CN108504658A

CN108504658A - Linc01836在制备胃癌诊断产品、治疗药物中的用途

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Publication number: CN108504658A
Application number: CN201810605016.3A
Authority: CN
Inventors: 吴东; 杨承刚; 郭涛; 张改英; 陈丽媛
Original assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences; Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd
Current assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences; Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd
Priority date: 2018-06-13
Filing date: 2018-06-13
Publication date: 2018-09-07
Anticipated expiration: 2038-06-13
Also published as: CN108504658B

Abstract

本发明涉及一种用于胃癌筛查的长链非编码RNA的检测及其应用，本发明利用芯片技术筛选到在胃癌组织中显著高表达的LINC01836。与癌旁组织相比，LINC01836在胃癌组织中显著高表达，并在大样本荧光定量PCR实验中进一步证实了上述结论。LINC01836与胃癌具有相关性将进一步丰富胃癌发病机制的研究，也为胃癌的早期诊断及预后监测提供了新的肿瘤标志物和治疗靶点。

Description

LINC01836在制备胃癌诊断产品、治疗药物中的用途

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及LINC01836在制备胃癌诊断产品、治疗药物中的用途。

背景技术

胃癌作为最为常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在不同地区和不同人群的差别很大，我国胃癌发病和死亡率以东部、西北部为最高，往东经由甘肃河西走廊、陕北、宁夏、内蒙古、辽宁，然后沿海至胶东半岛及江浙一带，是我国胃癌的高发地带(陈万青，张思维，陈志峰.中国食管癌胃癌高发区贲门癌流行趋势分析[[J].中国肿瘤，2008(12):998-1000)。同时，胃癌的地理流行病学研究也提示胃癌的地理分布存在明显的差异(毛德玲，叶玮，李凤全，等，胃癌空间分布与地理环境关系的研究川.浙江预防医学，2011(06):5-8)，因此，对胃癌高发区的高危人群进行胃癌重点预防和诊治，在不同层面查找病因因素及早期诊断标志，制定胃癌高发区针对高危人群有效的预防策略将具有重大的理论意义和实际应用价值。

长期以来，胃镜观察和组织病理学诊断是胃癌诊断的金标准和临床治疗的基础，但是，这些常规的方法却难以有效发现早期胃癌，或者难以对胃癌演进转归及治疗预后做出准确判断和预测(邓长生.早期胃癌诊断研究现状与进展[J].世界华人消化杂志，2011(32):3309-3312)，故病理学诊断在胃癌早诊及预后等方面存在一定的局限。研究也证实，组织形态学改变是发生于基因、分子水平的病理改变集合累积后的结果(Zanotti L,Bottini A,Rossi C,et al.Diagnostic tests based on gene expression profile inbreast cancer:from background to clinical use[J].TumourBiol,2014,35(9):8461-8470)，因此，全面描绘与胃癌临床表现密切相关的组织学及基因水平的变化谱，深入研究胃癌发病机理，找寻胃癌早期诊断及治疗的靶标是实现胃癌早诊早治亟待解决的关键问题。随着医学理论知识和诊疗手段的不断更新，目前医学己进入了一个崭新的以分子生物医学为主导的时代(Yanaihara N,Caplen N,Bowman E,et al.Unique microRNAmolecular profiles in lung cancer diagnosis and prognosis[J].CANCER CELL,2006,9(3):189-198；Tibshirani R,Hastie T,Narasimhan B,et al.Diagnosis ofmultiple cancer types by shrunken centroids of gene expression[J].Proc NatlAcad Sci U S A,2002,99(10):6567-6572)，且系统、高质量进行基因检测并建立遗传资源平台，己成为分子肿瘤学发展的基础，并在此基础之上探索和解释胃癌等恶性肿瘤发生发展的进程，可帮助确定胃癌等疾病病因和诱因、做到在高危人群中更早期发现患者和正确评价胃癌防治效果的目的。

研究认为胃癌是一种多因素参与的复杂疾病，在其发生发展过程中，涉及着一系列分子事件的发生，包括原癌基因的激活和抑癌基因的失活以及相关信号通路的表达异常等，但是这些变化的发生机理尚不清楚。胃癌形成过程中的关键分子事件尚未得以探索，迄今为止仍然缺乏能特异性解释胃癌癌变机制及能用于早期诊断和人群预防的生物标志。此外，研究显示：胃黏膜细胞癌变是一个渐进的过程，临床疾病过程从正常胃壁细胞发展为进展期胃癌之前，需经历一个相当长的癌前变化过程，癌变率与其病史长短和癌前病变严重程度高度相关。

鉴于目前临床诊断手段的发展，胃镜检查的普及使得胃粘膜活检标本更方便获得，如何发现反映胃癌发生发展的生物学标志物对于胃癌的早诊早治、转移及预后评价显得尤为重要。因此，为从根本上解决这一难题，寻找胃癌细胞与肿瘤微环境相互作用的分子，有望成为解决胃癌早期诊断及预后的关键所在。

长链非编码RNA(Long noncoding RNA，lncRNA)是指长度大于200个碱基且不编码蛋白的RNA，种类繁多，结构各异，以RNA转录本的形式行使其生物学功能，参与细胞分化、细胞增殖、细胞凋亡等生物学过程，几乎影响所有生理和病理过程。最近的研究表明lncRNA与细胞的癌变有着极为密切的联系，已经发现lncRNA与肺癌、非霍奇金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病等肿瘤疾病直接关联。大量的研究表明lncRNA在生物进化上极不保守，组织及发育时期的表达特异性明显高于蛋白编码基因，以肿瘤相关的lncRNA作为靶点进行基因干预治疗其可能带来的副作用将会小于蛋白编码基因靶点，肿瘤相关lncRNA的发现可能会对肿瘤的诊断及基因治疗产生重大的影响。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术是目前基因治疗策略中非常重要的一个手段，短RNA序列与其互补的RNA靶点结合后会导致该RNA序列的降解，从而抑制其生物学功能。目前在生物体内实现RNA干扰的两种方式为利用载体表达短的发夹状RNA(shorthairpin，shRNA)与注入化学合成小干扰RNA(small interfering，siRNA)，但两者前提均是找到有效的干扰位点，从而才能实施有效的基因干预。自2004年美国FDA首次批准用于黄斑病的RNA干扰药物Cand5进入临床实验以来已有大量的RNA干扰药物被批准用于临床实验，其数量还在持续增加。RNA干扰技术的高特异性与高效性均使基因治疗手段进入了一个新的时代，其发明者也因此于2006年获得诺贝尔生理及医学奖。综上所述，筛选肿瘤相关的关键基因，找到其有效的干扰靶点开发出RNA干扰药物将是基因治疗研究领域中一个重要的发展方向。

长链非编码RNA与RNA干扰技术均是肿瘤基因治疗研究方面的热点，找到胃癌异常表达的长链非编码RNA有助于更好的进行胃癌的早期诊断与辅助治疗，并可通过抑制其表达进行基因治疗，具有重要的实用价值。

发明内容

为开发胃癌相关的长链非编码RNA在胃癌诊疗方面的应用，本发明的目的是提供一种长链非编码RNA及其相关的特异性的RNAi序列，该序列可以用于胃癌相关的诊断和治疗。使用长链非编码RNA诊断的好处在于，在胃癌早期即可确诊，提高胃癌的治疗生存率。

在本申请文件中，长链非编码RNA，可以简写为LncRNA。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种长链非编码RNA，所述长链非编码RNA是LINC01836，其Gene ID:107985343，LINC01836的转录本序列是Genbank登录号XR_001753829.2(具有954bp的长度，相应的DNA序列如SEQ ID NO.1所示)。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种治疗胃癌的药物组合物，所述药物组合物包括抑制前面所述的长链非编码RNA的表达的试剂。

进一步，所述试剂包括针对前面所述的长链非编码RNA设计的RNAi序列，或含有RNAi序列的载体。

更进一步，所述RNAi包括siRNA、shRNA；

在本发明的具体实施方案中，所述RNAi采用的是siRNA，其序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了前面所述的长链非编码RNA在制备诊断胃癌的产品中的应用。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种诊断胃癌的产品。

进一步，所述产品包括检测前面所述的长链非编码RNA表达水平的试剂。

更进一步，所述试剂包括利用SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测LINC01836表达量时使用的PCR扩增引物。

在本发明的具体实施方案中，所述引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

进一步，前面所述的产品的类型包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。

所述芯片包括但不限于固相载体、固定在固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括但不限于特异性的对应于LINC01836的部分或全部序列；所述试剂盒包括但不限于检测LINC01836的引物和/或探针；所述试纸包括但不限于针对LINC01836的引物和/或探针；所述高通量测序平台包括但不限于针对LINC01836的引物和/或探针。

所述针对LINC01836的的引物和/或探针还可包括针对现有技术中已经报道的可以用于检测LINC01836表达水平的引物和/或探针。将多种LINC01836的检测引物和/或探针放置在同一试剂盒中通过检测多种LINC01836指标联合诊断胃癌的情况是本领域技术人员容易想到的。

所述固相载体还可包括采用基于芯片领域的各种常规材料，例如但不限于尼龙膜、经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。

所述芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法，例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基酸修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配置成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜固定，即可得到本发明的芯片。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了前面所述的长链非编码RNA在制备抑制胃癌细胞增殖的药物中的应用。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了前面所述的长链非编码RNA在制备治疗胃癌的药物中的应用。

进一步，所述药物的有效成分能够抑制前面所述的长链非编码RNA的表达。

更进一步，所述有效成分包括针对前面所述的长链非编码RNA的RNAi序列。所述RNAi包括siRNA、shRNA；在本发明的具体实施方案中，所述RNAi采用的是siRNA，其序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。

本发明的所述载体包括病毒载体、真核载体。

病毒载体可以是任何适当的载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)载体、甲病毒载体。

真核表达载体可以是任何适当的载体，包括但不限于pCMT-Myc表达载体、pcDNA3.0表达载体、pcDNA6.0表达载体、pEGFP表达载体、Pef Bos表达载体、pTet表达载体、pTRE表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体，如pBin438、pCAMBIA1301等。

药物筛选：在得知了前面所述的LINC01836与胃癌的密切相关性后，可以基于该特征来筛选抑制LINC01836表达的物质。之后，可从所述物质中找到对于治疗胃癌真正有用的药物。

因此，本发明还提供了一种筛选治疗胃癌的潜在物质的方法，所述方法包括：用候选物质处理胃癌相关细胞体系，若所述候选物质可抑制LINC01836表达或活性，则表明该候选物质是治疗胃癌的潜在物质。所述细胞体系可以是亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。优选的，对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物实验，以进一步选择和确定对于治疗胃癌真正有用的物质。

本发明的治疗胃癌的药物还包括药物学上可以接受的载体，所述载体包括但不限于：稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂、吸附载体等。

所述药物可以制成包括但不限于显微注射技术、适于转染的剂型、注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊剂。上述各种剂型的药物均可以按照药物学领域的常规方法制备。

所述药物可以单独施用；或者与其他能够治疗胃癌的药物进行组合施用。

所述药物可以离体施用：将本发明的长链非编码RNA或其表达载体在体外导入或转染人体自身或异体细胞(或异种细胞)，经体外细胞扩增后，输回人体。

所述药物可以体内施用：将本发明的长链非编码RNA或其表达载体直接导入体内。这种载体可以是病毒型或非病毒型，甚至是裸RNA。

可应用本发明的药物的受试者可以是人类或者其他哺乳动物。更具体的，受试者是器官、组织、细胞。

在本发明的上下文中，“诊断胃癌”包括判断受试者是否已经患有胃癌、判断受试者是否存在患有胃癌的风险、判断胃癌患者对药物治疗的反应性、或者判断胃癌患者的预后情况。

本文所用的“治疗”包括疾病的好转、缓解、治愈。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了LINC01836与胃癌的相关性，通过检测受试者LINC01836的表达，既可以判断受试者是否患有胃癌或者存在患有胃癌的可能性，从而指导临床医生给受试者提供预防方案或者治疗方案。

本发明发现了了一种新的分子标志物，相比传统的检测手段，RNA层面的诊断更具有及时性、特异性和灵敏性，大大提高了胃癌早期诊断，降低了胃癌的死亡率。

附图说明

图1显示利用QPCR检测LINC01836在胃癌组织中表达情况的统计图；

图2显示利用QPCR检测LINC01836表达抑制情况的统计图；

图3显示抑制LINC01836表达对胃癌细胞增殖影响的统计图。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选差异表达非长链编码RNA

1、研究对象：

收集医院肿瘤外科经胃癌根治术的5例原发性胃癌患者的手术标本(胃癌组织以及对应的癌旁组织)，且每位患者签署知情同意书。

入组标准：a.术前诊断为原发性胃癌，且没有接受肿瘤的治疗；b.没有合并其他恶性肿瘤；c.无其他并发症，如胃穿孔、消化道大出血、消化道梗阻等并发症，患者术前一般情况良好；d.无其他慢性疾病，如高血压、糖尿病等。

此项研究已获伦理委员会批准。

2、样本获取

1)手术中样本离体后选取肿瘤中标本，大小约0.5cm x 0.5cm；

2)选取远离肿瘤组织区域，即靠近切缘，大小约为0.5cm x 0.5cm；

3)将样本放入冻存管中，放入-80℃冰箱保存。

3、组织总RNA提取

1)清洗瓷质研钵后，用DEPC液浸泡过夜(至少12h)，干燥后用液氮预冷至研钵内液氮面平静无翻滚；

2)取-80℃保存的冰冻样本组织100mg加入研钵，加液氮研磨至白色粉末，直至加液氮进入研钵无片状结块翻滚；

3)向研钵中加入2m1 Trizol，继续研磨至钵内液体澄清，转移至1.5m1无酶(RNA-free)EP管，13000rpm 4℃转10min离心，取上清液备用；

4)向上清液中加入200μ1氯仿萃取，用手轻微震荡，静置10min，13000rpm4℃转10min离心，取无色透明的上清液备用；

5)向上清液中再次加入200μ1氯仿萃取，用手轻微震荡，静置5min,13000rpm 4℃转10min离心，取无色透明的上清液；

6)按所取上清液体积1:1加入异丙醇，用手轻微震荡，静置10min,13000rpm 4℃转15min离心；

7)弃上清，留沉淀，加1ml 70％-75％乙醇，将沉淀混匀至不贴壁，8000rpm4℃转5min，弃上清，开盖晾5-10min；

8)加入20μ1无酶水(Nuclease-Free water)，放置至溶解。将两管合并，进入液氮3min，放入-80℃冰箱保存；

9)用NANO drop 1000 spectrophotometer分别测定所得RNA溶液在260nm和280nm波长的吸光度值A260与A280，以A260/A280的值判断样品纯度。以公式A260x35x稀释倍数计算RNA浓度。再取5μ1 RNA溶液与6x电泳上样缓冲液混合，在1％甲醛变性凝胶上电泳，电泳后在紫外灯下观察，当出现5s,18s和28s三条完整条带时，说明提取的RNA较完整。

4、芯片实验

申请人选择美国Arraystar公司提供的12*135K的human LncRNA Microarray(v2.0)芯片，该芯片数据来源几乎包含了所有权威LncRNA数据库，如NCBI Refseq，UCSCKnown Gene6.0，Gencode v13，RNA db2.0，NRED，LincRNAs，同时也对mRNA序列研究，mRNA数据主要来源于The collaborative consensus coding sequence(CCDS)project。

4.1 LncRNA芯片杂交：

主要步骤如下：

(1)合成双链互补cRNA：

使用Invitrogen SuperScript ds-cDNA合成试剂盒，取5μg总RNA加入100pmol的oligo dT primers(特制引物)，按照Invitrogen SuperScript ds-cDNA合成试剂盒手册合成。

(2)标记纯化双链互补cDNA

ds-cDNA严格按照Nimblegen gene expression analyisis操作手册纯化和标记，简单来说，先把4μg的RNase加入到ds-cDNA中在37℃中孵育10分钟，然后用苯酚-氯仿-异戊醇混合液清洗接着用冰冻乙醇进行沉淀；标记ds-cDNA按照Nimblegen gene expressionanalyisis操作手册使用Nimblegen One-Color DNA标记试剂盒，先取1μg的ds-cDNA，加入1OD的Cy3引物在98℃中孵育10分钟，然后加入100pmol三磷酸脱氧核糖核酸和DNA聚合酶羧基端大片段(并充分混合在37℃中孵育2小时。最后加入0.1体积的0.5M EDTA反应液终止反应，最后用异丙醇乙醇沉淀进行纯化。

(3)标记效率质量检测：用NanoDropND-1000对ds-cDNA进行效率质量检测。

(4)芯片杂交：

将4μg标记有Cy3荧光染料的ds-cDNA和Microarrays芯片放进Nimblegenhybridization buffer液中，在杂交培植室内42℃孵育16-20小时，将杂交后的芯片在ozone-free环境下按照Nimblegen wash buffer试剂盒手册进行清洗。

4.2图像采集和数据分析

清洗后的芯片放入Axon genepix 4000B芯片扫描仪，打开genepix6.0软件以5μm像素的分辨率进行扫描，获得的扫描图像以TIFF格式输入到NimbleScan软件进行网格对齐和数据分析。这些数据需要通过分位数标准化和稳健多芯片平均标准化分析，从而获得标准化的芯片表达数据，再把数据输入到Agilent genespring GX软件进行分析，图像定量和标准化数据处理全部完成后以列表形式输出数据，获得的mRNA和LncRNA数据，经过折叠倍率筛选，筛选出差异表达的mRNA和LncRNA数据重新制作成差异表达的mRNA和LncRNA数据，表达差异巨大的mRNA和LncRNA用散点图和火山图标示出来，同时应用软件Agilentgenespring GX软件的聚类分析图表对数据进行聚类分析。

5、结果

经过图像采集和数据分析后得到了mRNA和LncRNA的数据，设定表达差异的标准：Fold chang≥2.0，P值≤0.05。根据这个标准筛选得到两组之间差异表达的mRNA和LncRNA。筛选获得的数据显示，胃癌组织和正常组织相比，有715个LncRNA差异表达，其中上调389个，下调326。

实施例2大样本验证筛选出的差异表达LncRNA

基于实施例1的筛选结果，根据P value的大小，选择LINC01836进行验证。

1、样本收集

按照实施例1的方法收集胃癌组织及相应的癌旁组织各45例。

2、在转录水平上进行验证

试剂：反转录试剂盒(DDR037A)购自宝生物工程(大连)有限公司。荧光实时(Real-time)定量PCR(polymerase chain reaction)所用的SYBR Premix Ex Taq^TM(Tli RNaseHPlus)试剂盒为日本Takara公司生产。

2.1提取组织RNA

步骤同实施例1。

2.2引物设计

根据LINC01836转录本序列，通过NCBI的引物设计工具(Primer BLAST)设计引物，上游引物：5’-TGAAGAAACCGTGGAAAC-3’(SEQ ID NO.2)；下游引物：5’-CACAGCCAAGAATGAGATAA-3’(SEQ ID NO.3)。

根据GAPDH(内参基因)序列设计引物，上游引物：5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’(SEQ ID NO.4)；5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.5)。

2.3 cDNA合成

以提取的总RNA(1μg)为模板，加入以下反应体系，具体为：Buffer4μL，RT Enzyme Mix 1μL，Oligo dT Primer(50μM)1μL，Random 6mers(100μM)1μL，以无RNA酶的ddH₂O将反应体积补足为20μL。将上述混合液置于37℃15min，85℃5s，即获得cDNA。该cDNA可用于lncRNA Real-time PCR检测。

2.4 Real-time PCR

按日本Takara公司的Premix Ex Taq^TM(Tli RNaseH Plus)试剂盒推荐的引物最适浓度(10μM)，将LINC01836引物以去离子水溶解，并建立以下反应体系：SYBRPremix Ex Taq^TM(2×)25μL，ROX Reference Dye(50×)1μL，PCR上游引物(10μM)1μL，PCR下游引物(10μM)1μL，cDNA 4μL，灭菌ddH₂O 18μL。以95℃20s预变性，按95℃10s变性、60℃20s退火、70℃10s延伸过程循环42次，获得Ct值。结果釆用相对定量法，运用公式2^-△△ct计算。实验重复3次。

3、结果

统计结果如图1显示，与癌旁组织相比，胃癌组织中LINC01836表达水平显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。利用ROC曲线分析显示，LINC01836在区分胃癌组和癌旁组时，其AUC值是0.8423。

实施例3抑制LINC01836表达

1、细胞培养与转染

细胞培养：胃癌细胞株BGC-823用含10％FBS的DMEM，并放置在5％CO₂、饱和湿度，37℃二氧化碳培养箱培养。培养液每隔两天更换一次，细胞传代时用0.25％胰蛋白酶消化细胞。

siRNA转染：转染的前一天，将细胞消化接种到培养皿或培养板中，细胞接种的数量应保证第二天转染时能达到30-50％的密度。siRNA转染时严格按照Lipofectamin^TM2000说明书进行，4-6h后更换含10％FBS新鲜培养液，继续培养48-72h。

2、siRNA设计

siRNA(small interfering RNA)的设计：通过BLAST检索，在LINC01836的特异性序列区域设计siRNA序列：

siRNA-LINC01836

正义链：5’-AUAUUGUAGAGAAUUCCGGAA-3’(SEQ ID NO.6)；

反义链：5’-CCGGAAUUCUCUACAAUAUCU-3’(SEQ ID NO.7)。

上述siRNA由上海吉玛制药技术有限公司合成，同时该公司提供阴性对照siRNA(siRNA-NC)。

3、利用QPCR实验检测siRNA的干扰情况

3.1提取细胞总RNA利用常规方法进行操作。

3.2 cDNA合成

步骤同实施例2。

3.3 QPCR

步骤同实施例2。

3.4结果

结果如图2所示，抑制LINC01836表达成功，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例4抑制LINC01836表达对胃癌细胞增殖能力的测定

1、步骤：

取对数生长期的BGC-823细胞，消化调整细胞为0.3x10⁴个/孔，接种于96孔培养板上，细胞培养12h后，分别转染siRNA-LINC01836和siRNA-NC，4-6h后，更换含10％FBS的DMEM继续培养48h；细胞培养结束后各孔加入20μL MTT(5mg/ml)，孵育4h后，吸除孔内液体，加入150μL DMSO，震荡10min，用酶标仪在490nm波长处测吸光度值(A值)，以不含细胞的培养液作空白调零，每组设3个复孔，实验重复三次。

2、统计学分析

实验数据均采用均数士标准差表示，采用SPSS15.0统计学软件，进行单因素方差分析(ANOVA)或t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3、结果

结果如图3所示，相比于转染siRNA-NC细胞组，转染siRNA-LINC01836的细胞增殖减缓，差异具有统计学意义(P<0.05)。上述实验结果表明，抑制LINC01836表达可以抑制胃癌细胞增殖。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 北京泱深生物信息技术有限公司

中国医学科学院北京协和医院

<120> LINC01836在制备胃癌诊断产品、治疗药物中的用途

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 954

<212> DNA

<213> 人源(Homo sapiens)

<400> 1

aggagccaac agcctctctg tgcaaaccag acaaccctgc aggaactgtg cttgaagaaa 60

ccgtggaaac tgcccccaac cctcccgtct ctatttcttt ctctgtttta ttatctcatt 120

cttggctgtg aggtaaacag gagaaaatga gaaggtggtt ctggaggacc cgaccgaatt 180

tgctttcgtg acagggtcaa gcgccctttc ctcgccggcc gcagccctca ccaaagggga 240

tttgggggcc tccggacagg ggtcctgaag gttttgaatt gttcaatctc tgggggtaca 300

ggaacccctg caggaggttt caaaggcaag agtttcgcag agagaaaaaa accatgaact 360

ttgcaggttg gtggcggaat ctggtgattt aagaaaacgt gtttaagcct cggccgggcc 420

gcgcctgggc tgtctgcggt gctcttccgg aattctctac aatatctgga agtgaccaag 480

aaaattccag aacccggagg ctgcgccgtg gagataaaca tgggcacctg ggaaggaact 540

gctggaccag cagaatgagg ggccaacgcc aggggcagca ctgcccggcc acagaggact 600

gtggccccac agatgacacc ctcagctacc agctcctgca tctggaagat gaccaggagg 660

aggaaggacg gtctgcaagt gttcaaagtg atgtttccag gccgggcgcg cttgtaatac 720

cagcatttgg gaggctgagg caggcggatc acctgaggtc gggagttcga gaccagcctg 780

accaacgtgg agaaaccccg tctctactaa aaatacaaaa ttagccaggc gtggtggcgc 840

agctactcgg gaggctgagg caggagaatc gcttgaaccc gggaggcgga ggttgcggtg 900

agctgagatt gtgccattgc actccagcct gggcaacaag agtgaaactc cgtc 954

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgaagaaacc gtggaaac 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cacagccaag aatgagataa 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctctggtaaa gtggatattg t 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggtggaatca tattggaaca 20

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

auauuguaga gaauuccgga a 21

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccggaauucu cuacaauauc u 21

Claims

1.一种与胃癌相关的长链非编码RNA，其特征在于，所述长链非编码RNA是LINC01836，所述长链非编码RNA相应的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种治疗胃癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括抑制权利要求1所述的长链非编码RNA的表达的试剂。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述试剂包括针对权利要求1所述的长链非编码RNA设计的RNAi序列，或含有RNAi序列的载体。

4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述RNAi序列如SEQ IDNO.6和SEQID NO.7所示。

5.权利要求1所述的长链非编码RNA在制备诊断胃癌的产品中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述产品包括检测权利要求1所述的长链非编码RNA表达水平的试剂。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述试剂包括PCR扩增引物，所述引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

8.权利要求1所述的长链非编码RNA在制备治疗胃癌的药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物的有效成分能够抑制权利要求1所述的长链非编码RNA的表达。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述有效成分包括针对权利要求1所述的长链非编码RNA的RNAi序列。