CN113388682A - 基于基因的诊断胃癌的产品及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于基因的诊断胃癌的产品及其应用，所述的产品包括检测LINC02828的表达水平的试剂。本发明首次发现了LINC02828在胃癌组织中表达下调，通过对LINC0282进行AUC分析，发现LINC02828具有较高的诊断价值，通过检测LINC02828的表达水平可以诊断胃癌或预测胃癌患者使用Notch1抑制剂预后。本发明同时为胃癌的预防和治疗提供了基因靶点。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，更具体地，本发明涉及基于基因的诊断胃癌的产品及其应用。
背景技术
胃癌(gastric cancer)是世界范围内第四常见的癌症，每年诊断出约1,000,000个病例。胃癌是一种具有高死亡率的疾病(每年约有800,000人死亡)，这使得它成为继肺癌之后世界范围内癌症死亡的第二常见的原因。在胃癌早期，通常没有临床症状或仅表现出非特异性的症状，因而在疾病到达晚期之前在很多病例中无法作出诊断，这通常导致较差的预后，因此需要寻找诊断、监测和治疗胃癌的新方法。
Notch1信号途径是进化高度保守的Ⅰ型跨膜糖蛋白，该信号途径广泛参与了血细胞发育分化、血管形成及多种肿瘤的发生，是目前研究的一个热点。近年来研究发现，Notch1在多种恶性肿瘤包括胃癌中表达失调，且其表达水平与胃癌的侵袭、转移及预后密切相关。Yeh等采用Western Blot分析发现在胃癌细胞中，Notch1及其靶基因c-Myc表达上调(Yeh,T.S.,et al."The activated Notch1 signal pathway is associated withgastric cancer progression through cyclooxygenase-2."Cancer Research 69.12(2009):5039.)。提示在胃癌细胞系中，Notch1信号通路被活化。另外，该实验还发现活化的信号通路增强了胃癌细胞的侵袭和转移能力。李大卫用免疫组化法检测发现，Notch1在胃癌组织中表达上调，显著高于正常胃粘膜组织(李大卫,吴晴,彭志海,等.Notch1和PTEN在胃癌组织中的表达及其意义[J].癌症,2007,26(11):1183-1187.)。其次，Notch1表达水平越高，预后越差，生存期越短。WeiG等用Notch1-siRNA转染胃癌细胞后发现，胃癌细胞的増殖与侵袭能力明显降低(Wei G,Chang Y,Zheng J,et al.Notch1 silencing inhibitsproliferation and invasion in SGC-7901 gastric cancer cells[J].MolecularMedicine Reports,2014,9(4):1153-1158.)，因此，通过沉默Notch1的表达来寻找差异表达的lncRNA有望寻找到新的胃癌的生物标志物，为诊断胃癌提供新方法，并为发展新的更有效的治疗提供可能性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种诊断胃癌的生物标志物，发现胃癌诊断的新方法。
为了实现上述的目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明一方面提供了一种LncRNA作为生物标志物在制备诊断胃癌或预测胃癌患者使用Notch1抑制剂预后的产品中的应用，所述的LncRNA包括LINC02828。
进一步，所述的产品包括通过RT-PCR、qPCR、原位杂交或高通量测序平台检测样本中LINC02828的表达水平的试剂。
进一步，所述的试剂选自：
特异性识别LINC02828的探针；
或特异性扩增LINC02828的引物；
进一步，所述的特异性扩增LINC02828的引物序列如SEQ ID NO.5～6所示。
本发明另一方面提供了一种诊断胃癌或预测胃癌患者使用Notch1抑制剂预后的产品，所述的产品通过检测样本中LINC02828的表达水平来诊断胃癌或预测胃癌患者使用Notch1抑制剂预后。
进一步，所述的产品包括试剂盒、芯片、核酸膜条。
本发明另一方面提供了一种预防或治疗胃癌的药物组合物，所述的的药物组合物包括LINC02828的促进剂。
进一步，所述的促进剂为特异性促进LINC02828表达的载体。
进一步，所述的药物组合物还包括稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、PH控制剂或表面活性剂。
本发明另一方面提供了LINC02828在制备预防或治疗胃癌的药物组合物中的应用。
本发明另一方面提供了一种筛选预防或治疗胃癌的候选药物的方法，所述的方法包括：用待筛选物质处理表达或含有LINC02828的体系；检测所述体系中LINC02828的表达水平；其中，若所述待筛选的物质可以促进LINC02828的表达，则表明该候选物质是预防或治疗胃癌的候选药物。
本发明另一方面提供了LINC02828在筛选预防或治疗胃癌的候选药物中的应用。
本发明另一方面提供了一种诊断胃癌或预测胃癌患者使用Notch1抑制剂预后的方法。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现LINC02828的差异表达与胃癌相关，通过检测LINC02828可以诊断胃癌或预测胃癌患者使用Notch1抑制剂预后，为诊断胃癌或预测胃癌患者使用Notch1抑制剂预后提供了一种新方法。
本发明还提供了一种预防或治疗胃癌的药物组合物。
本发明还提供了一种筛选预防或治疗胃癌的候选药物的方法。
附图说明
图1是转染Notch1敲除慢病毒后胃癌细胞中的Notch1蛋白表达水平图；其中，图A是MKN45细胞的Notch1蛋白表达水平图；图B是MGC-803细胞的Notch1蛋白表达水平图；图C是AGS细胞的Notch1蛋白表达水平图；
图2是qPCR检测胃癌组织中LINC02828相对表达量统计图；
图3是LINC02828诊断胃癌的ROC曲线图。
具体实施方式
胃癌
在本文中，术语“胃癌(gastric cancer)”和“胃癌(stomach cancer)”具有相同的含义，并且指胃部或胃细胞的癌症。这类癌症可以是发生在胃内膜(粘膜或或胃上皮)中的腺癌，还可以位于胃的幽门部、体部或贲门部(下部、体部和上部)。“胃癌细胞”是具有胃癌特征的胃上皮细胞，并且包括癌前细胞，所述癌前细胞处于向癌细胞的转变的早期或有倾向转变成癌细胞。这类细胞可以表现出癌细胞的一种或多种表型性状特征。
在本文中，术语“或”通常的含义包括“和/或”，除非文中内容明确表明并非如此。
生物标志物
在本发明中，术语“生物标志物”意指化合物，优选是基因，与来自具有第二表型(例如没有疾病)的受试者或一组受试者的生物样品相比，它在来自具有第一表型(例如患有疾病)的受试者或一组受试者的生物样品中差异地存在(即增加或减少)。术语“生物标志物”通常是指一种基因的存在/浓度/含量或两种或更多种基因的存在/浓度/含量。
所述的LINC02828是指Gene ID为105374978的基因。
当在实验室环境中处理样本时，可能获得最可靠的结果。例如，可在医生办公室中从受试者获取样本，然后将其发送到医院或商业医学实验室进行进一步测试。然而，在许多情况下，可能希望在临床医生的办公室提供即时结果或允许受试者在家中进行测试。在一些情况下，对于便携式、预包装、一次性的、可由受试者在无协助或指导等的情况下即可使用等等的测试的需求比高度准确度更为重要。在许多情况下，尤其是在有医师随访的情况下，进行初步测试，甚至灵敏度和/或特异度降低的测试也可能就足够了。因此，以产品形式提供的测定可涉及检测和测量相对少量的生物标志物，以降低测定的复杂性和成本。
可使用本文所述的能够检测样本生物标志物的任何形式的样本测定。通常，所述测定将定量样本中生物标志物至一定的程度，例如它们的浓度或量是高于还是低于预定阈值。此类试剂盒可采取测试条、浸杆、盒、药筒、基于芯片或基于珠粒的阵列、多孔板或一系列容器等的形式。提供一种或多种试剂以检测所选样本生物标志物的存在和/或浓度和/或量。可将受试者的样本直接分配到测定中，或从存储的或先前获得的样品中间接分配到测定中。高于或低于预定阈值的生物标志物的存在或不存在可以例如通过发色、发荧光、电化学发光或其他输出(例如在酶免疫测定(EIA)，诸如酶联免疫测定(ELISA)中)来显示。
术语“表达的水平”或“表达水平”通常可互换使用，且一般指生物学样品中多核苷酸、mRNA或氨基酸产物或蛋白质的量。“表达”一般指基因所编码的信息转换成细胞中存在的和运行的结构的过程。基因的“表达”可以指转录成多核苷酸、翻译成蛋白质、或甚至蛋白质的翻译后修饰。转录得到的多核苷酸的、翻译得到的蛋白质的、或翻译后修饰得到的蛋白质的片段也应视为表达的，无论它们是源自通过可变剪接生成的转录物或经过降解的转录物，或者是源自蛋白质的翻译后加工(例如通过蛋白水解)。“表达的基因”包括转录成多核苷酸(如mRNA)、然后翻译成蛋白质的基因，还有转录成RNA但不翻译成蛋白质的基因(例如miRNA)。
探针、引物
术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严格性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。
本文所用的“引物”是指可以在扩增方法(如聚合酶链式反应(PCR))中使用来基于对应于目的基因的多核苷酸序列扩增核苷酸序列的寡核苷酸。通常，用于扩增多核苷酸序列的至少一条PCR引物对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于多种因素，包括温度、引物来源和所用的方法。例如，对于诊断和预后应用，根据靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有至少10、或15、或20、或25或更多个核苷酸，但是其可以含有更少核苷酸或更多核苷酸。确定引物合适长度中涉及的因素是本领域技术人员熟知的。
试剂盒
本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对肿瘤发展进行判断、对治疗方案进行选择。
试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。
药物组合物
本发明的药物组合物可另外包含药学上可接受的载体。术语载体包括适用于制备所需特定剂型的任何和所有溶剂、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。可用作药学上可接受的载体的材料的一些示例包括，但不限于，糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉末黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；油，诸如花生油、棉籽油、红花油、麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，诸如丙二醇；酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏液；乙醇和磷酸盐缓冲液，以及根据配制人员的判断，组合物中还可以存在其他无毒相容的润滑剂诸如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。
在制备本发明的药物组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括:乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括:湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。
该药物组合物的应用为肿瘤的治疗提供了一种方法，具体为一种预防或治疗对象体内肿瘤的方法，包括将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中。
所述药物组合物用于预防或治疗对象体内肿瘤时，需要将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中。采用该方法，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移被抑制。进一步的，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的部分被抑制。
用于局部给药的典型剂型包括乳膏、软膏、喷雾、洗液和膏药。然而，药物组合物可以被配制成用于任何类型的给药，例如，利用注射器或其它装置的皮内注射、皮下注射、静脉内注射、肌肉内注射、鼻内注射、大脑内注射、气管内注射、动脉内注射、腹膜内注射、膀胱内注射、胸膜内注射、冠状动脉内或肿瘤内注射。还考虑通过吸入(例如，气雾剂)给药或口服给药、直肠给药或阴道给药的剂型。
给药途径
用于局部施加于例如皮肤和眼部的合适剂型优选本领域内公知的水性溶液、软膏、乳膏或凝胶。这种剂型可以含有增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲剂和防腐剂。
用于经皮施加的合适剂型包括伴随载体的有效量的本发明的化合物或药剂。优选的载体包括用于辅助通过宿主皮肤的可吸收的、药学上可接受的溶剂。例如，经皮装置采用绷带的形式，所述绷带包括支持构件、含有化合物和任选载体的贮存器，任选的速率控制屏障以及将所述装置固定于皮肤的部件，所述速率控制屏障能以受控和预定的速率在长的时间段内将化合物递送至宿主皮肤。还可以使用基质经皮剂型。对于口服给药，药物组合物或药物可以采用例如用药学上可接受的赋形剂通过常规方式制备的片剂或胶囊的形式。优选的是包含以下的片剂和明胶胶囊:活性成分，以及(a)稀释剂或填充剂，例如，乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素(例如，乙基纤维素、微晶纤维素)、糖胶、果胶、聚丙烯酸酯和/或磷酸氢钙、硫酸钙，(b)润滑剂，例如，硅石、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁或硬脂酸钙、金属硬脂酸盐、胶体二氧化硅、氢化植物油、玉米淀粉、苯甲酸钠、醋酸钠和/或聚乙二醇；对于片剂还可以包含(c)粘合剂，例如，硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮和/或羟丙基纤维素；如果需要还可以包含(d)崩解剂，例如，淀粉(例如，马铃薯淀粉或淀粉钠)、乙醇酸盐(酯)、琼脂、褐藻酸或其钠盐、或起泡混合物，(e)润湿剂，例如，月桂基硫酸钠和/或(f)吸收剂、着色剂、芳香剂和甜味剂。还可以根据本领域内已知的方法用薄膜包被片剂或用肠衣包被片剂。用于口服给药的液体制剂可以采用例如溶液、糖浆或悬浮液的形式，或者可以将它们提供为干的产品，用于在使用前用水或其它合适介质复原。可以用药学上可接受的添加剂、通过常规方式制备这种液体制剂，所述添加剂例如，悬浮剂，例如，山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化可食脂肪；乳化剂，例如，卵磷脂或阿拉伯树胶；非水性介质，例如，杏仁油、油酯、乙醇或分级的植物油；以及防腐剂，例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸。视情况，所述制剂还可以含有缓冲盐、芳香剂、着色剂和/或甜味剂。需要时，口服给药的制剂可以被适当配制以实现活性化合物的控释。
本发明的化合物和药剂可以配制成通过注射的肠胃外给药，例如通过弹丸注射或连续输注。可以以单位剂量形式提供用于注射的剂型，例如，添加了防腐剂的安瓿或多剂量容器。可注射的组合物优选是水性等渗溶液或悬浮液，并且优选由脂肪乳剂或悬浮液制备栓剂。组合物可以是无菌的和/或含有佐剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶解促进剂、调节渗透压的盐和/或缓冲剂。或者，活性成分可以为粉末形式，在使用前用合适的介质(例如，无菌无热原的水)复原。此外，它们还可以含有其它有治疗价值的物质。分别按照常规的混合、粒化或包被方法来制备组合物，且组合物含有约0.1至75％，优选约1至50％的活性成分。
为了通过吸入给药，可以用合适的推进剂从加压包或或喷雾器中以气雾剂喷雾的方式方便地递送活性成分，所述推进剂例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体。就加压气雾剂而言，可以通过提供阀来递送既定的量，从而确定剂量单位。例如，在吸入器或吹入器中使用的明胶胶囊或明胶盒可以被制备成含有化合物的粉末混合物和合适的粉末基质(例如，乳糖或淀粉)。
还可以将本发明的化合物和药剂配制在直肠组合物中，例如，栓剂或保留灌肠剂，例如，含有常规的栓剂基质，例如，可可油或其它甘油酯。
此外，可以将活性成分配制成贮库制剂。这种长效剂型可以通过植入(例如，皮下或肌肉内)或肌肉内注射来给药。因此，例如，活性成分可以与合适的聚合材料或疏水材料(例如作为可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂一起配制，或者可以被配制成难溶的衍生物，例如，难溶性盐。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1干扰胃癌细胞中的Notch1基因表达
一、实验材料
1、实验试剂：如表1所示，抗体信息如表3所示；
2、实验仪器：如表2所示；
3、Notch1敲除慢病毒、阴性对照慢病毒；
4、胃癌细胞系MKN45、MGC-803、AGS。
表1实验试剂
表2.实验仪器
表3抗体信息
二、实验方法
1、病毒感染
(1)铺板：对数生长期的细胞消化铺板后，按照1*105/孔接种于12孔板，生长过夜；
(2)感染：将12孔板中的培养液吸除，换新鲜的培养液，同时加入PBS浓度梯度稀释的病毒液，混合均匀后放入培养箱培养；
(3)24h左右可换液，48h左右可看荧光。
2、Western Blot验证
(1)细胞总蛋白提取
a.用PBS冲洗细胞2-3次。最后一次彻底吸干残留液。
b.加入适当体积的RIPA(使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂)于培养板、瓶内3-5min。期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。
c.用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5mL离心管中。
d.冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
e.12 000rpm,4℃，离心10min，收集上清，即为总蛋白溶液。
(2)蛋白浓度测定
取未变性的蛋白溶液，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测蛋白浓度。
(3)蛋白变性
将蛋白溶液按照4:1的比例加入5*蛋白上样缓冲液，沸水浴变性15min，收入-20℃冰箱保存备用。
(4)SDS-PAGE电泳
a.配置蛋白质凝胶
b.将制胶器放入电泳槽后加足够的电泳液后上样电泳。将样品加入电泳孔中，电泳。浓缩胶电压75V，分离胶用120V。
c.电泳至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳，进行转膜。
(5)转膜
a.准备6张7×9cm的滤纸和一张大小适中的PVDF膜，PVDF膜在使用之前要先用甲醇活化。
b.在加有转移液的盆里放入转膜用的夹子，两块海绵垫，一支玻棒，滤纸和经过活化的PVDF膜。
c.将夹子打开使黑的一面保持水平。在垫子上垫海绵、三层滤纸。
d.小心剥下分离胶放在滤纸上，将PVDF膜盖于胶上，不要有气泡。在膜上盖三张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫。
e.转膜条件(湿转)
快转：300mA恒流转膜半小时，或者200mA转膜1小时，时间可以略微调整，电流对应调整。转膜过程中将转膜的槽子放在冰水中降温。
慢转：转膜过夜，25V恒压转膜过夜。
(6)免疫反应
a.将转好的膜于室温下脱色摇床上用5％的脱脂牛奶(0.5％TBST配)，封闭1h。
b.稀释一抗(TBST溶解的5％脱脂牛奶，磷酸化蛋白使用TBST溶解的5％BSA)，4℃孵育过夜(快转)，或者4℃孵育抗体3小时(慢转)。
c.用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min。
d.将二抗用TBST稀释3000倍，室温下孵育30min后，用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min。
(7)化学发光
在暗室中将ECLA和ECLB两种试剂在离心管中等体积混合，在曝光匣上贴双层手套或者其他透明薄膜，将PVDF膜的蛋白面朝上放在曝光匣两层薄膜之间，加入混合好的ECL溶液充分反应，1-2min后，去尽残液，盖上上面的一层薄膜开始曝光。曝光后的胶片用显影、定影试剂进行显影和定影。根据不同的发光强度调整曝光条件。
(8)凝胶图像分析
将胶片进行扫描存档，PhotoShop整理去色，Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值。
三、实验结果
如图1所示，转染Notch1敲除慢病毒后，胃癌细胞(MKN45、MGC-803、AGS)中Notch1蛋白表达量显著下调，该结果证明成功获得敲低Notch1基因的胃癌细胞系。
实施例2筛选差异表达基因
一、高通量测序数据处理
Trizol法收集实施例1中的空白对照和Notch1基因敲低组胃癌细胞，各3个重复，进行高通量测序，并对原始测序数据进行过滤：
1.去除reads中的adapter序列；
2.剪切前去除5’端含有非AGCT的碱基；
3.修剪测序质量较低的reads末端(测序质量值小于Q20)；
4.去除含N的比例达到10％的reads；
5.舍弃去adapter及质量修剪后长度小于25bp的小片段。
对质量剪切后的序列进行数据量统计，结果如表4所示。
表4测序数据统计表
二、参考序列比对分析
将质控后得到的高质量测序序列与指定的参考基因组比对，研究物种为人，参考基因组来自于Ensembl数据库，基因组版本GRCh38.p13。
分析软件：hisat2，版本为v2.1.0，与参考基因组比对结果统计表如表5所示。
表5 Clean Mapping比率统计
三、mRNA表达量分析
在RNA-seq分析中，通过比对到参考基因组区域的序列(cleanreads)的数量来计算基因的表达水平。根据所有样本与参考基因组的比对结果，计算每个基因/转录本在样本中的count值，以该值作为基因/转录本在样本中的表达量。最后对所有基因/转录本在各组样本中的表达进行差异显著性分析，找出相对差异表达的基因/转录本，并对其进行可视化分析。
采用软件DESeq2从RNA-Seq数据中识别差异基因，其基于二项分布模型集成了Fisher检验和似然比检验进行差异表达检验，显著差异mRNA筛选条件：P_value<0.05，|logFC|>0.585。
四、数据分析结果
用上述标准筛选得到差异基因145个，其中表达上调基因102个，表达下调的基因有43个。本发明中所述的基因LINC02828在Notch1基因敲低组胃癌细胞中表达上调，如表6所示，该结果表明，Notch1抑制剂可能通过促进LINC02828表达来抑制胃癌细胞株的增殖与侵袭。
表6 LINC02828的差异表达情况
| 基因 | baseMean | log2 FoldChange | P.Value | updown |
| LINC02828 | 6.122 | 2.970 | 0.041 | Up |
实施例3qPCR检测胃癌组织样本中LINC02828表达量的变化
一、实验材料
1、样本：46份胃组织样本，其中23份胃癌组织样本，23份癌旁对照组织。
2、实验试剂：如表7所示。
表7使用试剂清单
3、实验主要仪器：如表8所示。
表8使用仪器清单
二、实验方法
1.引物设计
Real Time PCR检测目的基因引物。引物在博迈德公司合成，引物序列如表9所示。
表9引物序列
| 引物名称 | 引物序列(5'to3') |
| GAPDH-F(内参) | CTGGGCTACACTGAGCACC(SEQ ID NO.1) |
| GAPDH-R(内参) | AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG(SEQ ID NO.2) |
| ACTB-F(内参) | GATCAAGATCATTGCTCCTCCT(SEQ ID NO.3) |
| ACTB-R(内参) | TACTCCTGCTTGCTGATCCA(SEQ ID NO.4) |
| LINC02828-F | AGGACAGAAGCCAAGGAAGC(SEQ ID NO.5) |
| LINC02828-R | GAAGCCACAGCTCTCCAAGT(SEQ ID NO.6) |
2、提取样本总RNA
(1)将1mL TRIzol在超净台里加入至玻璃匀浆瓶中(提前将匀浆瓶用烘箱180度烘4个小时)，将匀浆瓶按到仪器上，称取50—100mg的组织放入玻璃匀浆瓶内，将转速调至1500转左右，开始在冰水浴中进行匀浆，每研磨30s，停止30s，反复3-4次即可。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
(2)将加入TRIzol的样品在室温(15-30℃)放置10min，使核酸蛋白复合物完全分离。
(3)1mL TRIzol加入200μL氯仿，剧烈振荡2min，每隔1分钟再晃动两下，5—6次后，再静止7min。
(4)4℃，12 000rpm，离心15min。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol的60℅。
(5)把上层水相转移到新的EP管中(约400μL，尽量不要吸取到中间层以免污染)。加入500μL异丙醇，室温放置10min。
(6)制备75％乙醇，置于冰盒中预冷。
(7)4℃，12 000rpm，离心15min，离心后在管底出现白色沉淀。用移液器小心移去上清。
(8)加入1mL75℅冷乙醇，震荡洗涤沉淀。4℃，7 500rpm，离心5min，小心弃掉上清。
(9)将EP管倒扣于滤纸上吸去多余的水分，并用10μL枪头小心吸取管内的液体(枪头不要接触RNA)，将EP管室温放置5min(时间太久，过于干燥会使RNA活性降低)，RNA变透明；
(10)加入40μL无RNase的水(DEPC水),用naodrop检测OD值与浓度，在管上做好标记；
(11)置于-80℃冰箱保存。
3、逆转录合成mRNAcDNA
采用FastKing cDNA第一链合成试剂盒(货号：KR116)进行mRNA反转录，首先去除基因组DNA反应，在试管中加入5×gDNA Buffer 2.0μL，TotalRNA 1μg，加Rnase FreeddH2O使总体积至10μL，水浴锅中42℃加热3min，再将10×King RT Buffer 2.0μL，FastKing RT Enzyme Mix 1.0μL，FQ-RT Primer Mix 2.0μL，RNase Free ddH2O 5.0μL，混合后加入上述试管中一起混合共20μL，水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min，合成的cDNA需要长期保存时，请于-20℃或更低温度保存。
4、Real-TimePCR
用ABI 7300型荧光定量PCR仪，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析：
(1)用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(货号：FP205)，进行扩增，实验操
作按产品说明书进行。Real-Time反应体系如表10所示：
表10 Real-TimePCR反应体系
| 试剂 | 使用量 |
| 2×SuperReal PreMix Plus | 10μL |
| 上游引物(10μM) | 0.6μL |
| 下游引物(10μM) | 0.6μL |
| 50×ROX Reference Dye<sup>△</sup> | 2μL |
| DNA模板 | 2μL |
| 灭菌蒸馏水 | 4.8μL |
(2)扩增程序为：95℃15min，(95℃10sec，55℃30sec，72℃32sec)×40个循环，95℃15sec，60℃60sec，95℃15sec)。
(3)引物筛选
将各样本cDNA混合后，以此为模板进行10倍梯度稀释，稀释后样品各取2μL作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增(见表11)，同时在60-95℃进行溶解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行引物筛选。
表11引物筛选标准曲线Real-TimePCR设计
(4)样品Real-TimePCR检测
将各样品cDNA20倍稀释后取2μL作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增(见表12)。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。
表12样品Real-TimePCR检测设计
| 模板 | 样品cDNA | 样品cDNA |
| 重复检测孔道数 | 3 | 3 |
| 引物 | 目的基因引物 | 内参基因引物 |
5、数据统计
将运行程序下机所导出的原始结果ct值按照上样顺序进行整理，得到各个样本每个基因的三个复孔原始ct值，在excel中分别求出目的基因与内参基因的三个复孔ct值的平均值，分别计算对照组(癌旁组织)和试验组(胃癌组织)中目的基因相对于内参基因的表达，采用GraphPad软件进行统计分析，两者之间的差异采用t检验。
二、实验结果
统计结果如图2所示，与癌旁组织相比，胃癌组织样本中LINC02828表达量下调。
实施例4LINC02828的诊断效能验证
采用SPSS软件绘制受试者工作曲线(ROC)，分析AUC值、敏感性和特异性，判断指标单独的诊断效能。
如表13、图3所示，LINC02828具有较高的诊断效能，提示LINC02828可用于诊断胃癌。
表13 LINC02828诊断效能数据
| 基因 | AUC | 敏感性 | 特异性 |
| LINC02828 | 0.645 | 0.696 | 0.609 |
以上结合附图详细描述了本申请的优选实施方式，但是，本申请并不限于上述实施方式中的具体细节，在本申请的技术构思范围内，可以对本申请的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本申请的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本申请对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本申请的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本申请的思想，其同样应当视为本申请所公开的内容。
序列表
<110> 福建医科大学附属第一医院
<120> 基于基因的诊断胃癌的产品及其应用
<141> 2021-06-18
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctgggctaca ctgagcacc 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aagtggtcgt tgagggcaat g 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gatcaagatc attgctcctc ct 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tactcctgct tgctgatcca 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aggacagaag ccaaggaagc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaagccacag ctctccaagt 20
Claims (10)
1.一种LncRNA作为生物标志物在制备诊断胃癌或预测胃癌患者使用Notch1抑制剂预后的产品中的应用，其特征在于，所述LncRNA包括LINC02828。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的产品包括通过RT-PCR、qPCR、原位杂交或高通量测序平台检测样本中LINC02828的表达水平的试剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的试剂选自：
特异性识别LINC02828的探针；
或特异性扩增LINC02828的引物；
优选的，所述的特异性扩增LINC02828的引物序列如SEQ ID NO.5～6所示。
4.一种诊断胃癌或预测胃癌患者使用Notch1抑制剂预后的产品，其特征在于，所述的产品通过检测样本中LINC02828的表达水平来诊断胃癌或预测胃癌患者使用Notch1抑制剂预后。
5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述的产品包括试剂盒、芯片、核酸膜条。
6.一种预防或治疗胃癌的药物组合物，其特征在于，所述的的药物组合物包括LINC02828的促进剂，优选的，所述的促进剂为特异性促进LINC02828表达的载体。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物还包括稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、PH控制剂或表面活性剂。
8.LINC02828在制备预防或治疗胃癌的药物组合物中的应用。
9.一种筛选预防或治疗胃癌的候选药物的方法，其特征在于，所述的方法包括：用待筛选物质处理表达或含有LINC02828的体系；检测所述体系中LINC02828的表达水平；其中，若所述待筛选的物质可以促进LINC02828的表达，则表明该候选物质是预防或治疗胃癌的候选药物。
10.LINC02828在筛选预防或治疗胃癌的候选药物中的应用。
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