CN110257522A - 与乳腺癌诊疗相关的基因hsa_circ_0045881及其应用 - Google Patents
与乳腺癌诊疗相关的基因hsa_circ_0045881及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了乳腺癌诊疗相关的基因hsa_circ_0045881及其应用。本发明提供了提高或增强hsa_circ_0045881基因表达的物质在制备治疗肿瘤的产品或制备抑制肿瘤细胞增殖的产品中的应用。本发明发现人hsa_circ_0045881基因在三阴性乳腺癌诊断和治疗药物制备中的用途,并进一步构建了hsa_circ_0045881基因过表达载体,通过实验证明:hsa_circ_0045881过表达载体能够高效抑制三阴性乳腺癌细胞的生长,在肿瘤治疗中具有重要意义,为临床治疗三阴性乳腺癌奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和治疗领域,具体涉及与乳腺癌诊疗相关的基因hsa_circ_0045881及其应用。
背景技术
乳腺癌是全球范围内女性常见的恶性肿瘤,严重威胁女性健康。乳腺癌发病率不断上升。根据全国肿瘤登记年报,乳腺癌高居我国女性恶性肿瘤第一位,而在北京等城市,乳腺癌发病率高达46.6/10万,是中西部城市的7倍。根据临床病理分型可将乳腺癌分为Luminal A型,Luminal B型,HER2过表达型,基底细胞型(三阴性乳腺癌),各分子亚型间在基因表达水平,发表年龄,临床特征,恶性程度和治疗敏感度及预后均存在差异,其中尤其以三阴性乳腺癌的恶性程度最高且预后较差。乳腺癌的发生、发展与许多肿瘤标志物的异常表达有关,目前研究较多的乳腺癌肿瘤标志物有:孕激素受体(PR)、血管内皮生长因子(VEGF)、雌激素受体(ER)、CD44、p53等。但其真正的临床应用都很有限。因此,进一步开发较高灵敏度和特异性的检测乳腺癌的新型非侵入性生物标志物非常重要和紧迫。
环状RNA(circular RNA,circRNA)是一类新发现的内源性非编码RNA(non-codingRNA,ncRNA),是RNA领域的最新研究热点。与含有5’帽状结构与3’腺苷酸尾巴的线性RNA不同,circRNA形成特殊的共价闭合环状结构,既没有5’-3’极性,亦无多聚腺苷酸尾巴。circRNA是一类广泛存在于哺乳动物细胞中的内源性RNA分子,在转录后水平具有调控基因表达的作用。circRNA在人体细胞中广泛表达,并在肿瘤的发生过程中起着较为重要的作用。circRNA由于其特殊的环状结构,序列高度保守,并且结构更加稳定,因此越来越多的研究认为,circRNA的这种特殊的结构性质,可以使它成为多种疾病的理想的生物标志,以及药物治疗研究的新靶点。
发明内容
本发明的一个目的是提供增强hsa_circ_0045881基因表达的物质或增加hsa_circ_0045881含量和/或活性的物质的用途。
本发明提供了增强hsa_circ_0045881基因表达的物质或增加hsa_circ_0045881含量和/或活性的物质在制备治疗肿瘤的产品中的应用。
本发明提供了增强hsa_circ_0045881基因表达的物质或增加hsa_circ_0045881含量和/或活性的物质在制备抑制肿瘤细胞增殖的产品中的应用;
本发明提供了增强hsa_circ_0045881基因表达的物质或增加hsa_circ_0045881含量和/或活性的物质在制备抑制肿瘤生长的产品中的应用。
进一步的,所述hsa_circ_0045881包括如序列1所示的核苷酸序列。
上述应用中,所述肿瘤为三阴性乳腺癌;所述肿瘤细胞为三阴性乳腺癌细胞。
本发明还提供hsa_circ_0045881基因在作为三阴性乳腺癌诊断标记物中的应用。
本发明还提供检测hsa_circ_0045881基因表达的物质在制备检测或诊断待测样本是否为三阴性乳腺癌的产品中的应用;
本发明提供检测hsa_circ_0045881基因表达的物质在制备检测或诊断待测患者是否患有三阴性乳腺癌的产品中的应用;
本发明提供检测hsa_circ_0045881基因表达的物质在制备检测或诊断待测细胞是否为三阴性乳腺癌细胞的产品中的应用。
进一步的,所述检测hsa_circ_0045881基因表达的物质为扩增hsa_circ_0045881基因的引物对。
更进一步的,所述引物对由序列2所示的单链DNA分子和序列3所示的单链DNA分子组成。
本发明还提供一种用于诊断三阴性乳腺癌的试剂盒,包括由序列2所示的单链DNA分子和序列3所示的单链DNA分子。
本发明具有如下有益效果:
1.将hsa_circ_0045881表达水平作为三阴性乳腺癌早期诊断的分子标志物;
2.将hsa_circ_0045881表达水平作为三阴性乳腺癌恶性程度和预后判别的依据;
3.将hsa_circ_0045881作为三阴性乳腺癌治疗的靶点。
4.本发明首次发现hsa_circ_0045881基因在三阴性乳腺癌诊断和治疗药物制备中的用途,并构建了hsa_circ_0045881过表达载体,通过实验证明:hsa_circ_0045881基因过表达能够高效抑制三阴性乳腺癌细胞的生长,在肿瘤治疗中具有重要意义,为临床治疗三阴性乳腺癌奠定基础。
附图说明
图1为hsa_circ_0045881在三阴性乳腺癌患者癌旁组织和乳腺癌患者肿瘤组织样品中的相对表达量。
图2为hsa_circ_0045881过表达载体加入三阴性乳腺癌细胞后的侵袭结果。
图3为hsa_circ_0045881过表达载体加入三阴性乳腺癌细胞后的增殖情况。
图4为hsa_circ_0045881过表达载体加入三阴性乳腺癌细胞后的细胞转移结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下述非限制性实施例可以使本领域的技术人员更好的理解本发明。
任何熟悉本领域的技术人员在本发明的纰漏范围内,根据本发明的技术方案及构思进行替换或改变均属于本发明的保护范畴。
下述实施例中所使用的试剂:FBS(Gibco 16000-044)、DMEM培养基(Gibco12100-046)、PBS(PH7.4BBI PD0100-1pk)、Trypsin-EDTA Solution(0.05%Trypsin-EDTA,Gibco25200-072)、Lipofectamin2000(lipo2000 11668-019)转染试剂(Invitrogen)、GP-transfect-mate(吉玛基因)。
下述实施例中所使用的MDA-MB-231细胞系购自中科院典藏细胞库。
下述实施例中的研究对象:乳腺癌及癌旁组织26对样品,均采集自2018年,来自苏州大学附属第二医院甲乳外科,均为确诊为乳腺癌的患者(知情同意的志愿者,于手术后取样用于病理检测或本实验),所取组织包括癌旁及肿瘤组织和血浆样品。
实施例1、hsa_circ_0045881作为乳腺癌诊断标志物的发现
hsa_circ_0045881的核苷酸序列如序列1所示。
1、总RNA的获得
取医院石蜡病理切片或被病理诊断为三阴性乳腺癌的患者样品共6例,包括癌旁组织及肿瘤组织,总RNA的提取方法具体如下:
1)取样品共1mL Ezol裂解液。
2)加入0.2mL三氯甲烷,剧烈摇动10s,室温放置3分钟。
3)4℃,12,000rpm离心20min。
4)将上清水相转移至另一新的无RNA酶离心管中,并加入等体积的异丙醇,混匀,-80℃放置1h。
5)4℃,12,000rpm离心10min,去上清。
6)加入1mL的75%乙醇洗涤沉淀。
7)4℃,5,000rpm离心3min,去上清,室温晾干。
8)加入40μL的RNA-free水溶解RNA。
2、qPCR检测
将上述步骤1得到的RNA反转录得到cDNA,以cDNA为模板,采用引物hsa_circ_0045881-FO-1和hsa_circ_0045881-RE-1进行qPCR扩增,以ACTB作为内参基因,H-ACTB-FO-1和H-ACTB-RE-1作为内参引物。引物序列如下:
hsa_circ_0045881-FO-1:CCTTGCCTTTCTTCCTGTTC(序列2);
hsa_circ_0045881-RE-1:CCCTTCGCCGTCTCCAT(序列3);
H-ACTB-FO-1:CGTGGACATCCGCAAAGA;
H-ACTB-RE-1:GAAGGTGGACAGCGAGGC。
定量PCR反应程序:95℃,30秒预变性;95℃,10秒;60℃,30秒,40循环。
qPCR结果如图1所示,从图中可以看出:hsa_circ_0045881在乳腺癌患者癌旁组织和乳腺癌患者肿瘤组织样品中的相对表达量有显著差异,与癌旁组织相比,在乳腺癌患者肿瘤组织中的hsa_circ_0045881的相对表达量明显降低。
实施例2、hsa_circ_0045881过表达在抑制肿瘤生长中的应用
一、hsa_circ_0045881过表达载体构建
根据hsa_circ_0045881基因序列,设计的过表达载体如下表1所示。
表1hsa_circ_0045881过表达载体
二、hsa_circ_0045881过表达载体转染细胞
分别将hsa_circ_0045881过表达载体及Control转染MDA-MB-231细胞。具体步骤如下:
1、MDA-MB-231细胞(三阴性乳腺癌细胞,购买自中科院典藏细胞库)在10cm dish中培养至80-90%融合时,倾去培养液,用3mL PBS洗涤细胞两次。
2、加1mL Trypsin-EDTA solution,混匀后,小心吸去胰酶溶液,37℃放置1分钟。加入2mL完全培养基,吹打使细胞形成单细胞悬液。
3、血球计数板计数,按照每孔约1.5×106的细胞量接种于6孔板。
4、取1.5mlEP管,在管中加入100μL Opti-MEM,加入5μL GP-transfect-mate转染试剂,混匀;取另一1.5mL EP管,加入100μL Opti-MEM,并加入4ughsa_circ_0045881过表达载体,轻轻混匀,于室温静置5min后;将两管液体混合,轻轻吹打混合均匀,室温静置20min
5、期间将前一天铺好的6孔板中培养基移除,按800μL/孔(6孔板)加入培养基;静置20min后,将含有hsa_circ_0045881过表达载体和GP-transfect-mate的转染混合物加入到6孔板中,200μL/孔,同时设立control孔,将孔板摇匀,在培养箱中温育5小时。
6、移除转染液,用PBS漂洗后,加入培养基继续培养,control孔拍照观察转染效率。
三、逆转录及qPCR检测
1、上述步骤一中转染48小时以后收取细胞样品(转hsa_circ_0045881过表达载体的MDA-MB-231细胞和转control的MDA-MB-231细胞),提取总RNA,采用逆转录引物进行逆转录,得到cDNA。
2、以步骤1得到的cDNA为模板,进行荧光定量PCR,检测各组hsa_circ_0045881的表达水平。反应体系(20μL)由10μL 2×SYBR Green qPCR Mix(ThermoFisher kit)、上游引物溶液(20μM)、下游引物溶液(20μM)、模板、rTaq DNA聚合酶溶液(5U/μL)和ddH2O组成。反应体系中的上游引物和下游引物的浓度均为0.10μM,rTaq DNA聚合酶的浓度为0.05U/μL,模板加入量为50ng。
反应条件:94℃3min;94℃12s、62℃30s、72℃30s,40个循环。
引物序列如下:
hsa_circ_0045881-FO-1:CCTTGCCTTTCTTCCTGTTC(序列2);
hsa_circ_0045881-RE-1:CCCTTCGCCGTCTCCAT(序列3);
H-ACTB-FO-1:CGTGGACATCCGCAAAGA;
H-ACTB-RE-1:GAAGGTGGACAGCGAGGC。
四、侵袭实验
1、上述步骤二中转染24小时以后细胞,更换为含5%FBS的培养基饥饿培养24h。
2、实验前,用含0.5%FBS的DMEM培养液按1:6稀释50mg/L Matrigel,取60μL包被Transwell小室底部膜的上室面,放37℃5%CO2培养箱孵育4小时,吸弃上清。
3、转染后的乳腺癌细胞,胰酶消化,血球计数板计数,按5×103细胞/孔的浓度接种于transwell小室,下室加入血清浓度为20%的培液700μL,37℃5%CO2培养48h。
4、取出小室,PBS洗一次。加入预冷的甲醇-20℃固定10min。弃净甲醇厚PBS清洗三遍。用棉签轻轻刮去小室上表面的Matrigel胶,用PBS洗上表面3次。拿出小室倒置,风干。
5、将小室放入新的24-well中,加入200μL 0.1%结晶紫,使膜浸没,37℃染色30min。用ddH2O洗3次。小室风干后,放入孔中,倒置显微镜下取若干视野,拍照计数,统计数据。
结果如图2所示,实验表明过表达hsa_circ_0045881可以有效抑制三阴性乳腺癌细胞的侵袭。
五、细胞增殖
1、MDA-MB-231细胞(三阴性乳腺癌细胞)在10cm dish中培养至80-90%融合时,倾去培养液,用3mL PBS洗涤细胞两次。
2、加1mL Trypsin-EDTA solution,混匀后,小心吸去胰酶溶液,37℃放置1分钟。加入2mL完全培养基,吹打使细胞形成单细胞悬液。
3、血球计数板计数,按照每孔约4×104的细胞量接种于96孔板。
4、取1.5mlEP管,在管中加入125μL Opti-MEM(5复孔),加入1μLGP-transfect-mate转染试剂,混匀;取另一1.5mL EP管,加入125μL Opti-MEM,并加入0.8ug hsa_circ_0045881过表达载体(5复孔),轻轻混匀,于室温静置5min后;将两管液体混合,轻轻吹打混合均匀,室温静置20min
5、期间将前一天铺好的96孔板中培养基移除,按50μL/孔(96孔板)加入培养基;静置20min后,将含有hsa_circ_0045881过表达载体和GP-transfect-mate的转染混合物加入到96孔板中,50μL/孔,同时设立control孔,将孔板摇匀,在培养箱中温育5小时。
6、分别于转染后0、24、48和72小时;小心吸去上清,加入预配置好的CCK-8工作液(90μL新鲜培养基中加入10μL CCK-8),同时设置调零孔(无细胞组),每组设置5个复孔,继续培养2.5小时。
7、在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值,做数据统计。
结果如图3所示,过表达hsa_circ_0045881可以有效抑制三阴性乳腺癌细胞的生长。
六、细胞划痕实验
1、上述步骤二中转染细胞铺板密度提高至2×106/孔,转染后24小时,细胞汇合度为接近100%。
2、用20ul枪头比着直尺,在6孔板中均匀画直线横穿过孔,每孔三条。用PBS洗细胞3次,去除划下的细胞,加入3%FBS培养基。放入37℃5%CO2培养箱继续培养。
3、分别于0、48h拍照,做数据统计。
结果如图4所示,过表达hsa_circ_0045881可有效抑制三阴性乳腺癌细胞的转移。
序列表
<110> 苏州吉玛基因股份有限公司
苏州吉诺瑞生物科技有限公司
<120> 与乳腺癌诊疗相关的基因hsa_circ_0045881及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 154
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccaccacaag ggcccgggcc accaggaaga gcctgctgca tgtcccctat ggagacggcg 60
aaggggagaa agtggacatt tacttccccg acgagtcgtc tgaagccttg cctttcttcc 120
tgttctttca cggaggatac tggcagagcg gaag 154
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccttgccttt cttcctgttc 20
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cccttcgccg tctccat 17
Claims (10)
1.增强hsa_circ_0045881基因表达的物质在制备治疗肿瘤的产品中的应用;
或,增加hsa_circ_0045881含量和/或活性的物质在制备治疗肿瘤的产品中的应用。
2.增强hsa_circ_0045881基因表达的物质在制备抑制肿瘤细胞增殖的产品中的应用;
或,增加hsa_circ_0045881含量和/或活性的物质在制备抑制肿瘤细胞增殖的产品中的应用。
3.增强hsa_circ_0045881基因表达的物质在制备抑制肿瘤生长的产品中的应用;
或,增加hsa_circ_0045881含量和/或活性的物质在制备抑制肿瘤生长的产品中的应用。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用,其特征在于:
所述肿瘤为三阴性乳腺癌;
或,所述肿瘤细胞为三阴性乳腺癌细胞。
5.根据权利要求1-4中任一所述的应用,其特征在于:所述hsa_circ_0045881包括如序列1所示的核苷酸序列。
6.hsa_circ_0045881基因在作为三阴性乳腺癌诊断标记物中的应用。
7.检测hsa_circ_0045881基因表达的物质在制备检测或诊断待测样本是否为三阴性乳腺癌的产品中的应用;
或,检测hsa_circ_0045881基因表达的物质在制备检测或诊断待测患者是否患有三阴性乳腺癌的产品中的应用;
或,检测hsa_circ_0045881基因表达的物质在制备检测或诊断待测细胞是否为三阴性乳腺癌细胞的产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于:所述检测hsa_circ_0045881基因表达的物质为扩增hsa_circ_0045881基因的引物对。
9.根据权利要求8所述的应用,所述引物对由序列2所示的单链DNA分子和序列3所示的单链DNA分子组成。
10.一种用于诊断三阴性乳腺癌的试剂盒,其特征在于:包括由序列2所示的单链DNA分子和序列3所示的单链DNA分子。
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CN114438207A (zh) * | 2022-01-12 | 2022-05-06 | 四川省肿瘤医院 | 一种乳腺癌的环状rna生物标志物及其应用 |
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- 2019-07-17 CN CN201910645745.6A patent/CN110257522A/zh active Pending
Cited By (2)
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CN114438207B (zh) * | 2022-01-12 | 2023-06-20 | 四川省肿瘤医院 | 一种乳腺癌的环状rna生物标志物及其应用 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20190920 |