CN105018639A - 胃癌预后新型分子标志物lncRNA-AB007962的检测及用途 - Google Patents
胃癌预后新型分子标志物lncRNA-AB007962的检测及用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了胃癌新型分子标志物长链非编码RNA-AB007962的检测试剂盒及其应用,提供了一条在胃癌患者组织中表达下调的分子标志物lncRNA-AB007962,在劳伦(Lauren)分型为肠型的lncRNA-AB007962低表达患者比lncRNA-AB007962高表达的患者预后更差,将lncRNA-AB007962的表达用于Lauren分型为肠型胃癌的患者预后预测,可以为患者的预后提供强有力的分子生物学依据,具有深远的临床意义和重要的应用前景。
Description
技术领域:
本发明属于肿瘤分子生物学领域,具体涉及胃癌根治术后预后领域,具体而言,本发明涉及一种胃癌预后新型分子标志物lncRNA-AB007962的用途及其制备的检测试剂盒。
背景技术:
胃癌是全世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,在我国,胃癌的发病率及致死率均高居前列,因其早期症状的不典型,造成了明确诊断时,多已到达了进展期。胃癌患者根据不同原则可以分为多种类型,例如:根据组织分化程度分型可以分为高、中、低分化型胃癌,此外,Lauren分型作为临床上经常应用的分类方法,可以将胃癌患者分为肠型、弥漫型和混合型。不同分型患者的生存期存在显著差异,能为患者预后起到一定预示作用。但是,目前对胃癌的预后判断没有明确的参考标准,对不同分型的胃癌也没有特异性的预后指标,远远不能满足对患者个体化的预后评判的需求。因此,明确胃癌患者或不同分型胃癌患者的预后指标,成为胃肠肿瘤外科领域亟待解决的重要课题。
LncRNA是一类转录本长度大于200个核苷酸的非编码RNA,它具有多种生物学功能,在染色质修饰、转录、翻译、剪切、表观遗传学调控等多种生物过程发挥重要作用。研究表明,lncRNA在前列腺癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌等多种肿瘤组织中呈现异常表达,并在肿瘤发生、发展过程中起促癌或抑癌作用。近年来,lncRNA成为研究热点,并在临床诊断、化疗敏感性和预后评价等方面显示出重要的应用价值,逐渐受到研究者的重视。
发明内容:
发明目的:
本发明提供一种胃癌新型分子标志物长链非编码lncrna-AB007962的检测试剂盒,解决了为Lauren分型为肠型胃癌患者的预后生存期评价的问题。
技术方案:
在胃癌组织中低表达的分子标志物lncRNA-AB007962,其特征在于:lncRNA-AB007962的核酸序列为SEQ ID No.1。
上述分子标志物lncRNA-AB007962的用途,其特征在于:用于制备评估Lauren分型为肠型的胃癌患者预后的试剂盒。
试剂盒采用实时荧光定量PCR检测试剂盒,该试剂盒包括:
(1)癌与癌旁组织提取总RNA试剂;
(2)总RNA反转录为cDNA试剂;
(3)定量PCR检测表达试剂。
该试剂盒包括:
(1)癌与癌旁组织提取总RNA试剂:TRIzoL、三氯甲烷、异丙醇、75%乙醇、无酶水;
(2)总RNA反转录为cDNA试剂:gDNA Eraser、5X gDNA Eraser Buffer、PrimeScript RT Enzyme Mix I、5X PrimerScript Buffer 2、RT Primer Mix、RNaseFree dH2O;
(3)定量PCR检测表达试剂:lncRNA-AB007962实时荧光定量PCR特异性引物、GAPDH内参实时荧光定量PCR特异性PCR引物、实时荧光定量SYBR染料、无酶水。
定量PCR检测试剂中包含用于检测lncRNA-AB007962表达的引物序列,引物序列为SEQ ID No.2,以及作为内参的基因GAPDH表达的引物序列,引物序列为SEQ ID No.3。
所用定量PCR检测表达试剂中的引物序列适用于SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、复合探针的检测。
优点及效果:
本发明提出了一种胃癌新型分子标志物长链非编码lncRNA-AB007962及其检测试剂盒,具有如下优点:
本发明提供一种在胃癌组织中低表达的长链非编码RNA-AB007962分子标志物及应用方法,该基因被命名为lncRNA-AB007962,长度为5053个核苷酸,定位于1号染色体149627309-149651107之间,可应用于Lauren分型为肠型的胃癌患者术后早期的预后判断,该lncRNA序列详见SEQ NO:1。对人胃癌与配对癌旁正常组织样本中通过实时荧光定量PCR验证,lncRNA-AB007962在胃癌组织中明显低表达(p<0.05),与胃癌患者的肿瘤最大径显著相关(p=0.033),与Lauren分型为肠型的胃癌患者预后生存时间显著相关(p=0.006),lncRNA-AB007962高表达患者比低表达患者具有更久的生存期。
本发明可以检测lncRNA-AB00762在胃癌患者中的表达水平及情况,该荧光定量PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪,灵敏度高、定量快速准确、稳定性好。且为Lauren分型为肠型的胃癌患者的预后生存期评价和预测提供了强有力的分子生物学依据,具有深远的临床意义。
附图说明:
图1为实时荧光定量PCR分析lncRNA-AB007962在96对胃癌组织与配对癌旁正常胃组织的表达差异情况(2-ΔCt值)。
图2为96例胃癌患者组织中LncRNA-AB007962的表达情况(-ΔΔCt值)。
图3为Kaplan-Meier生存曲线分析lncRNA-AB007962与28例Lauren分型为肠型的胃癌患者预后的关系。
具体实施方式:
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的说明:
本发明提供一种在胃癌组织中低表达的长链非编码RNA(long non-codingRNA,lncRNA)AB007962的分子标志物及其试剂盒的应用方法,lncRNA-AB007962长度为5053个核苷酸,定位于1号染色体149627309-149651107之间,可应用于Lauren分型为肠型的胃癌患者术后早期的预后判断,该lncRNA序列详见SEQ NO:1。
在96对人胃癌与配对癌旁正常组织样本中通过实时荧光定量PCR验证,通过SPSS 17.0(SPSS Inc,Chicago,IL,USA)软件进行数据分析发现:lncRNA-AB007962在胃癌组织中明显低表达(p<0.05)。非参数检验(Mann-Whitney U及Kruskall-Wallis)分析发现lncRNA-AB007962与胃癌患者的肿瘤最大径显著相关(p=0.033),Kaplan-Meier生存曲线分析发现lncRNA-AB007962与Lauren分型为肠型的28例胃癌患者的预后生存时间显著相关(p=0.006),lncRNA-AB007962高表达患者比低表达患者具有更久的生存期(详见表1)。由此可见,lncRNA-AB007962异常表达与胃癌进展及预后密切相关,在此基础上,本发明提供了一种高性价比,高应用性的针对胃癌Lauren分型为肠型患者的预后检测试剂盒。
在胃癌组织中低表达的分子标志物lncRNA-AB007962,其特征在于:lncRNA-AB007962的核酸序列为SEQ ID No.1。
用于制备评估Lauren分型为肠型的胃癌患者预后的试剂盒。
胃癌新型分子标志物lncRNA-AB007962,其异常表达与胃癌进展及预后密切相关,可用于制备评估胃癌预后的试剂盒,在此基础上,本发明提供了一种高性价比,高应用性的针对胃癌Lauren分型为肠型患者的预后检测试剂盒。
试剂盒采用实时荧光定量PCR检测试剂盒,该试剂盒包括:
(1)癌与癌旁组织提取总RNA试剂;
(2)总RNA反转录为cDNA试剂;
(3)定量PCR检测表达试剂。
该试剂盒包括:
(1)癌与癌旁组织提取总RNA试剂:TRIzoL、三氯甲烷、异丙醇、75%乙醇、无酶水;
(2)总RNA反转录为cDNA试剂:gDNA Eraser、5X gDNA Eraser Buffer、PrimeScript RT Enzyme Mix I、5X PrimerScript Buffer 2、RT Primer Mix、RNaseFree dH2O;
(3)定量PCR检测表达试剂:lncRNA-AB007962实时荧光定量PCR特异性引物、GAPDH内参实时荧光定量PCR特异性PCR引物、实时荧光定量SYBR染料、无酶水。
定量PCR检测表达试剂包含用于检测lncRNA-AB007962表达的引物序列,引物序列为SEQ ID No.2,以及内参基因GAPDH表达的引物序列,引物序列为SEQ ID No.3。
所用定量PCR检测表达试剂引物适用于SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、复合探针的检测。
实施例1
制备患者胃组织中lncRNA-AB00762检测试剂盒(50次反应)包括:
96对胃癌与其配对癌旁正常组织中lncRNA-AB007962表达情况的检测步骤:
一、临床样本的收集:收集中国医科大学附属第一医院2009-2010年期间存档的96对接受胃癌根治性切除术患者术中保存的胃癌冰冻新鲜组织及其配对癌旁正常组织分别置于1.5mlDNase/RNase-free(Axygen公司)离心管中,经液氮桶转移至-80℃冰箱保存,所有患者对参与科学研究均有知情同意。
二、组织中总RNA的提取:严格遵循低温环境下冰上操作原则,取胃癌组织及其配对癌旁正常组织重量为50-100mg,置入DNase/RNase-free离心管(Axygen公司)后加入1ml TrizoL(LifeTechnologies公司;货号:15596-026)充分匀浆。静置5分钟后每管加入200μl氯仿,剧烈震荡15-30秒,静置2-3分钟后,置于低温离心机中,4℃,12000转/分钟条件下离心15分钟。取上层水相加入新的DNase/RNase-free离心管中,每管加入预冷异丙醇500μl,上下混匀,充分颠倒数次,冰上静置10分钟后,于4℃,12000转/分钟条件下离心10分钟。弃上清,加入无酶水稀释的75%乙醇1ml,轻轻吹打混匀,4℃8500转/分钟再次离心5分钟,弃尽上清后室温干燥10分钟,加入适量无酶水溶解RNA;分光光度计(Nanophotometer P-Class(Implen GmbH,Munich,Germany))测RNA的浓度及纯度,OD260/280比值在1.8-2.0之间,-80℃保存。
三、总RNA逆转录为cDNA:
第一步为去DNA反应:使用Takara公司去DNA试剂盒(PrimeScriptTM RTreagent Kit with gDNA Eraser),在新的DNase/RNase-free PCR管中(Axygen公司,200μl)配置去DNA反应液,体系为10μl如下:
组分 | 加入量(μl) |
gDNA Eraser | 1 |
5×gDNA Eraser缓冲液 | 2 |
RNA样本 | x |
无酶水 | 7-x |
注:加入的RNA样本的体积根据总RNA的浓度计算所得,x=1μg/RNA浓度。
将装有反应液的DNase/RNase-free PCR管放入PCR仪(PCRSystem 9700)中,42℃度孵育2分钟。
第二步为反转录反应:使用Takara公司提供的反转录试剂盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser;货号:RR047A)在DNase/RNase-free PCR管(Axygen公司,200μl)中配置反转录反应液,体系为20μl如下:
组分 | 加入量(μl) |
第一步去DNA反应液 | 10 |
5X PrimeSript缓冲液2 | 4 |
PrimeSript RT Enzyme Mix I | 1 |
RT Primer Mix | 1 |
无酶水 | 4 |
将上述10μl体系的去DNA反应液及10μl体系的反转录反应液混合成20μl,置于PCR仪(PCR System 9700)中,37℃孵育15分钟,85℃灭活5秒反应后得到cDNA。
四、定量PCR检测lncRNA-AB007962表达情况:
配置检测lncRNA-AB007962的实时荧光定量PCR反应液25μl如下:
严格冰上操作,将第二步中逆转录产物用无酶水稀释3倍,混匀后,将检测lncRNA-AB007962的实时荧光定量PCR反应液加入至DNase/RNase-free PCR排管中(Genview公司),封盖后,放入PCR定量检测仪(Roche480II)检测托盘中,程序设定为:95℃30s预变性循环1次,接着95℃30s,60℃30s循环45次(注:退火温度为56-62℃,60℃最适)。
五、数据统计分析:本实验数据采用相对定量分析的方法,以GAPDH作为内参基因,以2-ΔCt及2-ΔΔCt为计算模型,数据汇总后应用SPSS 17.0软件进行分析,所有统计结果均以p<0.05认为存在显著差异,分析结果示:96例接受胃癌根治性切除术患者的组织中,lncRNA-AB007962表达量在96例胃癌组织中有58例下调,38例上调,且lncRNA-AB007962在胃癌组织中表达量的2-ΔCt均值低于癌旁正常组织的2-ΔCt均值,由此可知lncRNA-AB007962在胃癌组织中的表达量显著低于配对癌旁正常组织的表达量。
非参数检验Mann-Whitney U及Kruskall-Wallis分析发现,lncRNA-AB007962的表达水平与胃癌主癌最大径显著相关(P=0.033),见表1。使用Log-rank检验进一步绘制Kaplan-Meier生存曲线发现lncRNA-AB007962与Lauren分型为肠型患者的预后生存期时间显著相关(p=0.006),参见图3,lncRNA-AB007962高表达患者具有更久的生存期。
表1为lncRNA-AB007962表达情况与临床病理资料的关系。
以上研究表明,lncRNA-AB007962可以作为胃癌发生与预后结局评估的新型分子标志物。为胃癌发生与诊断评估提供有力的分子生物学基础,特别是为Lauren分型为肠型的胃癌患者的预后生存期评价和预测提供了强有力的分子生物学依据,具有深远的临床意义和推广性。
Claims (6)
1.在胃癌组织中低表达的分子标志物lncRNA-AB007962,其特征在于:lncRNA-AB007962的核酸序列为SEQ ID No.1。
2.根据权利要求1所述分子标志物lncRNA-AB007962的用途,其特征在于:用于制备评估Lauren分型为肠型的胃癌患者预后的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的用途,其特征在于:试剂盒采用实时荧光定量PCR检测试剂盒,该试剂盒包括:
(1)癌与癌旁组织提取总RNA试剂;
(2)总RNA反转录为cDNA试剂;
(3)定量PCR检测表达试剂。
4.据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于:该试剂盒包括:
(1)癌与癌旁组织提取总RNA试剂:TRIzoL、三氯甲烷、异丙醇、75%乙醇、无酶水;
(2)总RNA反转录为cDNA试剂:gDNA Eraser、5X gDNA Eraser Buffer、PrimeScript RT Enzyme Mix I、5X PrimerScript Buffer 2、RT Primer Mix、RNaseFree dH2O;
(3)定量PCR检测表达试剂:lncRNA-AB007962实时荧光定量PCR特异性引物、GAPDH内参实时荧光定量PCR特异性PCR引物、实时荧光定量SYBR染料、无酶水。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于:定量PCR检测试剂中包含用于检测lncRNA-AB007962表达的引物序列,引物序列为SEQ ID No.2,以及作为内参的基因GAPDH表达的引物序列,引物序列为SEQ ID No.3。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于:所用定量PCR检测表达试剂中的引物序列适用于SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、复合探针的检测。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20151104 |
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |