α拯救分析
a、体外分析
分别在HCT116和DLD1细胞中共转染过表达HIF-1α的质粒和靶向DKC1的两个siRNA。结果表明，HIF-1α过表达可显著逆转干扰DKC1表达导致的VEGF表达下调(图4)。同时，HIF-1α过表达也逆转了细胞在迁移，侵袭和血管形成方面的能力(图5-图7)。
b、体内分析
利用HCT116建立DKC1稳定敲除细胞系。Western blot显示在DKC1稳定敲除细胞系HCT116中DKC1蛋白表达下调(图8)。将DKC1稳定敲除细胞系(shDKC1)和对照细胞系(shCtrl)与基质胶混合皮下注射到BALB/c裸鼠中。6天后，每隔一天测量皮下肿瘤的最大长度和宽度。两周后，切除皮下肿瘤并测量了它们的重量和体积(图9A，图中10只老鼠是平行实验使用的10只老鼠)。与对照细胞相比，数据显示接种DKC1稳定敲除细胞系的肿瘤重量和体积显着降低(图9B-C)。IHC测定显示与对照细胞相比，DKC1稳定敲除细胞系诱导的异种移植肿瘤中HIF-1α和VEGF蛋白表达降低(图10)。在DKC1稳定敲除细胞系的基础上建立的HIF1α稳定过表达细胞系。将DKC1稳定敲除细胞系或HIF1α稳定过表达细胞系或对照细胞系注射到BALB/c裸鼠尾静脉中。45天后，处死所有小鼠，切除肺。视觉分析表明，HIF-1α过表达显著逆转了肿瘤转移的数量(图11和图12)。通过肺HE染色进一步证实了该结果(图13)。IHC测定显示HIF-1α过表达上调VEGF表达(图14)。
(2)DKC1和HIF-1α双抑制分析
(1)血管形成能力分析
在HCT116对照细胞及shDKC1细胞中，分别转染针对HIF-1α的siRNA(siHIF-1α)及对照siRNA(siCtrl)，随后利用这些细胞进行血管形成实验分析，实验发现，干扰HIF-1α的表达，可以进一步抑制血管形成的能力(图15)。
(2)迁移侵袭能力分析
在HCT116对照细胞及shDKC1细胞中，分别转染针对HIF-1α的siRNA(siHIF-1α)及对照siCtrl，随后利用这些细胞进行迁移侵袭实验，实验发现，干扰HIF-1α的表达，可以进一步抑制细胞的迁移及侵袭能力(图16)。
本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只欲作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。
序列表
<110> 徐州医科大学
<120> DKC1与HIF-1α在协同治疗结直肠癌中的应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
uucuccgaac gugucacgu 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcggaugcgg aaguaauua 19
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccggcugcac aaugcuauu 19
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
auccagaguc acuggaacu 19
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccggcugcac aaugcuauu 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgatgaccag caacttgagg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctggggcatg gtaaaagaaa 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaaggacttt accttccagg a 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgattctgc cctcctcctt c 21
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aaggtcggag tcaacggatt tg 22
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccatgggtgg aatcatattg gaa 23

Claims (10)

1.一种治疗结直肠癌的药物靶标，所述药物靶标包括DKC1。
2.根据权利要求1所述的药物靶标，其特征在于，所述药物靶标还包括HIF-1α或其靶基因。
3.根据权利要求1所述的药物靶标，其特征在于，所述靶基因是VEGF。
4.一种治疗结直肠癌的药物，所述药物包括抑制DKC1的试剂。
5.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述试剂包括抑制DKC1本身或其上下游分子的表达或活性的试剂。
6.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述药物包括抑制HIF-1α或其靶基因的试剂。
7.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述药物包括抑制HIF-1α或VEGF的试剂。
8.DKC1，和/或，HIF-1α或其靶基因在制备治疗权利要求4-7中任一项所述的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述靶基因包括VEGF。
10.一种筛选治疗结直肠癌的药物的方法，其特征在于，所述方法包括检测药物处理前后DKC1和/或，HIF-1α或其靶基因的表达或活性；优选地，所述靶基因包括VEGF。
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