CN111172287A - 外泌体lncRNA RN7SL5P作为内参基因在胃癌lncRNA检测中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供外泌体lncRNA RN7SL5P作为内参基因在胃癌lncRNA检测中的应用，属于生物医学技术领域。具体的，本发明通过高通量深度测序及扩大临床样本表达验证证明，lncRNA RN7SL5P可作为内参应用在胃癌外泌体lncRNAs的检测中，本发明以LncRNA RN7SL5P作为胃癌血清外泌体lncRNAs检测的内参基因，开发了相应的检测试剂盒，该试剂盒检测灵敏度高、特异性高、检测方便，满足诊断胃癌病人的检测需求，经临床验证诊断准确率高，具有良好的实际应用之价值。

Description

外泌体lncRNA RN7SL5P作为内参基因在胃癌lncRNA检测中的 应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及外泌体lncRNA RN7SL5P作为内参基因在胃癌lncRNA检测中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

胃癌是常见的消化系统肿瘤，其死亡率在我国居恶性肿瘤第三位，严重威胁人类健康。早期诊断困难是导致胃癌高死亡率的重要原因之一，研究发现2/3的患者初诊时已处于进展期，5年生存率仅为25％。而如能早期发现并采取有效的治疗措施，5年生存率可达90％。目前临床上诊断胃癌的手段主要为内镜检查加活检、影像学检查、肿瘤标志物等，它们虽各有优势，但或为有创检查，或敏感性或特异性不足，不能满足临床需要。因此，寻找敏感度、特异性高的标志物用于胃癌无创性早期诊断是目前临床亟待解决的难题。

外泌体(exosomes)是细胞分泌的一类直径为50-150nm的膜性小囊泡，可被受体细胞摄取，在细胞间通讯中发挥重要作用。外泌体含有非编码RNA、mRNA、蛋白质和脂质等成分，其中长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)占外泌体中RNA分子的3.36％，其长度大于200nt、不编码蛋白质，通过转录后调控等方式参与多种病理生理过程。肿瘤生长过程中不断将外泌体释放至细胞外体液，携带有肿瘤异常信息的lncRNAs富集在外泌体中，其变化能直接反映肿瘤细胞状态及功能的异常改变。且由于受到膜性结构的保护，外泌体lncRNAs更稳定，能够耐受RNA酶、酸碱处理、冻融次数等多种因素。另外分离血清外泌体克服了直接利用血液提取lncRNAs进行肿瘤诊断的血液中非检测物质的影响，使检测结果更加精确并接近真实水平，这些特点使得外泌体中lncRNAs较循环总lncRNAs更宜作为无创诊断标志物。研究显示血清/血浆中外泌体lncRNAs的表达具有肿瘤相关性、组织特异性及表达稳定性，已证实胃癌血清/血浆中外泌体中多种lncRNAs表达上调，如LINC00152、ZFAS1、HOTTIP等，能够作为潜在的标志物对胃癌更好的进行早期诊断，这表明检测血清外泌体来源的lncRNAs，并用来诊断胃癌是可行的、稳定的、可重复的研究。

在基因表达研究中多种因素可导致偏差，如RNA的浓度和质量，但我们可以采用内参基因来矫正这种偏差。外泌体lncRNAs内参基因的选择非常重要，研究表明，内参基因的选择可对RT-PCR结果产生显著影响，如果选择不当，会使样本间基因表达差异被掩盖或扩大，从而导致错误甚至相反的结论。由于外泌体lncRNAs的表达具有组织特异性，且与肿瘤类型密切相关，因此在选择内参基因时需考虑肿瘤类型、样本来源及实验方法等因素。

LncRNAs和miRNAs均为非编码RNAs，但其反转录和PCR扩增方法及体系均不同。近年来外泌体miRNAs已经出现了内参基因的研究，如miR-129、miR-16、miR-484等，但对于外泌体中的lncRNAs甚至mRNA的内参，尚未见相关研究报道。发明人发现，大多数研究者主要根据自己的经验或参考文献，采用GAPDH或β-actin为内参，但其样本间表达差异较大，而加入标准品作为外源性对照，但其不能纠正样本采集的差异，这就制约了研究成果的转化和不同实验室之间研究成果的比较，因此上述基因都不是最理想的选择。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供外泌体lncRNA RN7SL5P作为内参基因在胃癌lncRNA检测中的应用，具体的，本发明通过高通量深度测序及扩大临床样本表达验证证明，血清外泌体中的lncRNA RN7SL5P可作为内参基因应用在胃癌外泌体lncRNAs的检测中，具有良好的实际应用之价值。

为了实现上述目的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供一种胃癌lncRNAs检测内参，所述检测内参为lncRNARN7SL5P；

所述lncRNA RN7SL5P的核苷酸序列如下：

GCCGGGCGCGGTGGCGCGTGCCTGTGGTCCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGGCTGGAGGATCGCTTGAGTCCAGGAGTTCTGGGCTGTAGTGCGCTATGCCGATCGGGTGTCCGCACTAAGTTCGGCATCAATATGGTGACCTCCCGGGAGCGGGGGACCACCAGGTTGCCTAAGGAGGGGTGAACCGGCCCAGGTCGGAAACGGAGCAGGTCAAAACTCCCGTGCTGATCAGTAGAAGTCTGTAATGCTACTGGTGTCCCCTAATTTTCTTATAGCCACAGTTCCTTT(SEQ IDNo.1)。

进一步的，胃癌lncRNAs检测样本为血浆和/或血清样本外泌体；因此，所述lncRNARN7SL5P为血浆和/或血清样本外泌体中的lncRNA RN7SL5P。

本发明的第二个方面，提供上述lncRNA RN7SL5P作为内参在胃癌lncRNAs检测中的应用。

其中，胃癌lncRNAs检测样本为血浆和/或血清样本外泌体；所述lncRNA RN7SL5P为血浆和/或血清样本外泌体中的lncRNA RN7SL5P。

本发明的第三个方面，提供了检测lncRNA RN7SL5P表达水平的物质在制备用于胃癌lncRNAs检测产品中的应用。

其中，所述物质包括但不限于基于高通量测序方法和/或基于RT-PCR方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测上述LncRNA RN7SL5P表达水平的物质。

所述产品包括但不限于试剂盒。

本发明的第四个方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒至少包括针对上述lncRNARN7SL5P的扩增引物。

进一步的，所述正向引物为：5'-TGCCTGTGGTCCCAGCTACT-3'(SEQ ID No.2)；所述反向引物为：5'-GAGGTCACCATATTGATGCCGA-3'(SEQ ID No.3)。

更进一步的，所述试剂盒包括用于配制反转录反应体系的试剂和/或用于配制qPCR反应体系的试剂。

上述试剂盒至少存在如下应用：

a)通过检测血清外泌体中LncRNA RN7SL5P表达水平来对胃癌血清外泌体中lncRNAs的检测进行标准化；

b)对胃癌进行诊断和/或辅助诊断。

本发明的第五个方面，提供一种诊断和/或辅助诊断胃癌的方法，所述方法包括对受试对象血浆/血清外泌体来源的lncRNAs进行检测，其中，使用血浆和/或血清样本外泌体中的lncRNA RN7SL5P作为检测内参。

以上一个或多个技术方案的有益技术效果：

(1)经过高通量深度测序及扩大临床样本表达验证，筛选得到LncRNA RN7SL5P能够作为胃癌血清外泌体lncRNAs检测内参。

(2)为研制提高LncRNA RN7SL5P应用提供了依据。

(3)以LncRNA RN7SL5P作为胃癌血清外泌体lncRNAs检测的内参基因，开发了相应的检测试剂盒，该试剂盒检测灵敏度高、特异性高、检测方便，满足诊断胃癌病人的检测需求，经临床验证诊断准确率高。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1a为本发明实施例中测序结果显示候选内参lncRNAs分子在对照组(Control)和胃癌组(Gastric cancer)血清外泌体中的表达水平热图；

图1b测序结果显示候选内参lncRNAs分子在对照组(Control)和胃癌组(Gastriccancer)血清外泌体中的表达水平柱状分析图；

图2为本发明实施例中血清外泌体lncRNA RN7SL5P在对照组(Control)、不典型增生组(atypical hyperplasia)和胃癌组(Gastric cancer)表达图。

图3为本发明实施例中血清外泌体lncRNA linc-ROR在对照组(Control)、不典型增生组(atypical hyperplasia)和胃癌组(Gastric cancer)表达图。

图4为本发明实施例中血清外泌体lncRNA linc-ROR对胃癌诊断ROC分析图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

如前所述，现有技术中在对胃癌血清/血浆中外泌体lncRNAs进行检测时，大多数研究者主要根据自己的经验或参考文献，采用GAPDH或β-actin为内参，但其样本间表达差异较大，而加入标准品作为外源性对照，但其不能纠正样本采集的差异，这就制约了研究成果的转化和不同实验室之间研究成果的比较。本发明通过高通量深度测序及扩大临床样本表达，筛选得到LncRNA RN7SL5P能够作为胃癌血清外泌体lncRNAs检测内参。

有鉴于此，在本发明的一个典型实施方式中，提供一种胃癌lncRNAs检测内参，所述内参为lncRNA RN7SL5P；

所述lncRNA RN7SL5P的核苷酸序列如下：

GCCGGGCGCGGTGGCGCGTGCCTGTGGTCCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGGCTGGAGGATCGCTTGAGTCCAGGAGTTCTGGGCTGTAGTGCGCTATGCCGATCGGGTGTCCGCACTAAGTTCGGCATCAATATGGTGACCTCCCGGGAGCGGGGGACCACCAGGTTGCCTAAGGAGGGGTGAACCGGCCCAGGTCGGAAACGGAGCAGGTCAAAACTCCCGTGCTGATCAGTAGAAGTCTGTAATGCTACTGGTGTCCCCTAATTTTCTTATAGCCACAGTTCCTTT(SEQ IDNo.1)。

本发明的又一具体实施方式中，胃癌lncRNAs检测样本为血浆和/或血清样本外泌体；因此，所述lncRNA RN7SL5P为血浆和/或血清样本外泌体中的lncRNA RN7SL5P。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述lncRNA RN7SL5P作为内参在胃癌lncRNAs检测中的应用。

其中，胃癌lncRNAs检测样本为血浆和/或血清样本外泌体；所述lncRNA RN7SL5P为血浆和/或血清样本外泌体中的lncRNA RN7SL5P。

本发明的又一具体实施方式中，涉及的具体技术方案包括：

(1)收集胃癌患者及健康人静脉血(每组各4例)，分离血清，高通量测序筛选差异LncRNA。

(2)扩大样本量(每组各14例)，荧光实时定量PCR(qPCR)验证LncRNA表达。

(3)大样本验证。

(4)应用内参检测血清外泌体linc-ROR对胃癌的诊断价值。

(5)ROC曲线分析检验效能。

本发明的又一具体实施方式中，提供了检测lncRNA RN7SL5P表达水平的物质在制备用于胃癌lncRNAs检测产品中的应用。

其中，所述物质包括但不限于基于高通量测序方法和/或基于RT-PCR方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测上述LncRNA RN7SL5P表达水平的物质。

其中，基因测序能够检测基因表达水平的相对变化，例如Illumina测序。Illumina平台是一种基于边合成边测序技术(Sequencing-By-Synthesis，SBS)的测序方法。由于可逆阻断技术可以实现每次只合成一个碱基，并标记荧光基团，再利用相应的激光激发荧光基团，捕获激发光，从而读取碱基信息。高通量测序得到的原始图像数据文件经碱基识别(Base Calling)分析转化为原始测序序列，称之为Raw Data或Raw Reads，结果以FASTQ(简称为fq)文件格式存储。利用hisat2将Clean Reads与指定的参考基因组进行序列比对，获取在参考基因组或基因上的位置信息，以及测序样品特有的序列特征信息。一个基因表达水平的直接体现就是其转录本的丰度情况，转录本丰度程度越高，则基因表达水平越高。在转录组测序分析中，可以通过定位到转录本外显子区的测序序列(reads)的计数来估计基因的表达水平。转录本表达量的计算使用FPKM法(Fragments Per kb Per MillionReads)，是每百万fragments中来自某一转录本每千碱基长度的fragments数目。FPKM同时考虑了测序深度和转录本长度对fragments计数的影响，是目前最为常用的转录本表达水平估算方法。

FPKM计算公式如下：

所述产品包括但不限于试剂盒。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种试剂盒，所述试剂盒至少包括针对上述lncRNA RN7SL5P的扩增引物。

本发明的又一具体实施方式中，所述正向引物为：5'-TGCCTGTGGTCCCAGCTACT-3'(SEQ ID No.2)；所述反向引物为：5'-GAGGTCACCATATTGATGCCGA-3'(SEQ ID No.3)。

本发明的又一具体实施方式中，所述检测试剂盒包括用于配制反转录反应体系的试剂和/或用于配制qPCR反应体系的试剂。

本发明的又一具体实施方式中，用于配制反转录反应体系的试剂至少包括反转录缓冲液(MLV-5×buffer)、dNTP混合液、RNA酶蛋白质抑制剂(RNAsin)、反转录酶液(M-MLV)和多聚胸腺嘧啶(OligodT)。

本发明的又一具体实施方式中，用于配制qPCR反应体系的试剂至少包括针对LncRNA RN7SL5P的正向引物液和反向引物液，还包括SYBR Green混合液、无核酸酶纯水。

本发明的又一具体实施方式中，上述试剂盒至少存在如下应用：

a)通过检测血清外泌体中LncRNA RN7SL5P表达水平来对胃癌血清外泌体中lncRNAs的检测进行标准化；

b)对胃癌进行诊断和/或辅助诊断。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种诊断和/或辅助诊断胃癌的方法，所述方法包括对受试对象血浆/血清外泌体来源的lncRNAs进行检测，其中，使用血浆和/或血清样本外泌体中的lncRNA RN7SL5P作为检测内参。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。

实施例

一、实验对象纳入与排除标准：

(一)病例来源

全部病例均来源于2016年12月至2017年12月山东大学齐鲁医院住院病人。正常对照组血样均来自于山东大学齐鲁医院健康查体者，为无心、脑、肺、肝、肾疾病和癌症疾病，无已知影响研究指标疾病。

(二)诊断标准

胃癌诊断根据组织病理学检查，分期根据UICC/AJCC TNM staging system(2010)。

(三)病例排除标准

(1)胃间质瘤；(2)12个月内使用抗生素或质子泵抑制剂(PPI)治疗；(3)免疫系统疾病史；(4)恶性肿瘤史；(5)临床资料不完整；(6)感染性疾病；(7)不愿参与本研究。

(四)健康对照纳入排除标准

纳入标准：(1)体格检查正常；(2)血、尿、便、血沉、肝功能、肾功能、电解质、血糖、血脂指标正常(3)心电图、腹部超声、胸部X片未见异常。

排除标准：12个月内患有糖尿病、肠易激综合征、腹腔疾病或使用抗生素和/或益生菌治疗的患者。

(五)收集胃癌患者及健康人静脉血(每组各4例)，分离血清外泌体(Qiagen)并鉴定。

二、高通量检测

1、RNA质控

2、RNA文库制备及测序

在上海云序生物科技有限公司进行转录组高通量测序和随后的生物信息学分析。根据供应商说明，使用Ribo-Zero rRNA Removal Kits(Illumina，美国)移除总RNA中的rRNAs。使用TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit(Illumina，美国)预处理RNA，构建测序文库。使用BioAnalyzer2100仪器(Agilent Technologies，美国)进行文库质控和定量。根据Illumina测序说明，将10pM文库变性为单链DNA分子，在Illumina flowcell上捕获，原位扩增为簇(cluster)，并在Illumina HiSeq测序仪上采用双端模式(PE mode)进行150cycle测序。

3、数据分析

在上海云序生物科技有限公司进行转录组高通量测序和随后的生物信息学分析。经过Illumina HiSeq 4000测序仪测序，收获双端reads。利用Q30进行质控，使用cutadapt(v1.9.3)软件去接头，去低质量reads，获得高质量reads。

LncRNA：使用hisat2软件(v2.0.4)，将高质量reads比对到人类参考基因组(UCSCHG19)上。然后，在gtf基因注释文件指导下，使用cuffdiff软件(cufflinks软件套件的一部分)获得转录本水平LncRNA的FPKM(Fragments per kilobase of exon per millionfragments mapped)值，作为LncRNA的表达谱，并计算两个/组样品间的倍数变化和p-value以筛选差异表达LncRNA。根据临近关系，预测LncRNA的靶基因，进行靶基因的GO和KEGG通路分析。

4、结果

根据测序结果，设定标准(FPKM Values在样本中表达均稳定表达，且大于100，在两组间无显著差异，P>0.05)，共筛选出5个lncRNAs分子(RN7SL5P、RN7SKP203、XLOC_002206、XLOC_013276、BC018860)，见图1。此外，由于GAPDH被用作组织lncRNAs或mRNAs检测的内参分子，为验证其在血清外泌体中是否也可以作为内参，因此GAPDH也被纳入。

图1测序结果显示候选内参lncRNAs分子在对照组(Control)和胃癌组(Gastriccancer)血清外泌体中的表达水平。

三、qRT-PCR验证lncRNAs表达

1、收集胃癌患者及健康人静脉血(每组各14例)，分离血清外泌体

2、设计上述lncRNAs的特异性引物

3、lncRNAs的逆转录及PCR

lncRNAs的逆转录及PCR过程分别根据试剂盒进行，逆转录(mRNA检测-QP006+QP001)。计算方法为2^-ΔΔCt方法。扩增条件为95℃ 10min,40个循环(95℃ 15s,62℃ 20s,72℃ 10s)。

4、小样本结果

去除表达水平较低(Ct值大于35)的lncRNAs分子，剩余分子(RN7SL5P、XLOC_002206、BC018860、GAPDH)检测在两组间表达无差异。Normfinder及geNorm软件分析lncRNAs的稳定性，见表1，结果显示稳定性最高的内参为lncRNA RN7SL5P。

表1在健康对照和胃癌患者血清外泌体中候选lncRNA的表达稳定性分析

sanger测序，结果如下：

TGCCTGTGGTCCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGGCTGGAGGATCGCTTGAGTCCAGGAGTTCTGGGCTGTAGTGCGCTATGCCGATCGGGTGTCCGCACTAAGTTCGGCATCAATATGGTGACCTC(SEQ ID No.4)

5、大样本结果

扩大样本量，收集健康对照48例、不典型增生43例、胃癌144例患者血清，按上述方法提取外泌体RNA，lncRNA RN7SL5P的正向引物5'-TGCCTGTGGTCCCAGCTACT-3'(SEQ IDNo.2)和反向引物5'-GAGGTCACCATATTGATGCCGA-3'(SEQ ID No.3)，产物大小为125bp。扩增条件为95℃ 10min,40个循环(95℃ 15s,62℃ 20s,72℃ 10s)。

图2显示lncRNA RN7SL5P在三组之间的表达无显著差异。

6、Linc-ROR表达

Forward：5'-AGTTATAGTTCTTCCAGGTCTCAGG-3'(SEQ ID No.5)，Reverse：5'-GGTTCTAAGCAGAGTGGCGA-3'(SEQ ID No.6)。产物大小为218bp。扩增条件同lncRNARN7SL5P。

结果显示linc-ROR在胃癌中的表达高于健康对照及不典型增生(图3)，对胃癌具有诊断价值(图4)，AUC为0.811(0.746-0.877)，敏感性为78.5(70.9-84.9)％，特异性为66.7(51.6-79.6)％。

7.统计学分析：

采用SPSS 25.0软件(SPSS Inc.,USA)。连续变量采用中位数(Median)和平均值±标准差

表示；两组比较采用t检验或Mann-Whitney U检验。通过绘制受试者工作特征(ROC)曲线和计算相应的曲线下面积(AUC)来判断诊断能力。最佳cutoff值选取为灵敏度和特异性之和最大所对应的值。P<0.05(双侧)为有统计学差异。

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学齐鲁医院

<120> 外泌体lncRNA RN7SL5P作为内参基因在胃癌lncRNA检测中的应用

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 288

<212> DNA

<213> lncRNA RN7SL5P

<400> 1

gccgggcgcg gtggcgcgtg cctgtggtcc cagctactcg ggaggctgag gctggaggat 60

cgcttgagtc caggagttct gggctgtagt gcgctatgcc gatcgggtgt ccgcactaag 120

ttcggcatca atatggtgac ctcccgggag cgggggacca ccaggttgcc taaggagggg 180

tgaaccggcc caggtcggaa acggagcagg tcaaaactcc cgtgctgatc agtagaagtc 240

tgtaatgcta ctggtgtccc ctaattttct tatagccaca gttccttt 288

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgcctgtggt cccagctact 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaggtcacca tattgatgcc ga 22

<210> 4

<211> 125

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgcctgtggt cccagctact cgggaggctg aggctggagg atcgcttgag tccaggagtt 60

ctgggctgta gtgcgctatg ccgatcgggt gtccgcacta agttcggcat caatatggtg 120

acctc 125

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agttatagtt cttccaggtc tcagg 25

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggttctaagc agagtggcga 20

Claims (10)

1.一种胃癌lncRNAs检测内参，其特征在于，所述检测内参为lncRNA RN7SL5P。

2.如权利要求1所述的胃癌lncRNAs检测内参，其特征在于，所述lncRNA RN7SL5P的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.如权利要求1所述的胃癌lncRNAs检测内参，其特征在于，胃癌lncRNAs检测样本为血浆和/或血清样本外泌体；

所述lncRNA RN7SL5P为血浆和/或血清样本外泌体中的lncRNA RN7SL5P。

4.lncRNA RN7SL5P作为内参在胃癌lncRNAs检测中的应用。

5.如权利要求4所述应用，其特征在于，胃癌lncRNAs检测样本为血浆和/或血清样本外泌体；所述lncRNA RN7SL5P为血浆和/或血清样本外泌体中的lncRNA RN7SL5P。

6.检测lncRNA RN7SL5P表达水平的物质在制备用于胃癌lncRNAs检测产品中的应用。

7.如权利要求6所述应用，其特征在于，所述物质包括但基于高通量测序方法和/或基于RT-PCR方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测所述LncRNA RN7SL5P表达水平的物质；

优选的，所述产品包括试剂盒。

8.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括针对lncRNA RN7SL5P的扩增引物。

9.如权利要求8所述试剂盒，其特征在于，正向引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；反向引物核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

优选的，所述试剂盒还包括用于配制反转录反应体系的试剂和/或用于配制qPCR反应体系的试剂。

10.如权利要求8或9所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒具有如下应用：

a)通过检测血清外泌体中LncRNA RN7SL5P表达水平来对胃癌血清外泌体中lncRNAs的检测进行标准化；

b)对胃癌进行诊断和/或辅助诊断。

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