CN110317872A - 用于制备检测、预后和诊断乳腺癌产品的分子标记物及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于制备检测、预后和诊断乳腺癌产品的分子标记物，其特征在于：所述分子标记物包括HOTAIR、miR‑204‑5p、ZEB1中的一种或多种，所述HOTAIR具有如SEQ ID:1所示序列，所述miR‑204‑5p具有如SEQ ID:2所示序列，所述ZEB1具有如SEQ ID:3所示序列。本发明中HOTAIR通过miR‑204‑5p介导的BC上调ZEB1促进乳腺癌细胞的增殖，迁移，侵袭和增强AKT信号通路活性。该HOTAIR/miR‑204‑5p/ZEB1调控轴为BC中lncRNA定向治疗的研究提供了理论基础。本发明还提供一种用于检测、预后和诊断乳腺癌的试剂盒及一种用于预后和治疗乳腺癌的药物。

Description

用于制备检测、预后和诊断乳腺癌产品的分子标记物及试 剂盒
技术领域
本发明属于肿瘤分子生物技术领域，具体涉及一种用于制备检测、预后和诊断乳腺癌产品的分子标记物及试剂盒。
背景技术
乳腺癌(BC)是女性中最常见的恶性肿瘤之一。BC的最强风险因素包括年龄和基因突变。虽然BC的早期诊断以及手术技术和放化疗的水平得到了显著改善，但BC的发病率仍在稳步上升，且变得更年轻化。因此，迫切需要阐明BC发展的分子机制，为BC的预防提供理论依据。
长链非编码RNA(lncRNA)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA。近年来，研究发现lncRNAs几乎涉及人体的所有生理和病理过程，且与各种肿瘤的发生和发展密切相关。同源异形基因转录物反义RNA(HOTAIR)存在于HOX基因中，是第一个被发现具有反式转录作用的lncRNA。最近的研究表明，HOTAIR的异常表达与肿瘤的发生和发展密切相关。
MicroRNAs(miRNAs)是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约19～22个核苷酸，通过靶向信使RNA(mRNA)的3'UTR来调节转录后基因表达。LncRNA可作为miRNA的载体，下调miRNA的表达，改变miRNA靶蛋白的表达水平。研究表明，miRNA可作为致癌基因或肿瘤抑制基因来调节癌症的发生。MiR-204-5p是miRNA家族的成员，近期，MiR-204-5p在肿瘤发展中的作用受到了很多关注。
E盒结合锌指蛋白1(ZEB1)是由Zfhxla基因编码的锌指蛋白转录因子。它在人体组织和器官中广泛表达，并在肿瘤组织中高表达。一些研究表明，ZEB1的表达促进了BC细胞的增殖和转移。NEAT1能够诱导ZEB1mRNA和蛋白质表达以促进BC发展。Ma等人的研究表明，ZEB1/2的过表达导致miR-448的异位表达，随后减弱了BC细胞系的迁移活性。
在本发明中，我们旨在研究HOTAIR，miR-204-5p和ZEB1之间的相互作用，探讨HOTAIR/miR-204-5p/ZEB1轴在BC中的功能效应，以提供更为精确的BC预后分子标记物，并为BC研究提供了一些潜在的治疗靶点，为探索lncRNA-miRNA功能网络在癌症中的作用提供基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种准确度高的可用于乳腺癌预测的分子标记。
为实现上述目的，本发明提供一种用于制备检测、预后和诊断乳腺癌产品的分子标记物，所述分子标记物包括HOTAIR、miR-204-5p、ZEB1中的一种或多种，所述HOTAIR具有如SEQ ID:1所示序列，所述miR-204-5p具有如SEQ ID:2所示序列，所述ZEB1具有如SEQ ID:3所示序列。
具体地，与正常人体的组织或细胞相比，在乳腺癌患者的组织或细胞中，所述HOTAIR的表达量上调，所述miR-204-5p的表达量下调，所述ZEB1的表达量上调，所述HOTAIR的表达量与所述miR-204-5p的表达量呈负相关，所述miR-204-5p的表达量与所述ZEB1的表达量呈负相关，所述ZEB1的表达量与所述HOXTAIR的表达量呈正相关。
具体地，所述HOTAIR的敲除抑制乳腺癌细胞的增殖，迁移，侵袭和AKT信号通路的活性。
具体地，所述miR-204-5p是乳腺癌细胞中所述HOXTAIR的下游靶基因，所述miR-204-5p的下调抑制所述HOXTAIR介导的乳腺癌细胞的抗增殖，抗迁移和抗侵袭并激活AKT信号传导途径。
具体地，所述ZEB1是所述miR-204-5p的靶标。ZEB1促进细胞增殖，迁移，侵袭和BC细胞AKT信号通路的活性。ZEB1的过表达逆转了HOTAIR敲除对BC细胞增殖，迁移和侵袭的影响，并激活了AKT信号通路。
具体地，所述HOTAIR的敲除能够抑制所述ZEB1的mRNA和蛋白的表达。HOTAIR通过下调miR-204-5p和上调BC细胞中的ZEB1来促进乳腺癌细胞的增殖，迁移，侵袭和AKT信号通路活性。
本发明还提供一种用于检测、预后和诊断乳腺癌的试剂盒，包括定量HOTAIR、miR-204-5p或ZEB1表达量的试剂。
具体地，所述定量HOTAIR、miR-204-5p或ZEB1表达量的试剂包括HOTAIR或ZEB1的cDNA扩增引物，所述HOTAIR的cDNA扩增引物包括如SEQ ID:4所示的上游引物和如SEQ ID:5所示的下游引物，所述ZEB1的cDNA扩增引物包括如SEQ ID:6所示的上游引物和如SEQ ID:7所示的下游引物。
本发明还提供一种用于预后和治疗乳腺癌的药物，包括能够抑制HOTAIR表达的药剂或能使miR-204-5p表达的药剂。
具体地，所述能够抑制HOTAIR表达的药剂包括抑制HOTAIR表达的siRNA或shRNA，如si-HOTAIR或sh-HOTAIR。
本发明中通过测定HOTAIR、miR-204-5p、ZEB1在BC组织和细胞中表达水平，得出，与正常人体的组织或细胞相比，在乳腺癌患者的组织或细胞中，HOTAIR的表达量上调，miR-204-5p的表达量下调，ZEB1的表达量上调，HOTAIR的表达量与miR-204-5p的表达量呈负相关，miR-204-5p的表达量与ZEB1的表达量呈负相关，ZEB1的表达量与HOXTAIR的表达量呈正相关。相互关联的多种分子标记相结合，可提高乳腺癌的诊断、预后和检测的准确度。
本发明中应用双荧光素酶报告基因测定法检查HOTAIR和miR-204-5p或miR-204-5p和ZEB1之间的靶标关系。细胞计数试剂盒-8(CCK-8)和Transwell试验用于检测细胞增殖，迁移和侵袭率。通过蛋白质印迹(WB)证实ZEB1、AKT和p-AKT的蛋白质水平。结果显示，miR-204-5p是乳腺癌细胞中HOXTAIR的下游靶基因，ZEB1是miR-204-5p的靶标，HOTAIR促进BC细胞的增殖，迁移和侵袭，miR-204-5p在BC组织和细胞中起到肿瘤抑制剂的作用，ZEB1促进乳腺癌细胞增殖，迁移，侵袭和AKT信号通路的活性。HOTAIR的敲除抑制乳腺癌细胞的增殖，迁移，侵袭和AKT信号通路的活性，抑制miR-204-5p可以逆转HOTAIR基因敲除对细胞增殖，抗迁移和抗侵袭的影响，ZEB1的过表达逆转了HOTAIR敲除对BC细胞增殖，迁移和侵袭的影响，并激活了AKT信号通路。该结果为BC研究提供了一些潜在的治疗靶点，为我们探索lncRNA-miRNA功能网络在癌症中的作用提供了基础。
附图说明
图1A为HOTAIR在BC组织中表达水平测定结果图；
图1B为不同HOTAIR表达组存活率测定结果图；
图1C为HOTAIR在BC细胞中表达水平测定结果图；
图2A为si-HOTAIR的转染MCF-7细胞系中HOTAIR水平测定结果图；
图2B为si-HOTAIR的转染MDA-MB-231细胞系中HOTAIR水平测定结果图；
图2C为si-HOTAIR介导的HOTAIR沉默引发MCF-7细胞系中细胞增殖能力测定结果图；
图2D为si-HOTAIR介导的HOTAIR沉默引发MDA-MB-231细胞系中细胞增殖能力测定结果图；
图2E为敲除HOTAIR后，细胞的迁移结晶紫染色显微镜观察图；
图2F为敲除HOTAIR后，细胞的迁移能力结果图；
图2G为敲除HOTAIR后，细胞的侵袭结晶紫染色显微镜观察图；
图2H为敲除HOTAIR后，细胞的侵袭能力结果图；
图2I为敲除HOTAIR，AKT的蛋白质表达结果图；
图3A为HOTAIR含有的miR-204-5p的结合位点；
图3B为miR-204-5p mimic转染MCF-7对HOTAIR-WT和HOTAIR-MUT报告基因酶活性的影响结果图；
图3C为miR-204-5p mimic转染MDA-MB-231对HOTAIR-WT和HOTAIR-MUT报告基因酶活性的影响结果图；
图3D为miR-204-5p mimic引入后免疫沉淀复合物中HOTAIR含量测定结果图；
图3E为miR-204-5p在BC组织中表达水平测定结果图；
图3F为miR-204-5p在BC细胞中表达水平测定结果图；
图3G为HOTAIR与miR-204-5p表达相关性分析结果图；
图3H为HOTAIR过表达的BC细胞中HOTAIR的表达水平测定结果图；
图3I为HOTAIR过表达或敲除的BC细胞中miR-204-5p的表达水平测定结果图；
图4A为HOTAIR和miR-204-5p不同表达对MCF-7细胞中细胞增殖能力的影响结果图；
图4B为HOTAIR和miR-204-5p不同表达对MDA-MB-231细胞中细胞增殖能力的影响结果图；
图4C为si-HOTAIR转染MCF-7和MDA-MB-231细胞中的细胞迁移能力测定结果图；
图4D为si-HOTAIR转染MCF-7和MDA-MB-231细胞中的细胞侵袭能力测定结果图；
图4E为HOTAIR和miR-204-5p不同表达对AKT信号传导途径的影响结果图；
图5A为miR-204-5p和ZEB1 3'UTR互补序列；
图5B为miR-204-5p过表达MCF-7中ZEB1-WT和ZEB1-MUT报告基因酶活性的影响结果图；
图5C为miR-204-5p过表达MDA-MB-231中ZEB1-WT和ZEB1-MUT报告基因酶活性的影响结果图；
图5D为ZEB1在BC组织中表达水平测定结果图；
图5E为ZEB1在BC细胞中表达水平测定结果图；
图5F为miR-204-5p与ZEB1表达相关性分析结果图；
图5G为miR-204-5p过表达的MCF-7和MDA-MB-231细胞中ZEB1表达水平测定结果图；
图6A为miR-204-5p和ZEB1不同表达对MCF-7细胞增殖能力的影响结果图；
图6B为miR-204-5p和ZEB1不同表达对MDA-MB-231细胞增殖能力的影响结果图；
图6C为miR-204-5p和ZEB1不同表达对BC细胞中细胞迁移能力的影响结果图；
图6D为miR-204-5p和ZEB1不同表达对BC细胞中细胞侵袭能力的影响结果图；
图6E为miR-204-5p和ZEB1不同表达对AKT信号传导途径的影响结果图；
图7A为HOTAIR和miR-204-5p对ZEB1mRNA表达影响结果图；
图7B为HOTAIR和miR-204-5p对ZEB1蛋白表达影响结果图；
图8A为sh-HOTAIR组和sh-NC组肿瘤体积测定结果图；
图8B为sh-HOTAIR组和sh-NC组肿瘤重量测定结果图；
图8C为sh-HOTAIR组和sh-NC组HOTAIR的表达测定结果图；
图8D为sh-HOTAIR组和sh-NC组miR-204-5p的表达测定结果图；
图8E为sh-HOTAIR组和sh-NC组ZEB1的表达测定结果图；
图8F为sh-HOTAIR组和sh-NC组ZEB1的AKT信号传导途径测定结果图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和有益效果，下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。需说明的是，下述实施所述方法是对本发明做的进一步解释说明，不应当作为对本发明的限制。本发明的实施例中所用的材料、试剂若无特殊说明皆可从商业途径获得。
对35名BC患者进行研究，收集肿瘤样品和相邻组织并立即储存在-80℃直至使用。该项研究获得汕头市中心医院伦理委员会的批准，且所有入选患者签署书面知情同意书。
BC细胞系(MCF-7和MDA-MB-231)和人乳腺上皮细胞系(MCF-10A)均购自北京北纳创联生物技术研究院。MCF-7和MDA-MB-231细胞系在10％FBS(Thermo Fisher Scientific)和100U/mL青霉素/链霉素的DMEM培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，Waltham，MA，USA)中，于5％CO2和37℃培养箱中培养。MCF-10A细胞系在RPMI-1640(Thermo FisherScientific)中培养。
实施例1 HOTAIR、miR-204-5p、ZEB1在BC组织和细胞中表达水平测定
在本实施例中，测定HOTAIR在BC组织和细胞中表达水平。使用TRIzol试剂(ThermoFisher Scientific)从组织和细胞中提取总RNA。使用cDNA逆转录试剂盒(Thermo FisherScientific)将提取的RNA逆转录合成互补DNA(cDNA)。使用Prime Script TM RT试剂盒(Takara，大连，中国)定量mRNA。使用PremixDimerEraser试剂盒(Takara)进行qRT-PCR。TaqMan microRNA测定(Thermo Fisher Scientific)用于测量miR-204-5p水平，其中U6小核RNA(U6-snRNA)作为参照。使用2-ΔΔCt方法以GAPDH作为参照计算HOTAIR和ZEB1的相对表达。miR-204-5p或U6的特异性引物购自GeneCopoeia(Rockville，MD，USA)，HOTAIR，ZEB1和GAPDH的引物如下：
HOTAIR F:CAGTGGGGAACTCTGACTCG(SEQ ID:4)；
R:GTGCCTGGTGCTCTCTTACC(SEQ ID:5)；
ZEB1 F:GCCAATAAGCAAACGATTCTG(SEQ ID:6)；
R:TTTGGCTGGATCACTTTCAAG(SEQ ID:7)；
GAPDH F:TCAAGGCTGAGAACGGGAAG；
R:TGGACTCCACGACGTACTCA。
结果显示，在BC组织和细胞系中检测了HOTAIR的表达水平。RT-qPCR测定显示，与邻近的正常组织相比，20例BC组织中的HOTAIR水平显著上调(图1A)。通过Kaplan-Meier计算HOTAIR表达的总存活率，结果显示，与低HOTAIR表达组相比，高HOTAIR表达组具有较低的存活率(图1B)。此外，与永生化人乳腺细胞(MCF-10A)相比，在两个BC细胞(MCF-7和MDA-MB-231)中HOTAIR的表达量显著增加(图1C)。与正常组织和细胞相比，BC组织和细胞中miR-204-5p的表达显著降低(图3E和F)。此外，相关性分析显示HOTAIR表达与miR-204-5p呈负相关(图3G)。RT-qPCR测定进一步揭示，与邻近的正常组织相比，BC组织中ZEB1表达显著上调(图5D)。ZEB1在MCF-7和MDA-MB-231细胞中的表达显著高于在MCF-10A中的表达(图5E)。相关分析显示miR-204-5p表达量与BC组织中的ZEB1的mRNA的表达量呈负相关(图5F)。
实施例2 HOTAIR、miR-204-5p、ZEB1相互作用对BC细胞增殖、迁移和侵袭研究
在本实施例中，应用双荧光素酶报告基因测定法检查HOTAIR和miR-204-5p或miR-204-5p和ZEB1之间的靶标关系。细胞计数试剂盒-8(CCK-8)和Transwell试验用于检测细胞增殖，迁移和侵袭率。通过蛋白质印迹(WB)证实ZEB1，AKT和p-AKT的蛋白质水平。
细胞转染
针对HOTAIR(si-HOTAIR#1或2)的小干扰RNA(siRNA)及其对照(si-NC)，pcDNA和pcDNA-HOTAIR过表达载体(HOTAIR)或pcDNA-ZEB1过表达载体(ZEB1)，miR-204-5p mimic(miR-204-5p)，miR-204-5p抑制剂(in-miR-204-5p)和匹配的阴性对照(miR-NC，in-miR-NC)购自上海吉玛制药技术有限公司。使用Lipofectamine 2000试剂(Thermo FisherScientific)参照说明将这些寡核苷酸或质粒转染到BC细胞中。收集细胞用于双荧光素酶报道分子测定，qRT-PCR，WB转染48h。转染24h后进行CCK-8和Transwell测定。
蛋白质印迹(WB)测定
收集组织和细胞并在RIPA裂解缓冲液(Beyotime，上海，中国)中裂解。根据说明书，使用BCA蛋白质测定试剂盒(Beyotime)定量总蛋白质。使用SDS-PAGE凝胶分离总蛋白质，转移至聚偏二氟乙烯膜(Millipore，Billerica，MA，USA)，并在室温下用5％脱脂乳封闭1h。随后，将膜与针对ZEB1(Abcam，Cambridge，MA，USA)或β-肌动蛋白(Abcam)的一抗在4℃温育过夜，然后与标记有HRP(Abcam)的二抗在37℃温育1h，用TBST洗涤四次。通过商品化增强的化学发光显色底物(Beyotime)使蛋白质信号传导可视化，并通过Image Lab软件(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)定量。
细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测定
将细胞以每孔1×104个细胞的密度接种在96孔板中，并在5％CO2和37℃的培养箱中培养24h。转染后将细胞培养24h，然后，向每个孔中加入10μL CCK-8溶液(Sigma-AldrichCo.，St Louis，MO，USA)并培养4h。随后用分光光度计(Bio-Rad)测量在450nm处的吸光度。
细胞迁移侵袭能力测定
通过Transwell测定法(Corning，NY，USA)测量细胞迁移和侵袭能力。细胞转染后，除了100μl无血清培养基(Thermo Fisher Scientific)之外，将1×105个细胞接种在具有或不具有基质胶(BD Biosciences，San Jose，CA，USA)的8μm聚碳酸酯膜过滤器中以检测其能力。细胞迁移和入侵在上室中，下室加入600μl含有10％FBS的培养基。24h后，除去膜并在室温下用0.1％结晶紫染色15min。在倒置显微镜下对迁移和侵入细胞进行计数。
双荧光素酶报告基因测定
LncBase Predicted v.2和TargetScan分别用于预测HOTAIR1和miR-204-5p或miR-204-5p和ZEB1的结合位点。将含有miR-204-5p结合位点的HOTAIR和ZEB1 3'UTR的部分片段亚克隆到psiCHECK-2荧光素酶载体(Promega)中，以分别产生HOTAIR-WT和ZEB1-WT报道分子。此外，构建了具有突变体miR-204-5p结合位点的HOTAIR-MUT和ZEB1-MUT报道分子。将细胞接种在24孔板中，并使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)用40nM miR-204-5p或miR-NC和100ng相应的荧光素酶报告载体共转染。在转染48h后，通过双荧光素酶报告基因测定试剂盒(Promega)检查荧光素酶活性。
RNA免疫沉淀(RIP)测定
用miR-204-5p或miR-NC转染MCF-7和MDA-MB-231细胞48h后，使用Millipore免疫沉淀试剂盒(Billerica，MA，USA)进行RIP测定。将细胞在含有磁珠的RIP缓冲液中裂解，并与抗磁珠的IgG(Millipore)或argonaute2(Ago2，Millipore)抗体一起孵育。通过TRIzol试剂分离免疫沉淀的RNA，通过qRT-PCR检测IgG或Ago2免疫沉淀复合物中的HOTAIR富集。
统计分析
所有数据均以三次独立实验的平均值±SD表示。两组之间的比较通过学生t检验进行，并且通过单因素方差分析(ANOVA)分析多组之间的比较。在p值≤0.05时，差异被认为在统计学上是显著的。
2.1.HOTAIR敲除抑制了BC细胞的增殖，迁移和侵袭和AKT信号通路的活性
我们构建了小干扰RNA，以进一步验证HOTAIR表达与BC进展之间的关系，qRT-PCR检测证实si-HOTAIR的转染导致MCF-7和MDA-MB-231细胞系中HOTAIR水平显著降低(图2A和图2B)，意味着si-HOTAIR可用于随后的功能丧失研究。然后，CCK-8测定显示si-HOTAIR介导的HOTAIR沉默引发MCF-7和MDA-MB-231细胞系中细胞增殖能力的显著下调(图2C和图2D)。如图2E、图2F、图2G、图2H所示，结晶紫染色结果显示，在敲除HOTAIR后，细胞的迁移和侵袭被显著抑制。统计结果显示，与si-NC转染细胞相比，HOTAIR的敲除显著降低了MCF-7和MDA-MB-231细胞系的迁移和侵袭率。为了验证HOTAIR是否与AKT信号通路有关，我们检测了AKT的蛋白质表达。结果显示，HOTAIR的敲除降低了p-AKT的表达(图2I)，抑制了AKT信号传导途径的激活。
2.2.HOTAIR与miR-204-5p间相互作用
为了探索与HOTAIR相关的miRNA，我们进行了生物信息学预测。分析表明，通过LncBase Predicted v.2软件预测HOTAIR含有miR-204-5p的结合位点(图3A划线内容)。为了进一步证实该预测，构建了含有miR-204-5p结合位点的HOTAIR-WT荧光素酶报告基因和具有突变体miR-204-5p结合位点的HOTAIR-MUT报告基因。双荧光素酶报告基因检测结果显示，miR-204-5p mimic转染导致HOTAIR-WT报告基因荧光素酶活性的显著下调，但对HOTAIR-MUT报告基因的荧光素酶活性没有影响，通过预测结合位点，揭示了HOTAIR与miR204-5p之间的相互作用(图3B和图3C)。此外，通过RIP测定以预测HOTAIR与miR-204-5p在空间上是否有相互作用。结果显示，与IgG对照组相比，miR-204-5p mimic的引入导致Ago2免疫沉淀复合物中HOTAIR的大量富集(图3D)，暗示了HOTAIR和miR-204-5p间的相互作用。随后，我们检测了miR-204-5p在BC组织和细胞中的表达，结果显示，与正常组织和细胞相比，BC组织和细胞中miR-204-5p的表达显著降低(图3E和图3F)。此外，相关性分析显示HOTAIR表达与miR-204-5p呈负相关(图3G)。通过HOTAIR的过表达和敲除检测miR-204-5p的表达。转染效率分析显示，转染HOTAIR过表达质粒的BC细胞中HOTAIR的表达水平显著上调(图3H)，该结果表明HOTAIR的过表达或敲除分别显著降低或增加了BC细胞中miR-204-5p的表达(图3I)。总之，这些结果表明HOTAIR与miR-204-5p直接相互作用。
2.3.miR-204-5p的消耗消除了HOTAIR缺乏介导的BC细胞的抗增殖，抗迁移和抗侵袭作用
为了验证HOTAIR和miR-204-5p表达对细胞增殖，迁移和侵袭的影响，si-NC，si-HOTAIR，si-HOTAIR+in-miR-NC或si-HOTAIR+in-miR-204-5p分别转染到细胞中。CCK-8测定表明miR-204-5p抑制剂的引入导致HOTAIR沉默的MCF-7和MDA-MB-231细胞中细胞增殖能力的显著增加(图4A和图4B)。此外，在抑制miR-204-5p水平后，si-HOTAIR转染的MCF-7和MDA-MB-231细胞中的细胞迁移和侵袭率显著增加(图4C和图4D)。另外，p-AKT的表达显示miR-204-5p的抑制降低了HOTAIR敲除对AKT信号传导途径的抑制(图4E)。总之，这些数据表明miR-204-5p的下调显著抑制HOXTAIR介导的BC细胞的抗增殖，抗迁移和抗侵袭并激活AKT信号传导途径。
2.4.ZEB1是miR-204-5p的靶标
Targetscan的生物信息学预测显示miR-204-5p和ZEB1 3'UTR之间存在几个互补序列(图5A划线内容)。双荧光素酶报告基因测定进一步显示，miR-204-5p过表达细胞中ZEB1-WT报告基因的荧光素酶活性显著降低，而对ZEB1-MUT报告基因的荧光素酶活性没有影响(图5B和图5C)，这意味着miR-204-5p和ZEB1 3'UTR特异性结合。RT-qPCR测定进一步揭示，与邻近的正常组织相比，BC组织中ZEB1表达显著上调(图5D)。ZEB1在MCF-7和MDA-MB-231细胞中的表达显著高于在MCF-10A中的表达(图5E)。相关分析显示miR-204-5p表达量与BC组织中的ZEB1的mRNA的表达量呈负相关(图5F)。此外，我们通过过表达miR-204-5p检测到ZEB1蛋白表达，WB测定进一步显示miR-204-5p过表达的MCF-7和MDA-MB-231细胞中ZEB1表达水平显著降低(图5G)。这些数据结果表明ZEB1是miR-204-5p的靶标。
2.5.ZEB1逆转了miR-204-5p的抑制作用，促进了BC细胞的增殖，迁移和侵袭
为了进一步验证miR-204-5p是否通过调节ZEB1来影响BC细胞的增殖，迁移和侵袭，分别用miR-NC，miR-204-5p mimics，miR-204-5p mimics+pcDNA或miR-204-5p mimics+ZEB1转染MCF-7和MDA-MB-231细胞系。CCK-8显示miR-204-5p mimics的添加显著抑制细胞的增殖能力，而添加ZEB1后，增殖能力恢复(图6A和图6B)。miR-204-5p的过表达显著抑制BC细胞的迁移和侵袭速率，而添加ZEB1后，BC细胞的迁移和侵袭得到恢复(图6C和图6D)。此外，p-AKT测定显示，ZEB1的表达恢复了miR-204-5p对AKT信号传导途径的抑制(图6E)。数据表明，ZEB1显著增强BC细胞的增殖，迁移和侵袭，并激活AKT信号通路。
2.6.HOTAIR通过减轻miR-204-5p介导的BC细胞对ZEB1的抑制作用来促进ZEB1的表达
接下来，我们进一步验证了ZEB1mRNA和蛋白表达水平与HOTAIR敲除或miR-204-5p的抑制三者之间的关系。在HOTAIR沉默的BC细胞中ZEB1mRNA水平显著降低，并且miR-204-5p抑制剂的引入消除了MCF-7和MDA-MB-231细胞中HOTAIR敲除介导的ZEB1下调(图7A)。蛋白表达水平与mRNA表达水平一致(图7B)。
实施例3 sh-HOTAIR通过调节miR-204-5p/ZEB1轴减弱MCF-7移植瘤的生长
在本实施例中，进行小鼠体内试验以验证HOTAIR对肿瘤的作用。本实验经汕头市中心医院动物研究委员会批准，按照国家动物保护与伦理研究所的指导方针进行。18只1个月大的BALB/c裸鼠(雄性)购自北京维通利华实验动物技术有限公司，并随机分为三个实验组，用sh-HOTAIR转染的MCF-7细胞(sh-HOTAIR组)、由GeneCopoeia(Rockville，MD，USA)构建的阴性对照(sh-NC)转染MCF-7细胞(sh-NC组)以及不做任何处理的空白组。每周用小鼠皮下稳定转染的细胞(5×106)监测肿瘤体积。计算公式为：V(mm3)＝d2×l/2。4周后处死小鼠并取出肿瘤样品用于进一步的分子研究。
结果显示，接种5周后，sh-HOTAIR组的肿瘤体积和重量显著小于sh-NC组(图8A和图8B)。然后，我们对肿瘤组织的mRNA和蛋白质进行了检测。结果显示，与sh-NC组相比，sh-HOTAIR组中HOTAIR的表达显著降低(图8C)，miR-204-5p的表达水平显著增加(图8D)。另外，在sh-HOTAIR转染的MCF-7细胞诱导的异种移植组织中，ZEB1的丰度显著降低(图8E)。同时，p-AKT的检测表明sh-HOTAIR抑制AKT信号传导途径的活性(图8F)。
本发明中通过测定HOTAIR、miR-204-5p、ZEB1在BC组织和细胞中表达水平，得出，与正常人体的组织或细胞相比，在乳腺癌患者的组织或细胞中，HOTAIR的表达量上调，miR-204-5p的表达量下调，ZEB1的表达量上调，HOTAIR的表达量与miR-204-5p的表达量呈负相关，miR-204-5p的表达量与ZEB1的表达量呈负相关，ZEB1的表达量与HOXTAIR的表达量呈正相关。相互关联的多种分子标记相结合，可提高乳腺癌的诊断、预后和检测的准确度。
本发明中应用双荧光素酶报告基因测定法检查HOTAIR和miR-204-5p或miR-204-5p和ZEB1之间的靶标关系。细胞计数试剂盒-8(CCK-8)和Transwell试验用于检测细胞增殖，迁移和侵袭率。通过蛋白质印迹(WB)证实ZEB1，AKT和p-AKT的蛋白质水平。结果显示，miR-204-5p是乳腺癌细胞中HOXTAIR的下游靶基因，ZEB1是miR-204-5p的靶标，HOTAIR促进BC细胞的增殖，迁移和入侵，miR-204-5p在BC组织和细胞中起到肿瘤抑制剂的作用，ZEB促进细胞增殖，迁移，侵袭和BC细胞AKT信号通路的活性。HOTAIR的敲除抑制乳腺癌细胞的增殖，迁移，侵袭和AKT信号通路的活性，抑制miR-204-5p可以逆转HOTAIR基因敲除对细胞增殖，抗迁移和抗侵袭的影响，ZEB1的过表达逆转了HOTAIR敲除对BC细胞增殖，迁移和侵袭的影响，并激活了AKT信号通路。该结果为BC研究提供了一些潜在的治疗靶点，为我们探索lncRNA-miRNA功能网络在癌症中的作用提供了基础。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 汕头大学医学院第一附属医院
汕头朝南民生医院
<120> 用于制备检测、预后和诊断乳腺癌产品的分子标记物及试剂盒
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2158
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
gacucgccug ugcucuggag cuugauccga aagcuuccac agugaggacu gcuccguggg 60
gguaagagag caccaggcac ugaggccugg gaguuccaca gaccaacacc ccugcuccug 120
gcggcuccca cccggggcuu agacccucag gucccuaaua ucccggaggu gcucucaauc 180
agaaaggucc ugcuccgcuu cgcaguggaa uggaacggau uuagaagccu gcaguagggg 240
aguggggagu ggagagaggg agcccagagu uacagacggc ggcgagagga aggaggggcg 300
ucuuuauuuu uuuaaggccc caaagagucu gauguuuaca agaccagaaa ugccacggcc 360
gcguccuggc agagaaaagg cugaaaugga ggaccggcgc cuuccuuaua aguaugcaca 420
uuggcgagag aauuaagugc ugcaaccuaa accagcaauu acacccaagc ucguuggggc 480
cuaagccagu accgaccugg uagaaaaagc aaccacgaag cuagagagag agccagagga 540
gggaagagag cgccagacga aggugaaagc gaaccacgca gagaaaugca ggcaagggag 600
caaggcggca guucccggaa caaacguggc agagggcaag acgggcacuc acagacagag 660
guuuauguau uuuuauuuuu uaaaaucuga uuugguguuc caugaggaaa agggaaaauc 720
uagggaacgg gaguacagag agaauaaucc ggguccuagc ucgccacaug aacgcccaga 780
gaacgcugga aaaaccugag cgggugccgg ggcagcaccc ggcucggguc agccacugcc 840
ccacaccggg cccaccaagc cccgccccuc gcggccaccg gggcuuccuu gcucuucuua 900
ucaucuccau cuuuaugaug aggcuuguua acaagaccag agagcuggcc aagcaccucu 960
aucucagccg cgcccgcuca gccgagcagc ggucgguggg gggacuggga ggcgcuaauu 1020
aauugauucc uuuggacugu aaaauauggc ggcgucuaca cggaacccau ggacucauaa 1080
acaauauauc uguugggcgu gagugcacug ucucucaaau aauuuuucca uaggcaaaug 1140
ucagaggguu cuggauuuuu aguugcuaag gaaagaucca aaugggacca auuuuaggag 1200
gcccaaacag aguccguuca gugucagaaa augcuucccc aaaggguugg caguguguuu 1260
uguuggaaaa aagcuugggu uauaggaaag ccuuucccug cuacuugugu agacccagcc 1320
caauuuaaga auuacaagga agcgaagggg uuguguaggc cggaagccuc ucugucccgg 1380
cuggaugcag gggacuugag cugcuccgga auuugagagg aacauagaag caaaggucca 1440
gccuuugcuu cgugcugauu ccuagacuua agauucaaaa acaaauuuuu aaaagugaaa 1500
ccagcccuag ccuuuggaag cucuugaagg uucagcaccc acccaggaau ccaccugccu 1560
guuacacgcc ucuccaagac acaguggcac cgcuuuucua acuggcagca cagagcaacu 1620
cuauaauaug cuuauauuag gucuagaaga augcaucuug agacacaugg guaaccuaau 1680
uauauaaugc uuguuccaua caggagugau uaugcagugg gacccugcug caaacgggac 1740
uuugcacucu aaauauaggc cccagcuugg gacaaaaguu gcaguagaaa aauagacaua 1800
ggagaacacu uaaauaagug augcauguag acacagaagg gguauuuaaa agacagaaau 1860
aauagaagua cagaagaaca gaaaaaaaau cagcagaugg agauuaccau ucccaaugcc 1920
ugaacuuccu ccugcuauua agauugcuag agaauugugu cuuaaacagu ucaugaaccc 1980
agaagaacgc aauuucaaug uauuuaguac acacacagua uguauauaaa cacaacucac 2040
agaauauauu uuccauacau uggguaggua ugcacuuugu guauauauaa uaauguauuu 2100
uccaugcagu uuuaaaaugu agauauauua auaucuggau gcauuuucaa aaaaaaaa 2158
<210> 2
<211> 110
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
ggcuacaguc uuucuucaug ugacucgugg acuucccuuu gucauccuau gccugagaau 60
auaugaagga ggcugggaag gcaaagggac guucaauugu caucacuggc 110
<210> 3
<211> 1059
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Met Ala Asp Gly Pro Arg Cys Lys Arg Arg Lys Gln Ala Asn Pro Arg
1 5 10 15
Arg Asn Asn Val Thr Asn Tyr Asn Thr Val Val Glu Thr Asn Ser Asp
20 25 30
Ser Asp Asp Glu Asp Lys Leu His Ile Val Glu Glu Glu Ser Val Thr
35 40 45
Asp Ala Ala Asp Cys Glu Gly Val Pro Glu Asp Asp Leu Pro Thr Asp
50 55 60
Gln Thr Val Leu Pro Gly Arg Ser Ser Glu Arg Glu Gly Asn Ala Lys
65 70 75 80
Asn Cys Trp Glu Asp Asp Arg Lys Glu Gly Gln Glu Ile Leu Gly Pro
85 90 95
Asp Ala Gln Ala Asp Glu Ala Gly Cys Thr Val Lys Asp Asp Glu Cys
100 105 110
Glu Ser Asp Ala Glu Asn Glu Gln Asn His Asp Pro Asn Val Glu Glu
115 120 125
Phe Leu Gln Gln Gln Asp Thr Ala Val Ile Phe Pro Glu Ala Pro Glu
130 135 140
Glu Asp Gln Arg Gln Gly Thr Pro Glu Ala Ser Gly His Asp Glu Asn
145 150 155 160
Gly Thr Pro Asp Ala Phe Ser Gln Leu Leu Thr Cys Pro Tyr Cys Asp
165 170 175
Arg Gly Tyr Lys Arg Phe Thr Ser Leu Lys Glu His Ile Lys Tyr Arg
180 185 190
His Glu Lys Asn Glu Asp Asn Phe Ser Cys Ser Leu Cys Ser Tyr Thr
195 200 205
Phe Ala Tyr Arg Thr Gln Leu Glu Arg His Met Thr Ser His Lys Ser
210 215 220
Gly Arg Asp Gln Arg His Val Thr Gln Ser Gly Cys Asn Arg Lys Phe
225 230 235 240
Lys Cys Thr Glu Cys Gly Lys Ala Phe Lys Tyr Lys His His Leu Lys
245 250 255
Glu His Leu Arg Ile His Ser Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys Pro Asn
260 265 270
Cys Lys Lys Arg Phe Ser His Ser Gly Ser Tyr Ser Ser His Ile Ser
275 280 285
Ser Lys Lys Cys Ile Ser Leu Ile Pro Val Asn Gly Arg Pro Arg Thr
290 295 300
Gly Leu Lys Thr Ser Gln Cys Ser Ser Pro Ser Leu Ser Ala Ser Pro
305 310 315 320
Gly Ser Pro Thr Arg Pro Gln Ile Arg Gln Lys Ile Glu Asn Lys Pro
325 330 335
Leu Gln Glu Gln Leu Ser Val Asn Gln Ile Lys Thr Glu Pro Val Asp
340 345 350
Tyr Glu Phe Lys Pro Ile Val Val Ala Ser Gly Ile Asn Cys Ser Thr
355 360 365
Pro Leu Gln Asn Gly Val Phe Thr Gly Gly Gly Pro Leu Gln Ala Thr
370 375 380
Ser Ser Pro Gln Gly Met Val Gln Ala Val Val Leu Pro Thr Val Gly
385 390 395 400
Leu Val Ser Pro Ile Ser Ile Asn Leu Ser Asp Ile Gln Asn Val Leu
405 410 415
Lys Val Ala Val Asp Gly Asn Val Ile Arg Gln Val Leu Glu Asn Asn
420 425 430
Gln Ala Asn Leu Ala Ser Lys Glu Gln Glu Thr Ile Asn Ala Ser Pro
435 440 445
Ile Gln Gln Gly Gly His Ser Val Ile Ser Ala Ile Ser Leu Pro Leu
450 455 460
Val Asp Gln Asp Gly Thr Thr Lys Ile Ile Ile Asn Tyr Ser Leu Glu
465 470 475 480
Gln Pro Ser Gln Leu Gln Val Val Pro Gln Asn Leu Lys Lys Glu Asn
485 490 495
Pro Val Ala Thr Asn Ser Cys Lys Ser Glu Lys Leu Pro Glu Asp Leu
500 505 510
Thr Val Lys Ser Glu Lys Asp Lys Ser Phe Glu Gly Gly Val Asn Asp
515 520 525
Ser Thr Cys Leu Leu Cys Asp Asp Cys Pro Gly Asp Ile Asn Ala Leu
530 535 540
Pro Glu Leu Lys His Tyr Asp Leu Lys Gln Pro Thr Gln Pro Pro Pro
545 550 555 560
Leu Pro Ala Ala Glu Ala Glu Lys Pro Glu Ser Ser Val Ser Ser Ala
565 570 575
Thr Gly Asp Gly Asn Leu Ser Pro Ser Gln Pro Pro Leu Lys Asn Leu
580 585 590
Leu Ser Leu Leu Lys Ala Tyr Tyr Ala Leu Asn Ala Gln Pro Ser Ala
595 600 605
Glu Glu Leu Ser Lys Ile Ala Asp Ser Val Asn Leu Pro Leu Asp Val
610 615 620
Val Lys Lys Trp Phe Glu Lys Met Gln Ala Gly Gln Ile Ser Val Gln
625 630 635 640
Ser Ser Glu Pro Ser Ser Pro Glu Pro Gly Lys Val Asn Ile Pro Ala
645 650 655
Lys Asn Asn Asp Gln Pro Gln Ser Ala Asn Ala Asn Glu Pro Gln Asp
660 665 670
Ser Thr Val Asn Leu Gln Ser Pro Leu Lys Met Thr Asn Ser Pro Val
675 680 685
Leu Pro Val Gly Ser Thr Thr Asn Gly Ser Arg Ser Ser Thr Pro Ser
690 695 700
Pro Ser Pro Leu Asn Leu Ser Ser Ser Arg Asn Thr Gln Gly Tyr Leu
705 710 715 720
Tyr Thr Ala Glu Gly Ala Gln Glu Glu Pro Gln Val Glu Pro Leu Asp
725 730 735
Leu Ser Leu Pro Lys Gln Gln Gly Glu Leu Leu Glu Arg Ser Thr Ile
740 745 750
Thr Ser Val Tyr Gln Asn Ser Val Tyr Ser Val Gln Glu Glu Pro Leu
755 760 765
Asn Leu Ser Cys Ala Lys Lys Glu Pro Gln Lys Asp Ser Cys Val Thr
770 775 780
Asp Ser Glu Pro Val Val Asn Val Ile Pro Pro Ser Ala Asn Pro Ile
785 790 795 800
Asn Ile Ala Ile Pro Thr Val Thr Ala Gln Leu Pro Thr Ile Val Ala
805 810 815
Ile Ala Asp Gln Asn Ser Val Pro Cys Leu Arg Ala Leu Ala Ala Asn
820 825 830
Lys Gln Thr Ile Leu Ile Pro Gln Val Ala Tyr Thr Tyr Ser Thr Thr
835 840 845
Val Ser Pro Ala Val Gln Glu Pro Pro Leu Lys Val Ile Gln Pro Asn
850 855 860
Gly Asn Gln Asp Glu Arg Gln Asp Thr Ser Ser Glu Gly Val Ser Asn
865 870 875 880
Val Glu Asp Gln Asn Asp Ser Asp Ser Thr Pro Pro Lys Lys Lys Met
885 890 895
Arg Lys Thr Glu Asn Gly Met Tyr Ala Cys Asp Leu Cys Asp Lys Ile
900 905 910
Phe Gln Lys Ser Ser Ser Leu Leu Arg His Lys Tyr Glu His Thr Gly
915 920 925
Lys Arg Pro His Glu Cys Gly Ile Cys Lys Lys Ala Phe Lys His Lys
930 935 940
His His Leu Ile Glu His Met Arg Leu His Ser Gly Glu Lys Pro Tyr
945 950 955 960
Gln Cys Asp Lys Cys Gly Lys Arg Phe Ser His Ser Gly Ser Tyr Ser
965 970 975
Gln His Met Asn His Arg Tyr Ser Tyr Cys Lys Arg Glu Ala Glu Glu
980 985 990
Arg Asp Ser Thr Glu Gln Glu Glu Ala Gly Pro Glu Ile Leu Ser Asn
995 1000 1005
Glu His Val Gly Ala Arg Ala Ser Pro Ser Gln Gly Asp Ser Asp Glu
1010 1015 1020
Arg Glu Ser Leu Thr Arg Glu Glu Asp Glu Asp Ser Glu Lys Glu Glu
1025 1030 1035 1040
Glu Glu Glu Asp Lys Glu Met Glu Glu Leu Gln Lys Lys Lys Lys Lys
1045 1050 1055
Lys Lys Lys
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cagtggggaa ctctgactcg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtgcctggtg ctctcttacc 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gccaataagc aaacgattct g 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tttggctgga tcactttcaa g 21

Claims (8)

1.一种用于制备检测、预后和诊断乳腺癌产品的分子标记物，其特征在于：所述分子标记物包括HOTAIR、miR-204-5p、ZEB1中的一种或多种，所述HOTAIR具有如SEQ ID:1所示序列，所述miR-204-5p具有如SEQ ID:2所示序列，所述ZEB1具有如SEQ ID:3所示序列。
2.如权利要求1所述的用于制备检测、预后和诊断乳腺癌产品的分子标记物，其特征在于：与正常人体的组织或细胞相比，在乳腺癌患者的组织或细胞中，所述HOTAIR的表达量上调，所述miR-204-5p的表达量下调，所述ZEB1的表达量上调，所述HOTAIR的表达量与所述miR-204-5p的表达量呈负相关，所述miR-204-5p的表达量与所述ZEB1的表达量呈负相关，所述ZEB1的表达量与所述HOXTAIR的表达量呈正相关。
3.如权利要求1所述的用于制备检测、预后和诊断乳腺癌产品的分子标记物，其特征在于：所述miR-204-5p是乳腺癌细胞中所述HOXTAIR的下游靶基因。
4.如权利要求1所述的用于制备检测、预后和诊断乳腺癌产品的分子标记物，其特征在于：所述ZEB1是所述miR-204-5p的靶标。
5.一种用于检测、预后和诊断乳腺癌的试剂盒，其特征在于：包括定量HOTAIR、miR-204-5p或ZEB1表达量的试剂。
6.如权利要求5所述的用于检测、预后和诊断乳腺癌的试剂盒，其特征在于：所述定量HOTAIR、miR-204-5p或ZEB1表达量的试剂包括HOTAIR或ZEB1的cDNA扩增引物，所述HOTAIR的cDNA扩增引物包括如SEQ ID:4所示的上游引物和如SEQ ID:5所示的下游引物，所述ZEB1的cDNA扩增引物包括如SEQ ID:6所示的上游引物和如SEQ ID:7所示的下游引物。
7.一种用于预后和治疗乳腺癌的药物，其特征在于：包括能够抑制HOTAIR表达的药剂或能使miR-204-5p表达的药剂。
8.如权利要求7所述的用于预后和治疗乳腺癌的药物，其特征在于：所述能够抑制HOTAIR表达的药剂包括抑制HOTAIR表达的siRNA或shRNA。
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