CN105274110A - 非小细胞肺癌转移及预判其转移风险的miRNA标记物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了miR-340在作为检测非小细胞肺癌转移标记物，或作为预判非小细胞肺癌转移风险标记物，或作为非小细胞肺癌耐药标记物中的应用。本发明发现所述miR-340可靶向下调死亡相关蛋白激酶的表达水平，而死亡相关蛋白激酶与非小细胞肺癌的转移和耐药密切相关。miR-340表达增加预示非小细胞肺癌转移的几率增加，引发耐药，预后不良。在此基础上，miR-340还可以用作为抑制/预防非小细胞肺癌粘附或侵袭，或抑制/预防非小细胞肺癌耐药的靶点，并进一步推广应用到其他肿瘤细胞的防治和预后。本发明为临床在分子水平上诊断非小细胞肺癌转移和耐药提供了新的诊断工具，同时为非小细胞肺癌转移的基因治疗提供了新的药物靶点。

Description

非小细胞肺癌转移及预判其转移风险的miRNA标记物

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地，涉及非小细胞肺癌转移及预判其转移风险的miRNA标记物。

背景技术

非小细胞肺癌是一类严重威胁人类生命健康症情复杂的疾病，几乎人体的所有部位、组织、脏器均可发病。非小细胞肺癌的治疗是一种多学科的综合治疗，其中化疗为治疗的重要手段之一，但非小细胞肺癌耐药性和非小细胞肺癌转移是非小细胞肺癌患者总体生存率不高的原因。缺乏有效的针对非小细胞肺癌转移和耐药的早期诊断和治疗手段是目前防治中的瓶颈。

死亡相关蛋白激酶是一种存在于细胞质中的钙离子/钙调蛋白依赖性的丝氨酸/苏氨酸激酶，蛋白质分子量为160kDa。死亡相关蛋白激酶含多个功能结构域:典型的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域；钙离子/钙调蛋白调节结构域；含8个锚定重复序列的结构域；Ras蛋白质复合体-Ras蛋白质复合体C末端结构域（ROC-CORdomain,Rasofcomplexproteins-C-terminalofROCdomain）；死亡相关蛋白激酶在C-末端含一个典型的死亡结构域，死亡结构域后的C-末端是一17个氨基酸残基组成的富含Ser残基区域，该区域是DAPK激酶活性的负调控结构域。死亡相关蛋白激酶参与细胞多种生理和病理过程：凋亡、自噬、糖代谢、免疫反应、非小细胞肺癌转移、tau蛋白病、细胞转化等等。死亡相关蛋白激酶不仅是多种因素诱导细胞凋亡信号的汇合点，还参与内质网应激^[10]、调节细胞自噬过程和调节糖代谢，这提示死亡相关蛋白激酶参与细胞应激反应，维持细胞内环境的稳定。文献报道显示死亡相关蛋白激酶表达降低可增加非小细胞肺癌转移和耐药的能力。

miRNA是细胞内基因转录编辑成的21-22nt的RNA分子，这些RNA分子不翻译成蛋白质，但miRNA通过转录后基因沉默对相应的靶基因表达进行调节。据估计，生物体内约有1／3的基因受miRNA的调控。miRNA与RISC的复合体通过碱基配对可与靶基因mRNA5^／-UTR或者3^／-UTR中的互补序列相结合，抑制蛋白质翻译，或是引发mRNA降解，从而负调控靶基因的表达。miRNA作为细胞重要的基因调控分子，与非小细胞肺癌的关系备受关注。随着miRNA芯片技术的发展，现已明确在非小细胞肺癌细胞中存在多种miRNA的异常表达或缺失，推断miRNA很可能是一类新的癌基因或抑癌基因，miRNA己经成为研究非小细胞肺癌发生发展机制的一个新领域，某些在非小细胞肺癌中异常表达的miRNA被证实与非小细胞肺癌对某些药物耐受和加速非小细胞肺癌转移有关。

检测miRNA的表达水平可以为癌症的临床诊断提供参考。而miRNA的异常表达直接导致一些与癌症发生相关基因的表达异常，诱导癌症的发生，发展，转移和耐药。在未来临床诊疗中，miRNA不仅可以成为新的非小细胞肺癌早期诊断和癌症进程相关的标记物，而且也有望通过改变miRNA的表达或者其靶基因的表达治疗非小细胞肺癌。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了miR-340在作为检测非小细胞肺癌转移标记物，或作为预判非小细胞肺癌转移风险标记物，或作为非小细胞肺癌耐药标记物中的应用。本发明发现所述miR-340可靶向下调死亡相关蛋白激酶的表达水平，而死亡相关蛋白激酶与非小细胞肺癌的转移和耐药密切相关。miR-340表达增加预示非小细胞肺癌转移的几率增加，引发耐药，预后不良。在此基础上，miR-340还可以用作为抑制/预防非小细胞肺癌粘附或侵袭，或预防非小细胞肺癌耐药的靶点，并进一步推广应用到其他肿瘤细胞的防治和预后。

本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。

miR-340在作为检测非小细胞肺癌转移标记物，或作为预判非小细胞肺癌转移风险标记物，或作为非小细胞肺癌耐药标记物中的应用。

miR-340在作为抑制或预防非小细胞肺癌转移靶点，或作为抑制或预防非小细胞肺癌耐药靶点中的应用。

miR-340在制备抑制非小细胞肺癌转移制剂，或制备预防非小细胞肺癌转移制剂，或制备预判非小细胞肺癌转移风险制剂，或制备预防非小细胞肺癌耐药制剂，或制备抑制或预防非小细胞肺癌粘附或侵袭制剂中的应用。

miR-340在制备包含上述一种或多种制剂的产品中的应用。所述产品可以是试剂盒，基因芯片。

miR-340在制备靶向上调死亡相关蛋白激酶表达药物中的应用。

本发明还提供了上述miR-340在高通量测序平台中的应用。通过高通量测序能获知待测样本非小细胞肺癌组织或血清或血浆中miR-340的表达水平，将待测样本的结果同未发生转移的非小细胞肺癌组织或血清或血浆相比，容易判断待测样本是否存在转移的风险或者容易判断待测样本是否已经发生了转移、或者判断非小细胞肺癌转移是否复发。

本发明发现，在已知的各种miRNA中，只有miR-340具有靶向下调DAPK的功能，而DAPK高表达是可以抑制肺癌转移的，从而发现可以通过检测miR-340表达来预测DAPK表达，达到预测肺癌患者预后的情况。

本发明的实验证明miR-340的表达水平高有利于肺癌发生转移和产生耐药，可以通过判断miR-340的表达水平推断肺腺癌细胞转移和耐药的风险高或者已经发生了转移，从而采取预防肺腺癌细胞转移的方案或者为临床治疗方案的制定提供诊断基础。

本发明的实验证明miR-340与非小细胞肺癌的转移相关，在此基础上，通过抑制miR-340的表达可用于抑制非小细胞肺癌的粘附、转移或侵袭或者降低非小细胞肺癌粘附、转移和侵袭的风险。

优选地，所述miR-340为miR-340初始miRNA、miR-340前体miRNA或miR-340成熟miRNA中的一种或多种。所述miR-340初始miRNA能在人细胞内被剪切并表达成成熟miR-340。

优选地，所述miR-340包括该核酸分子的功能等同体，所述功能等同体由miR-340序列通过核苷酸残基的缺失、置换或插入得到，或者是对miR-340序列进行碱基修饰或在序列的一端或两端增加碱基得到。所述功能等同体，即变体，其显示完整miR-340核酸分子相同的功能，尽管它们通过核苷酸残基的缺失、置换或插入而突变。另外，为了保证miRNA的稳定性，可以在miRNA的一端或者两端增加保护性碱基，如TT，也可对miRNA碱基进行修饰，但是不影响miRNA的功能。因此，本领域技术人员熟知，在不影响miR-340功能的条件下，对miR-340进行碱基修饰或者在一端或两端增加碱基获得的序列同样包含在所述功能等同体的范围内。

本发明具体实施方式中，所述miR-340是成熟miRNA。所述成熟miRNA包括miR-340-3p和miR-340-5p，它们共同享有的种子序列是miR-340。虽然在具体实施方式中所使用的是成熟miR-340，但是本领域技术人员可以预期，初始miRNA（pi-miR-340）、前体miRNA（pre-miR-340）将可以获得与成熟hsa-miR-340-3p和hsa-miR-340-5p同样的技术效果，因为细胞有能力进一步将初始miRNA（pi-miR-340），前体miRNA（pre-miR-340）加工为成熟miR-340。

本发明所述miR-340核酸分子以单链或双链的形式存在。成熟的miR-340主要是单链形式，而miR-340前体是部分自互补的，以形成双链结构。本发明的miR-340核酸分子为RNA、DNA、PNA或LNA的形式。

优选地，所述制剂内包括检测miR-340表达水平的试剂。

优选地，所述试剂包括针对miR-340的引物和/或探针。包括现有技术中已经报道的可用于判断非小细胞肺癌是否发生转移，或者判断非小细胞肺癌转移风险，或者判断非小细胞肺癌转移是否复发的miRNA的引物和/或探针。将多种miRNA的检测引物和/或探针放置在同一试剂盒中通过检测多种miRNA指标联合判断非小细胞肺癌转移的情况也包含在本发明的保护范围之内。

优选地，所述产品为芯片或试剂盒；其中，所述芯片包括固相载体，以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针。所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于miR-340的部分或全部序列，还可包括现有技术中已经报道的可用于判断非小细胞肺癌是否发生转移或者判断非小细胞肺癌转移风险或者判断非小细胞肺癌转移是否复发的miRNA的寡核苷酸探针。将多种miRNA的检测探针放置在同一芯片上通过检测多种miRNA指标联合判断非小细胞肺癌转移的情况也包含在本发明的保护范围之内。

所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，优选地，所述固相载体为尼龙膜，经活性基团修饰的玻片或硅片，未修饰的玻片、塑料片；更优选地，所述活性基团为醛基或/和氨基。

所述的miRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法，例如，如果固相载体采用修饰玻片或硅片，探针的5^/端含有氨基修饰的，优选地，将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或者硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。

所述试剂盒包括用于检测受试者非小细胞肺癌组织中miR-340的表达水平的试剂。与未发生转移的非小细胞肺癌组织中的miR-340的表达水平比较，若通过试剂盒检测非小细胞肺癌组织中miR-340的表达水平显著升高，则判断该受试者的非小细胞肺癌转移风险很高或者已经发生转移，或者再次发生转移。

本发明的miR-340为天然或人工合成，或者使用可以表达miR-340的DNA片段的载体转染细胞获得。所述可以表达miR-340的DNA片段可以通过如下方式获取：从miRNA数据库中（http://infororna.sanger.ac.ok/sequences/）寻找miR-340在基因组上的位置及具体序列信息，根据基因组序列确定miRNA-2116初始miRNA的位置，在miR-340初始miRNA位置的上下游500-800bp区间内设计特异性引物，扩增引物中间的序列即可获得表达miR-340的DNA片段。

所述载体包括病毒载体、真核载体。

优选地，所述病毒载体为逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、疱疹病毒（例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）载体或卫病毒载体。

优选地，所述真核表达载体为pCMV-Myc表达载体、pcDNA3.0表达载体、pcDNA3.1表达载体、pEGFP表达载体、pEFBos表达载体、pTot表达载体或pTRF表达载体；或者在现有市面上的表达载体的基础上经改造的载体，优选地，为pRin138或pCAMBTA1301。

优选地，所述药物包含miR-340抑制剂。所述miR-340抑制剂能够抑制miR-340的表达或者能够抑制miR-340的功能。所述miR-340抑制剂的抑制靶标不限于miR-340本身，还包括miR-340的上下游，例如：编码miR-340的基因组系列，miR-340靶基因、调控miR-340的蛋白或者基因。优选地，miR-340抑制剂包括蛋白、寡核苷酸、小分子化合物。

优选地，所述miR-340抑制剂是miR-340的反义寡核苷酸或者miR-340模拟物。根据miR-340序列容易设计出它的反义寡核苷酸，将反义寡核苷酸转移到人体内后，它们能够明显下调miR-340的表达。反义寡核苷酸（antisonso-oligonuclcotides,AS-Oms或ASO）又称为反义寡核苷酸，是指长度约为18-26nt(更特别的约19-22nt)的DNA分子或RNA分子或其类似物。

所述反义核苷酸还包括采用如基于核酸锁或核酸链骨架修饰技术等手段获得的经修饰的反义核苷酸，所述的修饰基本不改变反义核苷酸的活性。优选地，所述修饰可提高反义寡核苷酸的稳定性、活性或治疗效果。核苷酸（lockednucleicacidLNA）通常是指通过一个亚甲基桥将核苷酸的2^/氧原子和4^/碳原子连接起来的修饰技术。基于核酸链骨架的修饰技术发展出的反义药物在可溶性，抗核酸酶降解等方面大有改善，且易于大量合成。寡核苷酸的骨架修饰方法有多种，包括硫代法，例如将脱氧核苷酸链硫代修饰为硫代脱氧核苷酸链。该方法是将DNA骨架上的磷酸链的氯原子用硫原子替代，可抵抗核酸酶降解，应理解，任何能够保持所述反义寡核苷酸的大部分或全部活性的修饰都包含在本发明中。

所述药物还包括药物学上可以接受的载体，所述载体优选：稀释剂、缓冲剂、湿悬剂、乳剂颗粒剂、包裹剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矮味剂或吸附载体。

优选地，将所述药物制成显微注射剂、适于转染的剂型、注射液、片剂、粉剂、粒剂或胶囊剂。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

所述药物可以单独施用，或者与其他能够抑制非小细胞肺癌转移的药物进行组合施用。

所述制剂可以离体施用：将miR-340或者miR-340的表达载体在体外导入或转染人体自身或异体细胞（或异种细胞），经过体外细胞扩增后，输入人体。

所述制剂可以体内施用：将miR-340或者miR-340的表达载体直接导入体内。这种载体可以是病毒型或非病毒性，甚至是裸DNA或RNA。

miR-340成熟序列：uccgucucaguuacuuuauagc

anti-miR-340序列：gcuauaaaguaacugagacgga

与现有技术相比，本发明有益效果在于：本发明公开了miR-340在制备非小细胞肺癌转移或预判非小细胞肺癌转移的标记物中的应用，本发明发现所述miR-340可靶向下调死亡相关蛋白激酶的表达水平，而死亡相关蛋白激酶与非小细胞肺癌的转移和耐药密切相关。因此miR-340的表达水平可用于判断非小细胞肺癌是否发生转移，或者预判非小细胞肺癌转移风险，或对化疗耐药。经实验证明，miR-340可促进非小细胞肺癌细胞转移和抵抗化疗。miR-340表达增加预示非小细胞肺癌转移的几率增加，引发耐药，预后不良。在此基础上，miR-340还可以用作为制备抑制非小细胞肺癌转移或预防非小细胞肺癌转移或非小细胞肺癌耐药的靶点，并进一步推广应用到其他肿瘤细胞的防治和预后。本发明为临床在分子水平上诊断非小细胞肺癌转移和耐药提供了新的诊断方法，同时为非小细胞肺癌转移的基因治疗提供了新的药物靶点。

附图说明

图1为实施例2中anti-miR-340拮抗miR-340表达。

图2为实施例3中miR-340靶向干扰DAPK表达。

图3为实施例4中miRNA对A549细胞粘附能力的影响。

图4为实施例5中miR-340对细胞迁移的影响。

图5为实施例6中miR-340对细胞侵袭的影响。

图6为实施例7中miR-340影响A549细胞对顺铂敏感。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

肺腺癌细胞株：将肺腺癌细胞株A549于RPMI1640培养基和10%胎牛血清中培养，置于37℃、5%CO₂培养箱中，待用。

miR-340：在miRNA数据库（http://www.sanger.ac.uk）中找到miR-340的序列信息，根据miR-340的序列信息委托上海生物工程有限公司设计合成miR-340和其反义寡核苷酸（anti-miR-340）及随机对照序列。

miR-340序列：UUGUACCUGGUGUGAUUAUAAAGCAAUGAGACUGAUUGUCAUAUGUCGUUUGUGGGAUCCGUCUCAGUUACUUUAUAGCCAUACCUGGUAUCUUA

anti-miR-340序列：gcuauaaaguaacugagacgga

实施例1细胞转染

将A549细胞分组，分别为抑制阴性对照组（anti-NC），miR-340抑制组（anti-miR-340）和miR-340组，将抑制阴性对照组及miR-340抑制组分别转染anti-NC和anti-miR-340，采用常规方法运用转染试剂进行转染，转染48h后搜集各组细胞用于后续实验。

实施例2QPCR实验

向实施例1得到的各组细胞中分别加入适量Trizol（6孔板每孔600μL，10cm培养皿1mLTrizol），反复吹打使细胞充分裂解，冰上或4℃再裂解10min，收集裂解液于无RNase的EP管中，短期保存可置于-20℃。

QPCR检测miR-340表达，结果如图1所示，与抑制阴性对照组anti-NC相比，miR-340抑制组（anti-miR-340）的miR-340的水平显著下降，表明anti-miR-340能够有效抑制miR-340的表达。

实施例3DAPK蛋白表达水平分析

将实施例2保存的细胞裂解液，按蛋白质免疫印迹要求提取供测试的蛋白质，采用蛋白免疫印迹方法检测DAPK、GAPDH的表达。结果如图2所示，结果表明：miR-340靶向干扰DAPK表达，而anti-miR-340可以抑制miR-340的功能，增加DAPK水平。

实施例4细胞粘附实验

将实施例1转染48h的A549细胞使用0.25%胰酶消化成细胞悬液，以5×10⁴个/ml接种于96孔细胞培养板，每孔0.1ml，60min后，37℃PBS洗去未粘附的细胞，MTT法测各孔490nm波长吸光度值。用光吸收值大小代表粘附细胞的相对数量。比较miR-340组、miR-340抑制组（anti-miR-340）和抑制阴性对照组（anti-NC）的吸光值，结果如图3所示，可以看出miR-340抑制组（anti-miR-340）光吸收值显著下降（p＜0.05）。上述实验结果表明anti-miR-340能够显著抑制A549细胞粘附能力，同时表明miR-340有利于A549细胞粘附。

实施例5迁移实验

将实施例1转染48h的A549细胞使用胰酶消化并计数，取10⁵个细胞置于1.5mlEP管中，加入200μL无血清培养基重悬细胞，加入transwell小室中，下层小室加入10%胎牛血清的培养基，放入37℃，5%CO₂培养箱培养24h。取transwell小室，用棉签擦涂里面的细胞，并用PBS轻轻洗掉里面剩余细胞。固定染色后显微镜下取8个随机视野计数，结果如图4所示。

结果显示：与抑制阴性对照组（anti-NC）相比，miR-340抑制组（anti-miR-340）穿过transwell小室基底膜的细胞减少，而miR-340明显促进细胞迁移。

实施例6侵袭实验

将实施例1转染48h的A549细胞使用胰酶消化并计数，取10⁵个细胞置于1.5mlEP管中，加入200μL无血清培养基重悬细胞，加入经过铺基质胶的transwell小室，下层小室加入10%FBS的培养基，放入37℃，5%CO₂培养箱培养24h。取transwell小室，用棉签擦涂里面的细胞，并用PBS轻轻洗掉里面剩余细胞。固定染色后显微镜下取8个随机视野计数，结果如图5所示。

结果显示：与抑制阴性对照组（anti-NC）相比，miR-340抑制组（anti-miR-340）穿过已经铺过基质胶的transwell小室基底膜的细胞减少，而miR-340明显促进细胞侵袭。

上述实验表明，anti-miR-340能够显著抑制A549细胞迁移，侵袭能力，同时表明miR-340均有利于A549细胞迁移，侵袭。

实施例7对顺铂敏感性实验

收集对数生长期细胞，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁵/ml，接种0.1ml细胞至96孔培养板上，置37℃、5%CO₂培养箱中培养24小时。按上述实验分组分别加入不同浓度的顺铂（0~10μmol/L），同样条件下培养24小时。24小时后每孔加入MTT，继续孵育4小时。弃掉培养基，用PBS洗三次。加入200μLDMSO。用酶标仪于570nm测定光吸收值，计算顺铂半数抑制浓度，结果如图6所示。

结果显示：与抑制阴性对照组（anti-NC）相比，miR-340组对顺铂不敏感，对顺铂抑制能力较弱；而miR-340抑制组（anti-miR-340）对顺铂敏感。

Claims (8)

1.miR-340在作为检测非小细胞肺癌转移标记物，或作为预判非小细胞肺癌转移风险标记物，或作为非小细胞肺癌耐药标记物中的应用。

2.miR-340在作为抑制或预防非小细胞肺癌转移靶点，或作为抑制或预防非小细胞肺癌耐药靶点中的应用。

3.miR-340在制备抑制非小细胞肺癌转移制剂，或制备预防非小细胞肺癌转移制剂，或制备预判非小细胞肺癌转移风险制剂，或制备预防非小细胞肺癌耐药制剂，或制备抑制或预防非小细胞肺癌粘附或侵袭制剂中的应用。

4.miR-340在制备靶向上调死亡相关蛋白激酶表达药物中的应用。

5.根据权利要求1~4任一项所述的应用，其特征在于，所述miR-340为miR-340初始miRNA、miR-340前体miRNA或miR-340成熟miRNA中的一种或多种。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述miR-340包括该核酸分子的功能等同体，所述功能等同体由miR-340序列通过核苷酸残基的缺失、置换或插入得到，或者是对miR-340序列进行碱基修饰或在序列的一端或两端增加碱基得到。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述制剂内包括检测miR-340表达水平的试剂。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述试剂包括针对miR-340的引物和/或探针。