CN107841560A - 一种非小细胞肺癌miRNA检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种非小细胞肺癌miRNA检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种非小细胞肺癌miRNA检测试剂盒，其包括miR‑146、miR‑340联合使用作为非小细胞肺癌分子标记物。涉及miR‑146、miR‑340和miR‑U6联合使用在制备非小细胞肺癌miRNA检测试剂盒中的应用，其中miR‑U6为内参；涉及一种非小细胞肺癌miRNA检测试剂盒，分别包括RCR反应体系(miR‑146、miR‑340的引物和通用引物)；内参体系(MIR‑U6的引物和通用引物)；逆转录体系(多聚腺苷酸聚合酶、反转录酶混合液、反转录缓冲液和无核酸酶双蒸水)。本发明非小细胞肺癌miRNA检测试剂盒检测快速方便、准确率高，可以实现非小细胞肺癌早期诊断及预测。

Description

一种非小细胞肺癌miRNA检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种用于检测非小细胞肺癌的靶向诊断技术，特别是一种用于检测非小细胞肺癌的miRNA检测试剂盒及其应用。
背景技术
非小细胞肺癌是一种常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率高居各癌症致死率之首。根据世界卫生组织报告，全球癌症死亡人数到2030年将超过1310万/年，全球每年死于非小细胞肺癌的患者达137万以上。非小细胞肺癌起病隐匿，大多在晚期才能被发现，其5年生存率约在15％左右。若能做到早期诊断，其生存率将被大大提高。
现有的临床诊断技术如X光、B超等无法做到在临床早期发现，而CT、MRI和PET等检查，可以发现更小的肿瘤组织，但其特异性低，仍需要病理活检的辅助才能明确诊断。纤支镜等内窥镜的使用可提高了非小细胞肺癌的诊断率，但均为介入性检查，对患者的损伤和痛苦大，且对操作者技术要求高，也并非肺内所有的部位都能取到活检，不适用于大规模的人群筛选普查。液体活检作为新型的检测手段，具有特异性高、无创、快捷等优点，是癌症检查发展的趋势与方向。
发明内容
本发明的一个目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种使用方便、快捷、特异性高、可作为非小细胞肺癌早期辅助诊断的miRNA检测试剂盒。
为此，本发明提供了一种非小细胞肺癌miRNA检测试剂盒，其包括miR-146和miR-340联合使用作为非小细胞肺癌分子标记物。
此外，本发明还提供了一种非小细胞肺癌miRNA检测试剂盒，其包括miR-146、miR-340和miR-U6，其中miR-U6作为内参。
此外，本发明还提供了一种非小细胞肺癌miRNA检测试剂盒，其包括荧光定量PCR反应体系、内参体系和逆转录反应体系。
在本发明的一个方面，所述荧光定量PCR反应体系中包括分别针对miR-146、miR-340的正向引物和反向通用引物。其中，针对所述miR-146的正向引物的核苷酸序列如SEQID No.3所示，针对所述miR-340的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，反向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID ID No.5所示。所述荧光定量PCR反应体系的试剂包括：SYBRGreen混合液、正向引物液、反向通用引物液和纯水。
所述内参体系包括内参miR-U6和针对miR-U6的正向引物、针对miR-U6的反向引物：针对miR-U6的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示：针对miR-U6的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
所述反转录反应体系的试剂包括多聚腺苷酸聚合酶、反转录酶混合液、反转录缓冲液和无核酸酶双蒸水。
上述荧光定量PCR反应体系的总体积为20μL：所述荧光定量PCR反应体系中还包括DNA模板：其中，所述SYBR Green混合液的体积是10μL，所述正向引物液的体积是0.5μL，所述反向通用引物液的体积是0.5μL，所述DNA模板2μL，无核酸酶双蒸水7μL：所述正向引物液的使用浓度为2μM，所述反向通用引物液的使用浓度为2μM：所述DNA模板是所述反转录反应体系反应后的产物稀释10倍获得的。
上述反转录反应体系的总体积为20μL：所述反转录反应体系中还包括miRNA样品：其中，所述多聚腺苷酸聚合酶的体积是0.25μL，所述反转录酶混合液的体积是5μL，所述反转录缓冲液的体积是4.0μL，所述miRNA样品的加入量是1.0μg，其余是无核酸酶纯水：所述多聚腺苷酸聚合酶的使用浓度为40U/μL：所述miRNA样品中含有内参miR-U6。
在另一方面，本发明还提供了miR-146和miR340联合使用用于制备诊断非小细胞肺癌的试剂。
判断公式为：Y＝2.251×AmiR-340+1.706×BmiR-140-4.729
当Y>0.5时，可诊断为非小细胞肺癌。
本发明具有的积极效果：
(1)miR-146和miR-340作为组合的分子标记物，首次应用于上述miRNA非小细胞肺癌检测试剂盒的开发，实现了其在早期诊断非小细胞肺癌中的应用。
(2)本发明的miRNA检测试剂盒选择了特异性强、灵敏度高的miR-146和miR-340的miRNA标记物进行组合，开发成检测试剂盒，检测快速方便、准确率高，可满足临床快速早期诊断非小细胞肺癌的需求。
(3)本发明的试剂盒运用实时荧光定量PCR方法，检测血清中非小细胞肺癌患者和正常对照组的miRNA表达水平的变化，miR-146和miR-340联合使用可以高表达地、很好地预测非小细胞肺癌的发生，作为辅助诊断。本发明的miRNA检测试剂盒通过检测miR-146和miR-340的表达量，使得非小细胞肺癌的早期诊断及疗效预测变得可行。
附图说明
图1是采用本发明的试剂盒检测样本的miR-U6的熔解曲线图。
图2是采用本发明的试剂盒检测样本的miR-146的熔解曲线图。
图3是采用本发明的试剂盒检测样本的miR-340的熔解曲线图。
图4是采用本发明的试剂盒分别进行miR-146、miR-340单指标及联合检测的ROC曲线图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的内容作进一步说明，但不应认为本发明的范围仅限于实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件如《分子克隆实验指南》所述的条件或制造商所建议的条件。文中使用的所有专业与科学用语均与本领域所描述的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
实施例1
一、试剂盒的组成。
本实施例的miRNA检测试剂盒，包括用于配制反转录反应体系的试剂、用于配制PCR体系的试剂和内参体系。
1、内参体系：
内参体系的试剂包括内参miR-U6液和针对miR-U6的正、反向引物液。内参miR-U6由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，浓度为100μmoL/L，共20μL，使用量为0.2μM。
图1是采用本发明的试剂盒检测样本的miR-U6的熔解曲线图。图2是采用本发明的试剂盒检测样本的miR-146的熔解曲线图。图3是采用本发明的试剂盒检测样本的miR-340的熔解曲线图。
2、反转录体系
用于配制反转录反应体系的试剂包括多聚腺苷酸聚合酶(polyA polymerase)、反转录酶混合液(RTase Mix)、反转录缓冲液(5×PAP/RT buffer)和无核酸酶纯水(RNaseand DNase free H2O,ddH2O)，试剂生产商均是日本TAKARA公司。反转录反应体系试剂逐瓶封装，用时按比例配成反转录反应体系，反转录反应体系为20μL/次，封装的体积为100次的用量。如表1所示
表1.反转录试剂组成
组分 体积 使用浓度
polyA polymerase 250μL 40U/μL
RTase Mix 500μL 200U/L
5×PAP/RT buffer 500μL 原商品浓度
ddH2O 1000μL --
3、PCR反应体系：
用于配制PCR反应体系的试剂包括SYBR Green混合液。2×SYBR Green Mix，正向引物液(F primer，人工合成)、反向通用引物液(RT primer，人工合成)和纯水(H20)。用于配制PCR反应体系的试剂逐瓶封装，使用时按一定的比例配制成PCR反应体系，PCR反应体系为10μ1/次，封装的体积是100次的用量，如表2所示。
表2.PCR反应体系组成
组分 体积 使用浓度
2x SYBR Green PCR Master Mix 500μL 10μL
各正向引物(F primer) 100μL 2μM
反向通用引物(RT primer) 100μL 2μM
H2O 1000μL --
用于配制PCR反应体系的正向引物分别为针对miR-146和miR-340的正向引物。用于配制PCR反应体系的两种正向引物分开逐瓶封装。配制PCR反应体系的miRNA正向引物、反向通用引物和内参正、反向引物的核苷酸序列，如表3所示，在上海生工生物工程有限公司合成。
表3正向引物和反向通用引物特征表
二、试剂盒使用方法。
本实施例的miRNA检测试剂盒的具体检测步骤如下：
1.miRNA的提取。
用普通EDTA采血管采集健康人和非小细胞肺者血液3ml，4℃，2000rpm/min，离心10min，取上清，再4℃，4000rpm/min，离心10min，分取上清。取上述所得200μL上清液将血液转移采用天根生化科技有限公司的miRcute Serum/plasma miRNA isolation kit提取试剂盒进行miRNA提取。提取miRNA样品后通过测定浓度和OD260/0D280的比值控制样品质量，最终加入反转录反应体系中的样品OD260/0D280的比值在1.8-2.0之间的可获得最优反应结果。
2.反转录反应
反转录体系如下：RNA1.0ug,Olig(dT)18 0.5ul,Random primer0.5ul加入RNasefree ddH2O至12ul，70度10min后迅速冷却1min；然后加入10mM dNTP Mixture0.5ul、RNaseinhibitor(40U/ul)0.25ul、5x M-MLV buffer4.0ul、RTase M-MLV(RNase H-)0.5ul，加入ddH2O至20ul，混匀后42度恒温60min，72度灭活15min，最后-20度保存备用。
3.荧光定量PCR反应
荧光定量PCR反应体系：利用荧光染料SYBR Green I方法，其反应组成为：正向引物、反向引物各0.5ul,AceQTMqPCRGreen Master Mix 10ul,cDNA2uL(cDNA稀释10倍),ddH2O 7ul。使用ViiA7TM System software软件设定反应程序，95℃1min；95℃10s，59℃20s(此步骤收集荧光信号)，45个循环；60℃to 95℃进行溶解曲线分析。采用AppliedBiosystems ViiA 7TM Real-Time PCR System检测各个基因的Ct值，所有反应均设3个复孔。根据Comparative Delta-delta Ct法△△Ct＝(Ct基因-Ct内参基因)-(Ct基因-Ct内参基因)对照组,利用2-△△CT计算各个基因相对于对照组的表达量。
实施例2
辅助诊断非小细胞肺癌病人的miRNA
分别提取35例非小细胞肺癌病人和35例健康人(正常对照)血清中的miRNA。通过本实施例的miRNA检测试剂盒检测miR-146和miR-340的表达量。通过Logistic回归方程拟合检测指标，发现拟合后的灵敏度和特异性均高于单独指标。通过数据分析，得到判断公式(回归方程)为：Y＝2.251×AmiR-340+1.706×BmiR-146-4.729。
结果如图4和表4所示，图4是采用本发明的试剂盒分别进行miR-146、miR-340单指标及联合检测的ROC曲线图。表4中，各指标及联合指标P值均＜0.05，说明各检测指标均与肺癌预测显著相关miR-146和miR-340的联合预测准确率达到92.2％，高于各单个检测指标的预测率。由回归分析得到采用本试剂盒进行联合检测验证，其敏感度和特异度均超过90.0％，具有明显的优势。
表4 ROC曲线下面积
a.在非参数假设下
b.空值假设：实面积＝0.5
当Y值>0.5时，则判断为非小细胞肺癌患者。
序列表
<110> 广东省实验动物监测所
<120> 一种非小细胞肺癌miRNA检测试剂盒及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc_feature
<400> 1
ctcgcttcgg cagcacatat act 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc_feature
<400> 2
cgaatttgcg tgtcatcctt gcg 23
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc_feature
<400> 3
atggttcgtg ggtgagaact gaattccatg ggt 33
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc_feature
<400> 4
atggttcgtg ggttataaag caatgagac 29
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc_feature
<400> 5
gtgcagggtc cgaggtattc 20

Claims (9)

1.一种非小细胞肺癌miRNA检测试剂盒，其包括miR-146和miR-340联合使用作为非小细胞肺癌分子标记物。
2.根据权利要求1所述的非小细胞肺癌miRNA检测试剂盒，其特征在于还包括miR-U6作为内参。
3.根据权利要求1所述的非小细胞肺癌miRNA检测试剂盒，其特征在于包括逆转录反应体系、荧光定量PCR反应体系和内参体系。
4.根据权利要求1所述的非小细胞肺癌miRNA检测试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR反应体系中包括分别针对miR-146和miR-340的正向引物和反向通用引物；所述内参体系中包括内参miR-U6和针对miR-U6的正向和反向引物。
5.根据权利要求4所述的非小细胞肺癌miRNA检测试剂盒，其特征在于，针对所述miR-146的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，针对所述miR-340的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，反向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID ID No.5所示。
6.根据权利要求4所述的非小细胞肺癌miRNA检测试剂盒，其特征在于，针对miR-U6的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示：针对miR-U6的反向引物的核苷酸序列如SEQID No.2所示。
7.根据权利要求1所述的非小细胞肺癌miRNA检测试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR反应体系的试剂包括：SYBR Green混合液、正向引物液、反向通用引物液和纯水。
8.根据权利要求1所述的非小细胞肺癌miRNA检测试剂盒，其特征在于，所述反转录反应体系的试剂包括多聚腺苷酸聚合酶、反转录酶混合液、反转录缓冲液和无核酸酶双蒸水。
9.miR-146和miR340联合使用用于制备诊断非小细胞肺癌的试剂。
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