CN110564846B - 作为男性骨质疏松症诊断用的tyw3 - Google Patents

Abstract

本发明公开了作为男性骨质疏松症诊断用的TYW3。男性骨质疏松症患者的血液中TYW3含量与正常人之间存在显著差异，根据差异可以区分骨质疏松症患者和非骨质疏松症患者。本发明还公开了男性骨质疏松症的诊断产品，该诊断产品可以通过检测血液中TYW3来实现骨质疏松症的诊断目的。本发明利用体外细胞实验证明TYW3过表达可促进成骨细胞增殖和分化，可作为治疗骨质疏松症的一种新方法。

Description

作为男性骨质疏松症诊断用的TYW3

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及作为男性骨质疏松症诊断用的TYW3。

背景技术

骨质疏松症是以骨量减少及骨组织微结构退变为特征的一种全身性骨骼疾病，伴有骨脆性增加、易发生骨折，常"静悄悄"发病。一旦被发现，多已发展到一定程度。原发性骨质疏松最主要的两个类型为：女性绝经期后骨质疏松和老年性骨质疏松。而与颇受重视的女性骨质疏松不同，男性骨质疏松发病原因多样、骨折发生率及骨折后相关的死亡率往往更高。原发性骨质疏松主要是随年龄增加，体内性激素突然减少及生理性退行性变所致。由于雌激素不仅可以抑制破骨细胞对骨质的吸收，而且可促进胶原合成并有利于骨的形成，所以随着绝经期后性激素水平的下降，骨质疏松的发病率女性远高于男性(女男＝61)。与女性绝经期后50～70岁的发病高峰相比，男性骨质疏松常晚于女性10年左右，这主要是由于男性对雌激素的依赖水平较低，且全身骨量较女性多8％～10％有关。美国患有骨质疏松症的男性占总人口的3％～6％，我国没有确切数据报告，但发病率应不低于这一比例，并将随着人口老龄化逐年增高。

与女性骨质疏松相同，普通x线仍是诊断男性骨质疏松和相关骨折的必要手段。首要表现为脊柱和骨盆的骨质密度减低。椎体骨皮质变薄，横行骨小梁减少或消失，纵行骨小梁相对明显，严重时椎体内结构消失；椎体变扁，其上下缘内凹、椎间隙增宽，椎体呈双凹状，常因轻微外伤而压缩呈楔形。在长骨上可见骨小梁变细、数量减少、骨皮质变薄和出现分层现象。严重时可在弥漫性骨质密度减低的基础上出现散在分布的数毫米大小的点状透亮区，其边界清楚或模糊，易误诊为骨质破坏。但X线平片对诊断骨质疏松的敏感性和准确性低，对骨质疏松的早期诊断帮助不大。因此亟待开发一种在骨质疏松症早期即可诊断骨质疏松症的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状提供一种与男性骨质疏松症诊断相关的基因标志物。

本发明所要解决的又一个技术问题是提供一种上述基因标志物在制备诊断男性骨质疏松症的产品中的应用。

本发明为解决上述技术问题，采用了如下技术方案：

本发明一方面，提供了一种男性骨质疏松症的诊断标志物，所述标志物是 TYW3基因。

在另一优选例中，所述TYW3基因分离自人或非人哺乳动物的血液和/或组织。

在另一优选例中，所述的血液为血浆和/或血清。

在另一优选例中，所述的非人哺乳动物为小鼠、大鼠、兔、猪、牛、羊等。

在另一优选例中，所述TYW3基因分离自人血液。

本发明第二方面，提供了一种试剂，所述试剂是能够检测本发明第一方面的标志物表达量的试剂。

进一步，所述试剂包括利用SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测所述标志物表达量时使用的PCR扩增引物。

在本发明的具体实施例中，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

本发明第三方面，提供了一种诊断男性骨质疏松症的芯片，所述芯片包括固相载体以及以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针特异性地对应于本发明第一方面的标志物。

本发明第四方面，提供了本发明第三方面的芯片的用途，用于制备诊断男性骨质疏松症的试剂盒。

本发明第五方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有本发明第一方面的标志物或本发明第二方面的试剂，或本发明第三方面的芯片。

进一步，本发明的试剂盒还可以包含RT-PCR反应所需的下列成分：PCR buffer、10mM dNTPs、Hot start Taq酶、ddH₂O。

进一步，本发明的试剂盒还可以包含TYW3基因mRNA反转录得到的 cDNA，作为检测上述引物可行性的阳性模板。

本发明第六方面，提供了本发明第一方面的标志物、或本发明第二方面的试剂的用途，用于制备诊断男性骨质疏松症的芯片或试剂盒。

本发明的试剂盒的使用方法具有以下记载：

(1)从来自待检测对象的样本中提取TYW3基因mRNA；

(2)对mRNA含量进行检测，并将结果与正常人群中的mRNA含量进行比较，若样本中的TYW3基因mRNA显著低于正常人群的TYW3基因mRNA 含量E0，则说明该检测对象患有骨质疏松或者患有骨质疏松的概率高。

在另一优选例中，所述显著低于是指E0/E1≥1.5，优选地，≥2.0，更优选地，≥5。

在另一优选例中，所述待检测对象包括未患有骨质疏松的正常男性、疑似患有骨质疏松的男性患者或确诊骨质疏松的男性患者。

本发明第七方面，提供了一种诊断男性骨质疏松症的方法，所述方法包括：检测待检测对象样本样本中TYW3基因表达量。若样本中的TYW3基因mRNA 显著低于正常人群的TYW3基因mRNA含量E0，则说明该检测对象患有骨质疏松或者患有骨质疏松的概率高。所述显著低于是指E0/E1≥1.5，优选地，≥2.0，更优选地，≥5。

进一步，所述样本是血液。

本发明还提供了一种用于治疗骨质疏松症的药物组合物，所述药物组合物包括促进TYW3基因表达的试剂。

进一步，所述促进TYW3基因表达的试剂不受限制，只要是可以促进TYW3 表达即可。

本发明的药物组合物可以作为医药单独施用或与其它药物一起施用。可以与本发明的药物组合物一起施用的其它药物不受限制，只要它不损害本发明的治疗性或预防性药物组合物的效果即可。

本发明的药物组合物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。

本发明的药物组合物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。

本发明的药物组合物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。本发明的治疗药物组合物或预防药物组合物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。

本发明还提供了TYW3基因在制备治疗骨质疏松症的药物中的应用。

进一步，所述药物包括促进TYW3基因表达的试剂。所述试剂不受限制，只要是可以促进TYW3表达水平即可。

本发明还提供了促进TYW3基因表达的试剂在制备治疗男性骨质疏松症的药物中的应用。

在本发明的上下文中，“诊断骨质疏松症”包括判断受试者是否已经患有骨质疏松症、判断受试者是否存在患有骨质疏松症的风险。

芯片

基因表达谱芯片通常含有多达几百个探针，涵盖多种RNA，利用DNA双链同源互补的原理在全基因组水平上检测样本中所含各种RNA的含量。因此，可在同一时间对待测样本中全基因组范围内的RNA的转录水平进行检测。

利用本发明所述的基因序列，还可以制备相应的基因检测芯片，进而研究其表达谱以及基因的调节方式。

具体地，可根据本发明所述的基因，设计出适合的探针，固定在固相载体上，形成“寡核苷酸阵列”。所述的“寡核苷酸阵列”是指具有可寻址位置(即以区别性的，可访问的地址为特征的位置)的阵列，每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。根据需要，可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。

所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。

所述的基因芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT 串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的基因芯片。如果核酸不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.e risi,V.R.Iyer,P.O.BROWN.Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on agenomic scale.Science,1997； 278:680和马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。

试剂盒

本发明所述的试剂盒可用于检测血液中所述标志物的表达。优选的，所述的试剂盒中还含有用于标记RNA样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。优选地，本发明所述试剂盒中所含有的cDNA也可以用于进行阳性对照。此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液、抗体等。此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。

在本发明的上下文中，“TYW3基因”包括TYW3基因以及TYW3基因的任何功能等同物的多核苷酸。TYW3基因(Chromosome 1,NC_000001.11 (74733152..74766677))序列可在国际公共核酸序列数据库GeneBank中查询到。

附图说明

图1显示利用QPCR检测TYW3基因差异表达情况的统计图；

图2显示利用免疫印迹检测TYW3基因过表达效果的统计图；

图3显示TYW3基因过表达对成骨细胞增殖的影响的统计图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 QPCR检测差异表达基因

一、样品收集

选取30例男性骨质疏松症患者，入选标准：双能X线测量骨密度的T<-2.5； T<-2.5并伴有既往脆性骨折史；肝、肾功能正常者。排除标准：①既往使用过抗骨质疏松药物者；②有糖尿病、甲状腺或甲状旁腺疾病、肾上腺及性腺等内分泌疾病；③继发性骨质疏松症。平均年龄78岁。提取上述患者的外周血作为实验样品，同时收集30例正常人的外周血作为对照样品。

二、在mRNA水平上进行验证

1、总RNA提取

使用天根公司的RNAprep Pure高效血液总RNA提取试剂盒(货号：DP443) 提取血液总RNA，按照说明书操作，大致步骤如下：

(1)红细胞裂解液的稀释：根据处理血液样品的体积选取适当体积的10×红细胞裂解液H(例如待处理的血液样品体积为200μl，则取140μl 10×红细胞裂解液H)，用RNase-Free ddH₂O稀释至1×红细胞裂解液H。

(2)向1体积人类全血中加5倍体积1×红细胞裂解液H(需自备合适的干净管子)。

注意：为获得最佳的混匀效果，血液和1×红细胞裂解液H的混合液体积不应超过管子体积的3/4。如果血液中的白细胞含量较高，可按比例减小血液的使用体积，第6步中的1×红细胞裂解液H的使用体积也要进行相应调整。

(3)在冰上孵育10-15min，在孵育过程中涡旋振荡混匀2次。

注意：在孵育的过程中溶液将变成半透明状态，表明红细胞裂解。如果必要的话，孵育时间可延长至20min。

(4)4℃2,100rpm(～400×g)离心10min，将上清完全去除。

注意：离心后白细胞可能会形成小球，确保完全去除上清，痕量红细胞的存在，会使白细胞小球呈现红色，而该现象会在随后的漂洗步骤中消失。

(5)向白细胞沉淀中加入1×红细胞裂解液H(加入1×红细胞裂解液H的体积是第1步中全血用量的2倍)，重悬细胞。

(6)4℃，2,100rpm(～400×g)离心10min，将上清完全去除。

注意：如果上清去除不完全将会影响裂解及随后的RNA与膜的结合，导致最后RNA产率降低。

(7)向白细胞沉淀中加入裂解液RLH(使用前请加入β-巯基乙醇)，具体加量按照下表1进行，涡旋或使用移液器混匀。

注：如果血液不是健康人的全血，需要根据血液中白细胞的数量来确定所需裂解液RLH的体积，此时细胞应完全裂解，块状细胞沉淀消失。

表1裂解液使用量表

裂解液μL	健康人类全血(ml)	白细胞数量
			350	多至0.5	多至2*10<sup>6</sup>
600	0.5-1.5	2*10<sup>6</sup>至1*10<sup>7</sup>

(8)将溶液转移至过滤柱CS中(过滤柱CS放在收集管中)，12,000rpm (～13,400×g)离心2min，弃去过滤柱CS，收集滤液。

注意：为避免气溶胶的形成，请将移液器调整到≥750μl以保证一次性将所有溶液转移到过滤柱上，如果细胞太多，将会出现裂解液粘稠的现象，造成难以吸取的情况。

(9)向滤液中加入1倍体积70％乙醇(通常为350μl或600μl)，混匀(此时可能会出现沉淀)，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR4中(吸附柱CR4放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR4放回收集管中。

注意：配制70％乙醇时请使用RNase-Free ddH₂O，如果滤液体积有所损失，请相应减少70％乙醇用量。将溶液和沉淀转移至吸附柱CR4时，体积大于吸附柱容量，可以分两次完成。

(10)如果不进行DNase I消化，可以直接向吸附柱CR4中加入700μl去蛋白液RW1H(使用前请先检查是否已加入乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心 30-60sec，倒掉收集管中的废液，直接进行步骤14。

DNase I消化：向吸附柱CR4中加入350μl去蛋白液RW1H，12,000rpm (～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR4放回收集管中。

(11)DNase I工作液的配制：取10μl DNase I储存液放入新的RNase-Free 离心管中，加入70μl RDD溶液，轻柔混匀。

(12)向吸附柱CR4中央加入80μl的DNase I工作液，室温放置15min。

(13)向吸附柱CR4中加入350μl去蛋白液RW1H，12,000rpm(～13,400×g) 离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR4放回收集管中。

(14)向吸附柱CR4中加入500μl漂洗液RW(使用前请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR4放回收集管中。

(15)重复步骤14。

(16)12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR4置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

注意：离心后将吸附柱CR4在室温放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的反转录，荧光定量等实验。

(17)将吸附柱CR4转入一个新的RNase-Free离心管中，加入30-50μl RNase-FreeddH₂O室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，得到RNA 溶液。

注意：洗脱缓冲液体积不应少于30μl，体积过小影响回收效率。RNA溶液请于-70℃保存。

2、反转录反应

总RNA采用PrimeScript RT reagent Kit(TAKARA公司)将1000ng纯化的 RNA逆转录合成cDNA。

1)去除基因组DNA反应，按表2中的如下成分于冰上配制反应混合液。

表2去除基因组DNA反应体系

试剂	使用量
		5*gDNA Eraser Buffer	2.0μL
gDNA Eraser	1.0μL
		总RNA	1μL
无RNase水	至10μL

2)PCR仪上进行反应

42℃2min；

4℃保存。

3)反转录反应

反应液配制在冰上进行，成分如表3所示。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2的量配制Master Mix，然后再分装10μL到每个反应管中。轻柔混匀后立即进行反转录反应。

表3反转录反应体系

4)PCR仪上进行反应:

37℃ 15min；

85℃ 5sec；

4℃保存。

3、实时定量逆转录-聚合酶链反应(QPCR)

1)采用SYBR Premix Ex Taq Kit(TAKARA公司)，配置10μL PCR反应体系(比例如表4所示)，将除cDNA以外的其他试剂预混，每个样品单个基因制作重复三次复孔，依次加入96孔板中，以ddH₂O作为阴性对照。

表4 QPCR反应体系

试剂	使用量
		SYBR Premix Ex Taq	5.0μL
正向引物(10μM)	0.4μL
		反向引物(10μM)	0.4μL
ROX Dye II 0.2	0.2μL
		无RNase水	3.0μL
cDNA	1.0μL
		总	10μL

引物序列如下：

TYW3

正向引物：5’-GTTCCATTAAGCCATAAG-3’(SEQ ID NO.1)，

反向引物：5’-TGTAAGTTAGTCATCGTT-3’(SEQ ID NO.2)；

GAPDH

正向引物：5’-GTGGACCTGACCTGCCGTCT-3’(SEQ ID NO.3)，

反向引物：5’-GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT-3’(SEQ ID NO.4)。

2)程序设置：

预变性Cycle:1

95℃35秒；

95℃5秒+55℃34秒，共42个循环。

3)获得每个样本的Ct值，所有目标基因的相对表达量按(2-△△Ct)计算，以同组内参基因GAPDH分别作为对照。

4、结果

结果如图1所示，与30例正常对照人群平均水平相比，30例男性骨质疏松症患者中有30例患者血液中TYW3基因的mRNA水平明显下调，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例2男性骨质疏松症诊断试剂盒的制备

根据TYW3基因与男性骨质疏松症的相关性，可以通过检测TYW3基因的表达情况来诊断男性骨质疏松症，据此本发明提供了一种基于检测TYW3基因表达来诊断男性骨质疏松症的试剂盒，该诊断试剂盒中的组分如下：SYBR Green 聚合酶链式反应体系；扩增TYW3基因和GAPDH基因的引物对。扩增TYW3 基因的正向引物序列为5’-GTTCCATTAAGCCATAAG-3’，反向引物序列为 5’-TGTAAGTTAGTCATCGTT-3’；扩增GAPDH的正向引物序列为5’-GTGGACCTGACCTGCCGTCT-3’，反向引物序列为 5’-GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT-3’。SYBR Green聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。PCR缓冲液成分为：25mMKCL， 2.5mM MgCL₂、200mM(NH₄)₂SO₄。

实施例3 TYW3基因表达对成骨细胞增殖与分化的影响

1、所用试剂

hFOB1.19(购于中科院上海细胞库)；DMEM(高糖)/F12(DMEM:F12＝1:1，购自Gibco公司)，新生胎牛血清(FCS，杭州四季青)；MTT(碧云天公司)；碱性磷酸酶试剂盒(南京建成公司)

2、人成骨细胞培养

将hFOB1.19细胞放于5％CO₂，34℃培养箱内培养，细胞培养基为DMEM(高糖)/F12完全培养基(DMEM(高糖)/F12中添加终浓度为10％的胎牛血清及终浓度为0.3％的G418)。

3、细胞转染

将TYW3基因的CDS序列插入到真核表达载体pcDNA3.1中构建基因过表达载体。转染前24h将hFOB1.19细胞接种于6孔板，加入1.5mL DMEM/F12完全培养基，贴壁过夜，待细胞汇合达80％-90％时进行转染。转染前更换为不含血清不含G418的Opti-MEM培养基。用250μL Opti-MEM培养基稀释质粒，轻轻吹吸3-5 次混匀。轻轻颠倒混匀转染试剂，用250μLOpti-MEM培养基稀释5.0μL Lipofectamine ^TM 2000，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置5min。混合转染试剂和质粒稀释液，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置20min。将转染复合物加入到6孔细胞板中，前后轻摇细胞板混合均匀。细胞板置于34℃、体积分数5％CO₂培养箱中培养。转染6h换DMEM/F12完全培养基培养。

4、过表达效果检测

4.1细胞总蛋白的提取

1)转染48h后，吸弃旧培养基，每孔加入1ml 4℃的PBS缓冲液清洗6孔板2-3 次，保留最后一次PBS放置于冰上；

2)在EP管中配新鲜裂解液，每1ml RIPA裂解液中加入10μl PMSF(100×)，10μlcooktail(100×)，轻轻吹打混匀，置于冰上备用；

3)将2中PBS弃净，每孔加入120μl上述配制的裂解液，轻轻晃动6孔板，置于冰上裂解40min；

4)待裂解完成后，快速收集细胞，用灭菌的枪头将细胞碎片及裂解液移入到1.5ml灭菌EP管中；

5)4℃离心机，12000rpm，20min，将上清移入另一1.5ml无菌EP管中，做好标记；

6)取3μl蛋白裂解液稀释10倍，BCA蛋白定量试剂盒测蛋白浓度；

7)余下蛋白裂解液按体积加入一定量的SDS上样缓冲液(6x)，混匀后在沸水中煮沸5-10min。-80℃保存备用。

4.2免疫印迹

用Brandford法定量，取适量与样品缓冲液混合煮沸5min，冷却5min；取30μg蛋白上样到制备好的15％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，使用Bio-Rad半干转印系统转膜，封闭过夜，加入Western洗涤液洗涤，加入单克隆抗体摇床室温杂交 2h；按照适当比例用Western羊抗鼠二抗稀释液稀释于封闭缓冲液中，孵育60 min；洗膜液洗3次；ECL试剂显影、定影检测蛋白表达。利用专业软件计算蛋白条带灰度，灰度与蛋白量成正比，以对照组蛋白表达量为基准，设定为1，计算 TYW3过表达组TYW3蛋白的相对表达量。

4.3结果

如图2所示，pcDNA3.1-TYW3可有效促进TYW3蛋白表达，差异具有统计学意义。

5、成骨细胞增殖实验

步骤：96孔板接种hFOB1.19细胞，每孔2000个，每组5孔，按照前面描述的方法进行质粒转染，转染48h后，加入MTT液(5mg/mL)20μL/孔，37℃孵育4h，吸去孔内液体，加入DMSO液体150μL/孔，振荡10min，用酶标仪选择570nm波长测定各孔吸光度值，其值与细胞数量成正比。

结果：如图3所示，促进TYW3基因表达可促进hFOB1.19细胞增殖，与对照组相比差异显著，具有统计学意义。

6、成骨细胞分化实验

碱性磷酸酶是成骨细胞分泌的一种酶蛋白，是成骨细胞分化的特异性标志，其含量可以间接反映成骨细胞的功能，是最常见评价成骨细胞分泌功能的指标之一，因此通过检测培养液中碱性磷酸酶水平来评估促进TYW3基因表达对成骨细胞分化的影响。

培养液中碱性磷酸酶活性测定：

步骤：6孔板中每孔接种1×10⁵/mL个hFOB1.19细胞。按照前面描述的方法进行质粒转染，吸取转染24h的细胞培养液，2500r/min，离心10min，应用碱性磷酸酶检测试剂盒取上清液进行测定。碱性磷酸酶＝[(测定吸光度值-空白吸光度值)/(标准吸光度值-空白吸光度值)]×酚标准品浓度×100mL×样品测定前稀释倍数。用酶标仪选择520nm波长测定各孔吸光度值(A值)，根据测得A值计算相对的ALP活性。

结果：pcDNA3.1-TYW3组上清磷酸酶活性与对照组相比显著升高，代表 TYW3过表达可促进成骨细胞分化，见表5。

表5上清碱性磷酸酶活性统计

项目	pcDNA3.1	pcDNA3.1-TYW3
			上清碱性磷酸酶	0.765±0.024	2.915±0.284

综上所述，pcDNA3.1-TYW3通过上调TYW3基因表达，促进hFOB1.19成骨细胞的增殖，提高碱性磷酸酶活性促进成骨细胞的分化，故促进TYW3基因表达可作为治疗骨质疏松症的一种新方法。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 德阳市人民医院

<120> 作为男性骨质疏松症诊断用的TYW3

<150> 201910626653.3

<151> 2019-07-11

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gttccattaa gccataag 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgtaagttag tcatcgtt 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtggacctga cctgccgtct 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggaggagtgg gtgtcgctgt 20

Claims (4)

1.一种诊断男性骨质疏松症的芯片在制备诊断男性骨质疏松症的试剂盒中的用途，其特征在于，所述芯片包括固相载体以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针特异性地对应于TYW3基因。

2.检测TYW3基因表达量的试剂在制备诊断男性骨质疏松症的芯片或试剂盒中的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述试剂包括利用SYBR Green、TaqMan 探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测TYW3基因表达量时使用的PCR扩增引物。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示。

Images