CN104877999A - 液相芯片miRNA检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了液相芯片miRNA检测试剂盒。本发明提供了检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂盒在制备鉴定或辅助鉴定待测样本是否为NSCLC癌组织的产品中的应用。本发明还提供了检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂盒在制备鉴定或辅助鉴定待测患者是否为NSCLC患者的产品中的应用。本发明的实验证明,对26例不同期NSCLC肺癌患者肿瘤组织miRNAs进行表达量检测,发现miR-21、miR-210和miR-31可以作为标志组合物,用于判断是否为NSCLC肺癌患者,其预测准确率为94.2%。具有临床操作简便、高通量、可自由组合,绝对定量等特点,尤其能够对NSCLC肺癌进行早期诊断,增加治愈的成功率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种液相芯片miRNA检测试剂盒。
背景技术
肺癌是目前全球头号癌症杀手,其发病率和死亡率呈逐年迅速上升趋势,而中国是世界上肺癌患者最多的国家。肺癌可分为NSCLC(非小细胞肺癌)和SCLC(Small celllung cancer,小细胞肺癌),其中NSCLC约占肺癌总数的80%,并可大致分为SCC(Squamous cell carcinoma,鳞状细胞癌)、AC(Adenocarcinoma,腺癌)和LCC(Largecell carcinoma,大细胞癌)。Ⅳ期NSCLC的5年生存率仅为10%,但Ⅰ期NSCLC的5年生存率则可达到80%左右,因此,如何对肺癌进行早期诊断成为了关键。目前,临床上使用肿瘤标志物进行体检,由于一种肿瘤标志物可以出现在多种肿瘤中,一种肿瘤也可以出现多种肿瘤标志物,因此,肿瘤标志物只能作为辅助检查项目。
microRNA(miRNA)是一类内源性非编码的小分子RNA,它们调节的基因超过半数位于肿瘤相关基因组区或脆性位点,一旦发生失常就会影响肿瘤的发生及发展,miRNAs在不同组织器官、不同病理类型及不同发病阶段的肿瘤中的表达具有特征性。大量研究结果表明,肺癌患者的癌组织、外周血、胸腔积液及痰液中均存在特异性表达的miRNAs,多达几十种miRNAs被证实与肺癌有关,但不同实验组之间结果不尽相同且可比性较差,这主要是由于miRNA的长度(small size)限制了其检测技术的发展,造成各课题组检测技术不同,内参也不同。常用的miRNA检测方法包括northernblot、RT-qPCR和microarray。northern blot是金标准,但操作起来费时费力;RT-qPCR虽灵敏度较高,但茎环引物设计复杂,且无法实现多重检测;microarray是高通量检测方法,但特异性和重复性较低,且价格昂贵,不适用于临床。另外,不同公司的芯片和RT-qPCR试剂盒在设计原理上存在不少差异,导致相互之间结果差异较大。
液相芯片技术具有高通量、操作简便、不需要预处理和扩增的优点,且不同于固相芯片,它指标选择灵活,可根据需要自行组合,大大降低检测成本。Dacic S et al使用第一代FlexmiR对肺腺癌组织及癌旁组织中319种成熟miRNAs进行检测,发现miR-20a、miR-328、miR-34c和miR-18b在癌组织中表达比癌旁组织增高20倍以上,同时miR-32、miR-137和miR-342表达降低20倍以上。Markou A et al也使用同样的方法分析非小细胞肺癌(NSCLC)癌组织和癌旁组织中miRNAs表达谱,不同的是,癌组织中仅miR-21表达上调。Wang Y et al使用第二代FlexmiR选择性地检测了NSCLC癌组织和癌旁组织中的miR-21、miR-31、miR-222、miR-145和miR-126表达,发现癌组织中前三者表达增高,后二者表达降低。用qRT-PCR对以上结果进行验证,两种技术检测结果呈高度相关,证实了FlexmiR的可靠性。
发明内容
本发明的一个目的是提供检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器的用途。
本发明提供了miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器在制备鉴定或辅助鉴定待测样本是否为NSCLC癌组织的产品中的应用。
本发明另一个目的是提供检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器的用途。
本发明提供了检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器在制备鉴定或辅助鉴定待测患者是否为NSCLC患者的产品中的应用。
本发明第三个目的是提供检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器的用途。
本发明提供了检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器在制备诊断或辅助诊断待测患者是否为NSCLC患者的产品中的应用。
本发明第四个目的是提供检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器的用途。
本发明提供了检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器在制备预测或辅助预测待测人或动物是否会患有NSCLC的产品中的应用。
本发明第五个目的是提供检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器的用途。
本发明提供了检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器在制备预测或辅助预测待测患者是否会发生NSCLC复发的产品中的应用。
上述应用中,
所述检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器为检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂盒;
所述试剂盒包括miR-21嵌合探针、miR-210嵌合探针、miR-31嵌合探针、固定有探针A的聚苯乙烯微球、固定有探针B的聚苯乙烯微球、固定有探针C的聚苯乙烯微球;
所述探针A能结合所述miR-21嵌合探针;
所述探针B能结合所述miR-210嵌合探针;
所述探针C能结合所述miR-31嵌合探针;
所述miR-21嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列1;
所述miR-210嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列2;
所述miR-31嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列3;
所述探针A的核苷酸序列为序列4;
所述探针B的核苷酸序列为序列5;
所述探针C的核苷酸序列为序列6。
上述应用中,
所述各嵌合探针5’端均标记荧光基团生物素;
所述试剂盒还包括荧光标记物SAPE、miR-21、miR-210和miR-31;
所述miR-21的核苷酸序列为序列7;
所述miR-210的核苷酸序列为序列8;
所述miR-31的核苷酸序列为序列9。
本发明第六个目的是提供检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂盒。
本发明提供的试剂盒,为如下1)或2):
1)鉴定或辅助鉴定待测样本是否为NSCLC癌组织的产品;
2)鉴定或辅助鉴定待测患者是否为NSCLC患者的产品。
上述的试剂盒中,所述试剂盒包括miR-21嵌合探针、miR-210嵌合探针、miR-31嵌合探针、固定有探针A的聚苯乙烯微球、固定有探针B的聚苯乙烯微球、固定有探针C的聚苯乙烯微球;
所述探针A能结合所述miR-21嵌合探针;
所述探针B能结合所述miR-210嵌合探针;
所述探针C能结合所述miR-31嵌合探针;
所述miR-21嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列1;
所述miR-210嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列2;
所述miR-31嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列3;
所述探针A的核苷酸序列为序列4;
所述探针B的核苷酸序列为序列5;
所述探针C的核苷酸序列为序列6;
所述各嵌合探针5’端均标记荧光基团生物素。
上述的试剂盒中,所述试剂盒还包括荧光标记物SAPE、miR-21、miR-210和miR-31;
所述miR-21的核苷酸序列为序列7;
所述miR-210的核苷酸序列为序列8;
所述miR-31的核苷酸序列为序列9。
上述试剂盒还包括液相芯片检测仪Luminex 200机器。
所述试剂盒还包括记载如下标准的可读载体:若所述待测样本的RNA中miR-21的表达量大于1478.3amol/μl,且miR-210的表达量大于2.49amol/μl,且miR-31的表达量大于2.57amol/μl,则所述待测样本为或候选为NSCLC癌组织;若所述待测样本RNA中miR-21、miR-210和miR-31的表达量不满足上述标准,则所述待测样本不为或候选不为NSCLC癌组织。
本发明的实验证明,对26例不同期NSCLC肺癌患者肿瘤组织miRNAs进行表达量检测,发现miR-21、miR-210和miR-31可以作为标志组合物,用于判断是否为NSCLC肺癌患者,其预测准确率为88%。具有临床操作简便、高通量、可自由组合,绝对定量等特点,尤其能够对NSCLC肺癌进行早期诊断,增加治愈的成功率。
附图说明
图1为NSCLC癌组织和良性病变肺组织中miRNAs的表达(amol/μl),*P<0.05,**P<0.01;
图2为NSCLC癌组织与癌旁组织中miRNAs的表达(amol/μl)。
图3为ROC曲线。
图4为检测的7个miRNA标准曲线。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1、辅助检测NSCLC癌组织的标志物筛选及检测方法确定
一、RNA的提取
1、研究对象
选取2013年6月-2014年3月期间深圳市人民医院胸外科经病理确诊,不同临床分期、分型且术前未接受放疗和化疗的原发性NSCLC肺癌患者26例,取手术切除的肿瘤生长活跃无坏死部位切除的癌组织1cm3左右以及距离癌组织0.5cm-2cm之间的癌旁组织1cm3左右;非肺癌人群的组织标本来自肺部良性病变17例(包括肺大疱5例、炎性假瘤6例、肺结核2例、错构瘤2例、硬化性血管瘤2例)的手术切除肺病变组织1cm3左右。病理分型由两位以上有经验的病理科专家一致诊断。入选的受检者均知情同意。
2、试剂配制
(1)Rnase free ddH2O:999ml ddH2O中加入1ml DEPC,搅拌混匀,室温下过夜后,121℃25min高压蒸汽灭菌,分装后4℃封闭保存。
(2)1.5×TMAC杂交缓冲液:将5M TMAC 225ml,20%Sarkosyl solution 1.88ml,1M Tris-HCl(pH 8.0)18.75ml,0.5M EDTA(pH 8.0)3.0ml,Rnase free ddH2O 1.73ml混匀后室温保存。
(3)TE缓冲液:1M,PH=8.0,5ml Tris-HCl Buffer,0.5M,PH=8.0,1ml EDTA向烧杯中加入约400ml H2O均匀混合;将溶液定容到500ml后,高温高压灭菌;室温保存。
(4)Rnase A酶切反应液:将Rnase A用3M NaCl按1:500稀释,分装后-20℃保存。
3、总RNA的提取
NSCLC肺癌患者癌组织、癌旁组织和非肺癌人群病变组织标本离体后10min内置于液氮罐内迅速冷冻后转移至-70℃冰箱保存。使用时先称取重量,用液氮研磨法将组织磨成粉末,按50~80mg/ml的分量加入RNAiso Plus,混匀后将混合液分装成1ml每管,提取上述26例NSCLC患者癌组织RNA、26例NSCLC患者癌旁组织RNA和17例非肺癌人群病变组织RNA。
二、液相芯片miRNA检测
1、探针设计及试剂的配置
1)微球及其上探针序列和对应的嵌合探针序列
购买7种聚苯乙烯微球-TAGTM,7种-TAGTM微球上的探针序列见表1;根据筛选出的NSCLC特异性miRNAs的序列(利用miRBase数据库查询)和-TAGTM微球上anti-TAG的序列,设计嵌合探针。嵌合探针的RNA端与检测样本miRNA的序列互补,嵌合探针的DNA端与对应微球探针互补,5’端标记生物素。
表1为微球上探针序列和对应的嵌合探针序列
2)嵌合探针混合工作液的配制
嵌合探针混合工作液为将表1的miR-21、miR-210、miR-205、miR-125b、miR-155、miR-375、miR-31这7种miRNA对应的嵌合探针溶解于TE缓冲液中,且使每种嵌合探针的浓度为10fmol/μl,得到混合探针工作液,具体配置如下:
将上述表1中的7种嵌合探针原管每种均用TE缓冲液溶解成100μM,使用时先将7种探针稀释成1μM的母液,再将每种探针母液1μl加入到93μl的TE缓冲液中,得到混合探针工作液,且混合工作液中每种探针的终浓度为10fmol/μl。每次实验需新鲜配制。
3)miRNAs参比品混合工作液的配制
miRNAs参比品混合工作液为将人共合成的表1的miR-21、miR-210、miR-205、miR-125b、miR-155、miR-375、miR-31这7种miRNA溶解于TE缓冲液中,且使每种miRNA的浓度为10pmol/μl,得到miRNAs参比品混合工作液。
再用TE缓冲液将miRNAs参比品混合工作液依次倍比稀释为1pmol/μl,100fmol/μl,10fmol/μl,1fmol/μl,100amol/μl,10amol/μl,1amol/μl。
miRNAs参比品混合工作液具体配置如下:
每种miRNAs mimic用TE buffer溶解成100μM,使用时将7种参比品每种1μl加入到3ul的TE buffer,得到miRNAs参比品混合工作液,使每种参比品浓度为10pmol/μl。每次实验新鲜配制。
2、液相芯片miRNA检测
1)待测RNA样本与嵌合探针的杂交反应
将上述一获得的各总RNA用核酸测定仪测定RNA总量OD260/280在1.8-2.2,再稀释为800ng/μl待检。
将稀释后RNA、上述1中的2)的嵌合探针混合工作液和1.5×TMAC杂交缓冲液混匀,杂交,得到杂交产物,即为miRNA-嵌合探针复合物。用Rnase free ddH2O作为空白对照,每次实验设两个空白对照,每个样本重复三次。
上述杂交反应的杂交反应体系如表2所示:
表2为杂交反应体系
上述杂交具体如下:
将表2的杂交反应体系加入到96孔PCR板中后封膜,漩涡混匀5s,然后快速离心2s使混合反应液都沉到管底,把96孔PCR板放入PCR仪中进行杂交反应,得到杂交产物,即为miRNA-嵌合探针复合物。
PCR仪反应程序:90℃3min,80℃递减至60℃,-1℃/6min(即80℃6min,79℃6min,78℃6min……60℃6min),37℃HOLD。
2)微球与miRNA-嵌合探针复合物的杂交
微球反应液的配置:每种-TAGTM微球浓度为2.5×106个/ml,而每个反应体系需要每种微球的数目为2500个。假设样本数量为n,参比品数量为6,空白对照为2,则一共为n+8个反应体系。具体如下:将表1的miR-21、miR-210、miR-205、miR-125b、miR-155、miR-375、miR-31这7种miRNA对应的7种-TAGTM微球每种(n+8)μl混合,在磁性分离板上放置两分钟使微球沉到官底,弃上清,再用[(n+8)×4]μl 1.5×TMAC杂交缓冲液重悬微球,漩涡混匀后即为微球反应液。
将4μl微球反应液加入上述1)得到的miRNA-嵌合探针复合物所在96孔板的各孔中(使每个孔中需要每种微球的数目为2500个),封膜,漩涡混匀15s,然后快速离心2s使混合反应液都沉到管底,37℃孵育杂交30min,得到杂交产物,即为微球-miRNA-嵌合探针复合物。
3)酶切
上述2)得到的微球-miRNA-嵌合探针复合物所在96孔板的各孔中加入2.5μl配好的Rnase A酶切反应液,轻柔混匀,封膜后30℃孵育30min。
4)洗板
3)的孵育完成后,将96孔板置于磁性分离板上2min,用移液枪小心移去上清。加入200μl1.5×TMAC杂交缓冲液重悬微球,然后将96孔板再次置于磁性分离板上2min,用移液枪小心移去上清。
5)微球-miRNA-嵌合探针复合物的荧光标记
SAPE溶液:将SAPE(链亲和素偶联的藻红素,产品目录号:S-866规格:2ML,Invitrogen公司)用TE缓冲液按1:500(2ng/μl)进行稀释,使SAPE的浓度为2ng/μl。每次实验需新鲜配制。
荧光标记:向上述4)处理后的96孔板每孔加入75ul SAPE溶液重悬微球,漩涡混匀15s,快速离心2s,然后封膜,室温下水平振荡30min,实现荧光标记,得到SAPE-微球-miRNA-嵌合探针复合物。
6)洗板
上述5)的孵育完成后,将96孔板置于磁性分离板上2min,用移液枪小心移去上清。加入200μl杂交缓冲液重悬微球,然后将96孔板再次置于磁性分离板上2min,用移液枪小心移去上清。重复两次。最后加入100μl1.5×TMAC杂交缓冲液重悬微球,小心避免气泡的产生。
7)仪器检测
使用Luminex 200机器和xPONENT 3.1软件进行数据的检测和标准曲线的绘制。主要参数设置:吸取反应液体积:80μl;Time out:60s;DD gate:13500;High PMT;Standard:6。
用Rnase free ddH2O作为空白对照,每次实验设两个空白对照,每个样本重复三次。
将上述1得到的6种浓度miRNAs参比品混合工作液采用上述2中的1)-7)方法进行检测,作标准曲线(图4)。
根据上述各RNA检测结果和标准曲线,得出各样本RNA中的各miRNA的表达量,结果如表3、图1和图2所示,图1是癌组织和病变组织的对比,图2是癌组织和癌旁组织的对比;可以看出,与病变组织或与癌旁组织相比,miR-21、miR-210、miR-205、miR-125b、miR-155、miR-375、miR-31的表达量均提高。
表3为癌组织、癌旁组织和肺部良性病变组织中miRNAs的表达量(amol/μl)
Note:miRNA的表达量以中位数和四分位间距表示,与癌旁组织比较*P<0.05,**P<0.01;与肺部良性病变组织比较#P<0.05,##P<0.01;“—”代表无法检测。
根据上述表2中的表达量绘制NSCLC肺癌患者癌组织miR-21、miR-205、miR-125b、miR-155、miR-31、miR-375、miR-210的工作曲线(Receiver Operator CharacteristicCurve,ROC,图3),曲线下面积(Area Under the Curve,AUC)判断其临床诊断价值。AUC越接近1,证明该指标的诊断价值越大。
统计AUC值结果如表4所示,AUC值大于0.8的有miR-21、miR-210和miR-31三种miRNAs。因此,用于诊断NSCLC最佳的前三种miRNAs为miR-21、miR-210和miR-31。
表4为miRNAs表达在NSCLC肺癌诊断中的价值
因此miR-21、miR-210和miR-31的表达量辅助鉴定待测组织是否为NSCLC癌组织,具体如下:
提取待测组织的RNA,用miR-21的-TAGTM微球、miR-210的-TAGTM微球、miR-31的-TAGTM微球、miR-21嵌合探针(序列1)、miR-210嵌合探针(序列2)和miR-31嵌合探针(序列3)与RNA杂交,得到杂交产物,将杂交产物进行液相芯片检测,得到待测组织RNA中miR-21、miR-210和miR-31的表达量;
若miR-21、miR-210和miR-31的表达量满足如下标准:待测组织RNA中miR-21的表达量大于1478.3amol/μl,且miR-210的表达量大于2.49amol/μl,且miR-31的表达量大于2.57amol/μl,则待测组织为或候选为NSCLC癌组织;若待测组织RNA中miR-21、miR-210和miR-31的表达量不满足上述标准,则待测组织不为或候选不为NSCLC癌组织。
实施例2、miR-21、miR-31、miR-222组合标志物在检测NSCLC癌组织中的应用
一、RNA的提取
提取实施例1的一中的26例NSCLC肺癌患者癌组织和癌旁组织以及17例肺部良性病变癌患者病变组织的RNA。
二、液相芯片miRNA检测
按照实施例1的二的方法用miR-21的-TAGTM微球、miR-210的-TAGTM微球、miR-31的-TAGTM微球、miR-21嵌合探针(序列1)、miR-210嵌合探针(序列2)和miR-31嵌合探针(序列3)与上述一的各RNA杂交,得到杂交产物。
将杂交产物进行液相芯片检测,根据检测得到的荧光强度与实施例1二中的标准曲线计算各个待测组织RNA中miR-21、miR-210和miR-31的表达量;
根据下述判断待测组织是否为NSCLC癌组织:若miR-21、miR-210和miR-31的表达量满足如下标准:待测组织RNA中miR-21的表达量大于1478.3amol/μl,且miR-210的表达量大于2.49amol/μl,且miR-31的表达量大于2.57amol/μl,则待测组织为或候选为NSCLC癌组织;若待测组织RNA中miR-21、miR-210和miR-31的表达量不满足上述标准,则待测组织不为或候选不为NSCLC癌组织。
上述各组织结果如下:
26例NSCLC肺癌患者癌组织中,有21例NSCLC肺癌患者癌组织满足上述标准:miR-21表达量大于1478.3amol/μl,且miR-210的表达量大于2.49amol/μl,且miR-31的表达量大于2.57amol/μl,判断为NSCLC癌组织(临床检测为NSCLC癌组织);有5例NSCLC肺癌患者癌组织不符合上述标准,判断其不为NSCLC癌组织(临床检测为NSCLC癌组织)。根据实际组织样本临床检测结果,本发明方法判断准确率达81%。
26例NSCLC肺癌患者癌旁组织,有26例NSCLC肺癌患者癌组织不符合上述标准,判断其不为NSCLC癌组织(临床检测为NSCLC癌旁组织);有26例NSCLC肺癌患者癌组织满足上述标准,判断其为NSCLC癌组织(临床检测为NSCLC癌旁组织)。根据实际组织样本临床检测结果,本发明方法判断准确率达100%。
17例肺部良性病变癌患者病变组织中,有13例患者病变组织不符合上述标准,判断其为NSCLC癌组织(临床检测为肺部良性病变癌患者病变组织);有4例患者符合上述标准(临床检测为肺部良性病变癌患者病变组织)。根据实际组织样本临床检测结果,本发明方法判断准确率达76%。
上述方法和判断标准也可以用来辅助鉴定待测患者是否为NSCLC患者或辅助鉴定待测组织样本是否为NSCLC癌组织。
Claims (10)
1.检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器在制备鉴定或辅助鉴定待测样本是否为NSCLC癌组织的产品中的应用。
2.检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器在制备鉴定或辅助鉴定待测患者是否为NSCLC患者的产品中的应用。
3.检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器在制备诊断或辅助诊断待测患者是否为NSCLC患者的产品中的应用。
4.检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器在制备预测或辅助预测待测人或动物是否会患有NSCLC的产品中的应用。
5.检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器在制备预测或辅助预测待测患者是否会发生NSCLC复发的产品中的应用。
6.根据权利要求1-5中任一所述的应用,其特征在于:
所述检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器为检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂盒;
所述试剂盒包括miR-21嵌合探针、miR-210嵌合探针、miR-31嵌合探针、固定有探针A的聚苯乙烯微球、固定有探针B的聚苯乙烯微球、固定有探针C的聚苯乙烯微球;
所述探针A能结合所述miR-21嵌合探针;
所述探针B能结合所述miR-210嵌合探针;
所述探针C能结合所述miR-31嵌合探针;
所述miR-21嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列1;
所述miR-210嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列2;
所述miR-31嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列3;
所述探针A的核苷酸序列为序列4;
所述探针B的核苷酸序列为序列5;
所述探针C的核苷酸序列为序列6。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于:
所述各嵌合探针5’端均标记荧光基团生物素;
所述试剂盒还包括荧光标记物SAPE、miR-21、miR-210和miR-31;
所述miR-21的核苷酸序列为序列7;
所述miR-210的核苷酸序列为序列8;
所述miR-31的核苷酸序列为序列9。
8.检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂盒,为如下1)或2):
1)鉴定或辅助鉴定待测样本是否为NSCLC癌组织的产品;
2)鉴定或辅助鉴定待测患者是否为NSCLC患者的产品。
9.根据权利要求8所述的试剂盒,其特性在于:
所述试剂盒包括miR-21嵌合探针、miR-210嵌合探针、miR-31嵌合探针、固定有探针A的聚苯乙烯微球、固定有探针B的聚苯乙烯微球、固定有探针C的聚苯乙烯微球;
所述探针A能结合所述miR-21嵌合探针;
所述探针B能结合所述miR-210嵌合探针;
所述探针C能结合所述miR-31嵌合探针;
所述miR-21嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列1;
所述miR-210嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列2;
所述miR-31嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列3;
所述探针A的核苷酸序列为序列4;
所述探针B的核苷酸序列为序列5;
所述探针C的核苷酸序列为序列6;
所述各嵌合探针5’端均标记荧光基团生物素。
10.根据权利要求9所述的试剂盒,其特性在于:
所述试剂盒还包括荧光标记物SAPE、miR-21、miR-210和miR-31;
所述miR-21的核苷酸序列为序列7;
所述miR-210的核苷酸序列为序列8;
所述miR-31的核苷酸序列为序列9;
所述试剂盒还包括记载如下标准的可读载体:若所述待测样本的RNA中miR-21的表达量大于1478.3amol/μl,且miR-210的表达量大于2.49amol/μl,且miR-31的表达量大于2.57amol/μl,则所述待测样本为或候选为NSCLC癌组织;若所述待测样本RNA中miR-21、miR-210和miR-31的表达量不满足上述标准,则所述待测样本不为或候选不为NSCLC癌组织。
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