CN103305602A - 一种基于液相芯片检测痰液microRNAs用于早期肺癌诊断的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于液相芯片系统定量检测痰液miRNAs，用于早期肺癌筛查的方法及试剂盒。本发明的方法具体如下：合成针对这些miRNAs的寡核苷酸探针，偶联好寡核苷酸探针的荧光编码微球混合后得到液相芯片，并根据其探针的序列和目的miRNAs的序列设计嵌合探针，与液相芯片进行杂交，再用藻红蛋白进行荧光标记，最后通过液相芯片检测仪检测结果。通过对临床确诊肺癌患者、非肺癌患者检出值，经统计学处理确定肺癌早期筛查最佳痰液miRNAs检测组合(关键性指标4个miRNAs，辅助性指标4个miRNAs)，制备一种用于早期肺癌筛查的痰液miRNAs液相芯片定量检测试剂盒。

Description

一种基于液相芯片检测痰液microRNAs用于早期肺癌诊断的方法

技术领域

本发明属于医用诊断技术领域，具体涉及肺癌特异性microRNAs的筛选，针对肺癌特异性microRNAs的液相芯片检测体系的建立和优化，及其在早期肺癌筛查和诊断中的应用。 

背景技术

肺癌是全世界各地常见的恶性肿瘤之一，其死亡率呈逐年上升趋势。对高危人群的筛查和早期诊断可以有效降低死亡率，但现在并没有理想的无创筛查方法。microRNAs(miRNAs)是在基因表达调控中发挥广泛作用的非编码小分子RNA，在肿瘤形成的过程中往往有异常表达，而特殊的miRNAs表达谱可区分不同类型的癌症。通过既往的研究发现，排泄物中的miRNAs可作为一种非常有潜质的无创肿瘤标志物，因此痰液中的的miRNAs对肺癌高危人群筛查有着重要的价值。 

2010年，Xie et al发现miR-21在非小细胞肺癌(Non Small Cell Lung Cancer，NSCLC)患者痰液中的含量比正常人明显增高，痰细胞学检查阳性患者的痰液中miR-21全部呈高表达，有一半痰细胞学检查阴性患者的痰液中miR-21呈高表达，且miR-21在早期肺癌中就有较高的水平(Xie Y，Todd NW，Liu Z，et al.Altered miRNA expression in sputum for diagnosis of non-small cell lung cancer.Lung Cancer，2010，67(2)：170-176.)。随后Yu et al取肺腺癌的组织标本和正常组织标本进行对比，发现有7种miRNAs在两者间存在明显差异，其中4种(miR-21、miR-182、miR-375和miR-200b)在癌组织中表达升高，3种(miR-486、miR-126和miR-145)在癌组织中表达降低。然后分析这7种miRNAs在36例I期肺腺癌患 者和对照组痰液中的含量，发现它们在痰液中的变化与组织中的一致。通过对数据的分析发现其中miR-21、miR-486、miR-375、miR-200b联合诊断肺腺癌的价值最高，灵敏度和特异性分别为80.6％和91.7％。再另选一组独立样本对这4种miRNAs进行研究，发现它们在不同的肿瘤组织类型中诊断价值不同，它们联合诊断的灵敏度和特异性在腺癌中为80.6％和92.5％，鳞癌中为64.1％和71.3％；周围型肺癌为78.3％和93.8％，中央型肺癌为65.8％和70.9％，不过在I、II、III、IV期肺癌中则无明显差异(Yu L，Todd NW，Xing L，et al.Early detection of lung adenocarcinoma in sputum by a panel of microRNA markers.Int J Cancer，2010，127(12)：2870-2878.)。与上述的实验方法和步骤一致，Xing et al证实肺鳞癌组织中miR-205，miR-210和miR-708表达增高，miR-126、miR-139和miR-429表达减少，其中miR-205、miR-210和miR-708的联合诊断价值最高，其灵敏度和特异性分别为73％和96％，它们在I期肺鳞癌中的表达量就很高，且其表达水平不随肺癌的进展而变化(Xing L，Todd NW，Yu L，et al.Early detection of squamous cell lung cancer in sputum by a panel of microRNA markers.Mod Pathol，2010，23(8)：1157-1164.)。 

2012年，Roa et al^[34]等利用RT-PCR检测加聚类分析法筛选到一个检测痰液miRNAs最优组合方案(miR-21，miR-143，miR-155，miR-210，miR-372)，早期诊断NSCLC的灵敏度和特异性达到83.3％和100％(Roa WH，Kim JO，Razzak R，etal.Sputum MicroRNA Profiling：A Novel Approach for the Early Detection of Non-Small Cell Lung Cancer.Clin Invest Med，2012，35(5)：E271.)。 

发明专利申请公开书(公开号：US 2008/0182237；国别：美国；公开日：2008年7月31日)描述了跟肺癌相关的多核苷酸，包括miRNAs，miRNAs前体以及相关的核酸，及其应用在肺癌的诊断、预后和治疗中的技术，确定疾病相关多核 苷酸作用机制的方法和对靶核酸进行线性扩增和标记的方法。 

发明专利申请公开书(公开号：US2007/0299030；国别：美国；公开日：2007年12月27日)公开了用于诊断和鉴别人乳腺癌和肺癌的一组miRNAs。 

发明专利申请公开书(公开号：US2009/0186015；国别：美国；公开日：2009年7月23日)公开了利用miRNAs谱诊断肺癌的技术和方法，但选取的miRNAs数量太多，实用性不强。 

发明专利申请公开书(公开号：US2011/0136124；国别：美国；公开日：2011年6月9日)公开了痰液中miRNAs(miR-21，miR-155，miR-210，miR-143，miR-372)与肺癌的联系，包括鉴别肺癌与其他癌症，区别不同的肺癌细胞系及其在肺癌治疗前后、有吸烟史的健康人以及不吸烟的健康人之间的表达差异，该发明是基于qRT-PCR技术对miRNAs进行检测，并未解决高通量的问题。 

发明专利申请公开书(公开号：CN101962685；国别：中国；公开日：2011年2月2日)公开了一种检测miRNAs的方法，利用不对称PCR扩增结合液相芯片技术，通过比较待检测miRNAs与外源性miRNAs的荧光信号的相对水平对miRNAs进行相对定量。 

发明内容

目前肿瘤标志物和其他无创的筛查手段存在灵敏度低，特异性差的问题，为了解决这一问题，本发明的目的是选取肺癌特异性的miRNAs作为新的肿瘤标志物；本发明的另一个目的是合成针对这些miRNAs的寡核苷酸探针，建立肺癌miRNAs的液相芯片检测体系；本发明还有一个目的就将灵敏度高、特异性好的肺癌miRNAs和液相芯片检测体系结合起来建立一种用于早期肺癌筛查和诊断的试剂盒。 

本发明的目的是这样实现的，即通过既往文献的报道选取与肺癌相关的 miRNAs，并确认在肺癌组织中存在它们的异常表达谱，从中精简出与肺癌早期诊断最为相关的几种miRNAs，针对它们设计和合成寡核苷酸探针，结合液相芯片技术，优化后得到灵敏度高、特异性好的肺癌早期诊断试剂盒。本发明包括三方面的内容：筛选肺癌特异性miRNAs、建立检测肺癌miRNAs液相芯片反应体系及其在肺癌早期诊断中的应用，其创新点在于利用原发灶肿瘤细胞的脱落，通过人体排泄物检测肿瘤特异性miRNAs可能成为肿瘤早期诊断新标志；利用液相芯片技术，开发一种具有灵敏度高、特异性高、通量高和成本低等优点的排泄物肿瘤特异性miRNAs定量检测试剂盒，且这种试剂盒为肿瘤早期诊断、指导个体化治疗和早期发现肿瘤复发转移及判断肿瘤的预后提供一种新的可靠指标。 

具体的技术方案如下： 

1.肺癌特异性miRNAs的筛选。所述的肺癌miRNAs是由既往文献证实的与肺癌的早期诊断相关度高、报道次数多的miRNAs中所选取：miR-21、miR-155、miR-205、miR-125b、miR-708、miR-210、miR-200b、miR-106a、miR-126、miR-486-5p(前八种表达增高，后两种表达降低).与筛选肺癌miRNAs有关的参考文章为Boeri M，Verri C，Conte D，et al.MicroRNA signatures in tissues and plasma predict development and prognosis of computed tomography detected lung cancer.Proc Natl Acad Sci USA，2011，108(9)：3713-3718；GuanP，Yin Z，Li X，et al.Meta-analysis of human lung cancer microRNA expression profiling studies comparing cancer tissues with normal tissues[J].J Exp Clin Cancer Res，2012，31(1)：54. 

2.肺癌miRNAs液相芯片定量检测体系的建立。所述液相芯片miRNAs检测体系是由

微球(Luminex公司)、针对miRNAs的RNA-DNA嵌 合探针、1.5×TMAC杂交缓冲液、酶切反应液所组成。针对miRNAs的RNA-DNA嵌合探针根据选取的miRNAs序列以及

微球上的捕捉序列设计，其RNA端和DNA端分别与上述两种序列互补。 

3.所述肺癌miRNAs液相芯片定量检测体系的应用。分别收集临床确诊肺癌患者48例、非肺癌人群40例(包括良性肺病变患者20例和正常健康志愿者20例)的痰液标本。提取总RNA后，用上述肺癌miRNAs液相芯片定量检测体系检测miRNAs的平均荧光强度(MFI)，以miR-191和miR-103作为内参照，取二者的几何均属作为有效内参照数值，使有效MFI＝标本的靶miRNAs分子MFI/有效内参照MFI，对这一数据进行统计分析，计算其用于诊断肺癌的灵敏度和特异性。 

附表说明： 

图1是针对肺癌特异性miRNAs的嵌合探针和微球偶联探针的序列表。 

图2是xMAP液相芯片技术检测miRNAs在肺癌患者和非肺癌人群的痰液中的表达表。(miRNA表达水平用中位数和四分位数间距表示，以miR-191和miR-103作为内参照，取二者的几何均属作为有效内参照数值MFI＝标本的靶miRNAs分子MFI/有效内参照MFI。) 

具体实施方案：

一、肺癌miRNAs液相芯片定量检测体系的建立 

实施利1： 

根据筛选出的肺癌特异性miRNAs的序列(利用miRBase数据库查询)，设计寡核苷酸探针。根据候选miRNAs的数量，使用相应数量的

微球(Luminex公司)，每种

微球上均有不同的荧光编码以及只含有A、T、G三种碱基的不同捕捉序列，捕捉序列不与miRNAs及其反向序列互补，不与人类基因互补，相互之间不互补，5’端氨基修饰。RNA-DNA嵌合探针的RNA端与miRNA的序列互补，DNA端与捕捉序列互补，5’端标记生物素。(由invitrogen公司合成) 

1.5×TMAC杂交缓冲液(250ml)：5M TMAC225ml，20％sarkosyl 1.88ml，1M Tris-Hcl(PH8.0)18.75ml，0.5M EDTA(PH8.0)3.0ml，ddH₂O 1.37ml，混匀后室温储存。 

酶切反应液：RnaseA用3M NaCl溶液稀释500倍配制。 

微球反应液：将12种微球用1.5×TMAC稀释后混合，使每种微球的浓度分别为100个/μl。 

二、痰液中miRNAs的提取 

实施利2： 

痰标本采集后储存在4℃，并在一个星期之内进行处理。将每份痰液按200μl分装到1.5ml的RNase free微量离心管中，并加入400μl Sputolysin^TM(0.1mg/ml，sigma)溶液，漩涡混匀直到黏性的痰液溶解后，37℃孵育30分钟，最后将均质化的痰液储存于-20℃。 

实施利3： 

将1000μl Trizol^TM(invitrogen)加入到储存痰液的离心管中(内含200μl已均质化的痰液)，吹打混匀后漩涡振荡20秒。然后加入200μl氯仿漩涡混匀20秒室温放置5分钟。混合物4℃离心15分钟将其分离为水相和红色有机相。把水相(约500μl)小心转移至干净的1.5ml离心管中，加入4μl的糖原共沉淀剂(Ambion)和5000μl异丙醇，轻柔混匀后室温放置20分钟。然后12000rpm离心10分钟，4℃离心15分钟将RNA沉淀下来，在4℃把沉淀物用75％乙醇洗涤，8000rpm离心2分钟，重复两次。然后使RNA溶解于105μl RNase free水中-20℃保存。为了检测RNA的浓度和含量，将5μl的RNA稀释于95μl的RNasefree水中，使用Beckman DU^TM7500分光光度计测量。200μl标本中的RNA的含量(μg)应该在0.5到3.0μg之间。A₂₆₀和A₂₈₀的比值应大于1. 

RNA(μg/μl)＝OD₂₆₀×20×40 

RNA(μg)＝OD₂₆₀×20×40×0.1 

三、肺癌miRNAs液相芯片定量检测体系的性能评估和临床验证 

实施利4： 

将总RNA2μl、1.5×TMAC16.5μl、嵌合探针混合液(10fmol/μl)1μl和RNase free ddH₂O 1.5μl混合后置于PCR仪上，90℃3分钟，80℃递减至60℃，-1℃/6分钟。 

在温度降至37℃之前，加入实施利1中所述微球混合液4μl，37℃孵育30分钟。然后加入实施利1中所述酶切反应液2.5μl，30℃孵育30分钟。 

加入SAPE荧光染料(2ng/μl，invitrogen)，20℃孵育30分钟后，使用Luminex200读数。 

实施利5： 

分别收集临床确诊肺癌患者48例、非肺癌人群40例(包括良性肺病变患者20例和正常健康志愿者20例)的痰液标本。用实施利2和3所述方法处理及提取RNA，以实施利4所述方法检测实施利1中所述肺癌特异性miRNAs的表达，计算使用上述肺癌miRNAs液相芯片定量检测试剂盒诊断肺癌的灵敏度和特异性。 

本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，因此，在与本发明权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在本发明的范围之内。 

Claims (13)

1.一种基于液相芯片系统进行早期诊断肺癌的方法，其特征在于包括以下步骤： 

①选取肺癌特异性miRNAs和内参基因，设计嵌合探针序列，探针5’末端进行生物素修饰，探针序列如下： 

miR-21： 

5’-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUACTTTAATCTCAATCAATACAAATC-3’ 

miR-155： 

5’-ACCCCUAUCACGAUUAGCAUUAATACACTTTATCAAATCTTACAATC-3’ 

miR-205： 

5’-CAGACUCCGGUGGAAUGAAGGAATACTTCATTCATTCATCAATTCA-3’ 

miR-125b： 

5’-UCACAAGUUAGGGUCUCAGGGACAATTCATTTACCAATTTACCAAT-3’ 

miR-708： 

5’-CCCAGCUAGAUUGUAAGCUCCUUCTACTATACATCTTACTATACTTT-3’ 

miR-210： 

5’-UCAGCCGCUGUCACACGCACAGTCAATCAATTACTTACTCAAATAC-3’ 

miR-200b： 

5’-UCAUCAUUACCAGGCAGUAUUAATTATTCACTTCAAACTAATCTAC-3’ 

miR-106a： 

5’-CUACCUGCACUGUAAGCACUUUUCTTCTCATTAACTTACTTCATAAT-3’ 

miR-126： 

5’-CGCAUUAUUACUCACGGUACGACTATCTTCATATTTCACTATAAAC-3’ 

miR-486-5p： 

5’-CUCGGGGCAGCUCAGUACAGGATCATTTCACAATTCAATTACTCAA-3’ 

miR-191： 

5’-CAGCUGCUUUUGGGAUUCCGUUGTCATCAATCTTTCAATTTACTTAC-3’ 

miR-103： 

5’-UCAUAGCCCUGUACAAUGCUGCUCAATATACCAATATCATCATTTAC-3 

②液相芯片的制备：根据检测目的将偶联好探针的不同荧光编码微球混合，得到液相芯片。 

③标本检测：从标本中提取总RNA，根据检测目的选择步骤①中所述的嵌合探针与目的miRNAs进行杂交；接着将杂交后产物与步骤②得到的液相芯片再进行杂交；再用藻红蛋白对杂交产物进行标记，通过液相芯片检测仪读出检测结果。 

④确定待检人群是否为患有肺癌的高危人群，其痰液中的miRNAs表达谱必须含有一个已经确定的miRNAs异常表达谱以及至少两种以上其他的肿瘤特异性miRNAs呈阳性。 

2.根据权利1所述的基于液相芯片系统早期诊断肺癌的方法，其特征在于：所述的偶联好探针的荧光编码微球为

微球。 

3.根据权利1所述的肺癌，其特征在于：包括原位癌以及转移至大脑、乳腺、前列腺等其他组织的继发性肿瘤。 

4.根据权利1所述的肺癌特异性miRNAs，其特征在于：包括其成熟的miRNAs序列及其发夹前体序列。 

5.根据权利1所述的肺癌特异性miRNAs和确定的miRNAs异常表达谱，其特征在于：是由统计学分析得出。 

6.根据权利3所述的统计学分析，其特征是包括系统聚类分析法。 

7.根据权利1所述的肺癌特异性miRNAs，其特征是包括：miR-21、miR-155、 miR-205、miR-125b、miR-708、miR-210、miR-200b、miR-106a、miR-126、miR-486-5p。 

8.根据权利1所述的内参基因，其特征是包括；miR-191和miR-103。 

9.根据权利1所述的已经确定的肺癌miRNAs异常表达谱，其特征是包括：miR-21、miR-155、miR-205、miR-125b。 

10.根据权利1所述的至少应含有两种以上其他的肺癌特异性miRNAs，其特征是包括：miR-708、miR-210、miR-200b、miR-106a、miR-126、miR-486-5p。 

11.根据权利1所述的基于液相芯片系统早期诊断肺癌的方法，其特征在于： 

步骤③中所述的嵌合探针与目的miRNAs进行杂交的条件为：在PCR仪上，90℃3min后，80℃递减至60℃，-1℃/6min。 

步骤③中所述的杂交产物与步骤②得到的液相芯片进行杂交的条件为：37℃，30min。 

步骤③中所述的藻红蛋白为链霉亲和素R-藻红蛋白。 

步骤③中所述的液相芯片检测仪为Luminex200。 

12.根据权利1～11任一项所述的基于液相芯片系统早期诊断肺癌的方法的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的嵌合探针和液相芯片，液相芯片为12种偶联好探针的荧光编码微球分散在1.5×TMAC杂交液混合得到，每种偶联好探针的荧光编码微球的浓度为100个/μl。 

13.根据权利12所述的基于液相芯片系统早期诊断肺癌的方法的试剂盒的使用方法，其特征在于：包括以下步骤： 

①杂交：将总RNA2μl、1.5×TMAC16.5μl、嵌合探针混合液(10fmol/μl)1μl和RNase free ddH₂O 1.5μl混合后置于PCR仪上，90℃3分钟，80℃递减至60℃，-1℃/6分钟。在温度降至37℃之前，加入液相芯片4μl，37℃孵育30分钟。 

②酶切和标记：然后加入酶切反应液2.5μl，30℃孵育30分钟。加入SAPE荧光染料(2ng/μl，invitrogen)，20℃孵育30分钟。 

③上机检测：使用Luminex200读数，以miR-191和miR-103作为内参照，取二者的几何均属作为有效内参照数值，使有效MFI＝标本的靶miRNAs分子MFI/有效内参照MFI，并对该数据进行分析判断；判断标准如下： 

1)肺癌miRNAs异常表达谱：miR-21≥1.8、miR-155≥3.5、miR-205≥4.8、miR-125b≥2.2。 

2)其他的肺癌特异性miRNAs：miR-708≥2.0为阳性，miR-210≥3.5为阳性，miR-200b≥3.3为阳性，miR-106a≥4.3为阳性，miR-126≤6.0为阳性，miR-486-5p≤5.2为阳性。