CN105063221A - 胃癌新型分子标志物krt18p55的检测及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明主要是涉及胃癌新型分子标志物长链非编码RNA-？KRT18P55的检测及其应用。提供了一条在胃癌组织中显著高表达的lncRNA-KRT18P55，其在胃癌组织中的表达量相对于其在配对正常胃组织显著上升，且lncRNA-KRT18P55的表达水平与胃癌劳伦分型（Lauren分型）显著相关。lncRNA-KRT18P55可成为胃癌新型分子标志物及治疗靶点，可用于制备评估胃癌发生与诊断的试剂盒。

Description

胃癌新型分子标志物KRT18P55的检测及其应用
技术领域：
本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种胃癌新型分子标志物长链非编码RNA-KRT18P55的检测试剂盒。
背景技术：
长链非编码RNA(longnoncodingRNA，lncRNA)是一类位于细胞核或细胞质结构类似mRNA、长度大于200个核苷酸的不具有可读框的转录本。LncRNA原先被认为是基因组转录的“噪音”，是RNA聚合酶II转录的副产物，没有生物学功能。然而，近些年的研究表明，lncRNA具有空间和时间特异性，可在多种层面(表观遗传学、选择性剪接和调节mRNA降解等)调节基因的表达，参与基因组印记、染色体沉默、染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程，从而在细胞分化、生长、新陈代谢过程及肿瘤发生中起着至关重要的作用。目前已有较多lncRNA被证实在乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、肝癌、结直肠癌、膀胱癌等在内的人类多种肿瘤中存在差异表达并执行重要的调控功能。
全球癌症统计中，胃癌发病率列居前位，中国又是胃癌高发大国。尽管诊断技术在不断提高，以手术治疗为主的综合治疗手段越来越丰富，但胃癌依旧是全球主要癌症致死性疾病之一。而且，现有的肿瘤标志物CEA、CA19-9、CA50、CA125在胃癌中的敏感度与特异性并不高，虽然CA72-4对胃癌具有较高特异性，但通常也只有在胃癌的III-IV期才出现增高。因此，寻找可靠的生物标志物作为早期诊断依据和可靠的治疗靶点成为当务之急。
近年来，关于lncRNA与胃癌关系的研究开始引起发明人的注意。目前研究显示，lncRNA可以作为致癌或者抑癌分子参与胃癌发生发展、转移。值得注意的是，lncRNA表达水平上的差异或胃癌特异型lncRNA的表达，可作为肿瘤诊断的新型分子标志物。
发明内容：
发明目的：
本发明提供一种胃癌新型分子标志物长链非编码RNA-KRT18P55的检测试剂盒，解决了现有的肿瘤标志物在胃癌中的敏感度与特异性不高的问题。
技术方案：
评估胃癌发生与诊断相关的分子标志物lncRNA-KRT18P55，其特征在于：lncRNA-KRT18P55的基因序列为SEQIDNo.1。
所述分子标志物lncRNA-KRT18P55的用途，其特征在于：用于制备检测胃癌发生与诊断的试剂盒。
上述检测胃癌发生与诊断的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：
(1)从胃组织中抽提总RNA；所用试剂：TRIzol、三氯甲烷、异丙醇、75％乙醇、无酶水；
(2)以总RNA为模板将lncRNA-KRT18P55逆转录为cDNA；所用试剂：Takara公司反转录试剂盒：gDNAEraser、5XgDNAEraserBuffer、PrimeScriptRTEnzymeMixI、5XPrimerScriptBuffer2、RTPrimerMix、RNaseFreedH2O；
(3)将cDNA实时定量PCR；所用试剂：lncRNA-KRT18P55实时荧光定量PCR特异性引物、GAPDH内参实时荧光定量PCR特异性PCR引物、实时荧光定量SYBR染料、无酶水；
lncRNA-KRT18P55上游特异性引物序列为SEQIDNo.2，下游特异性引物序列为SEQIDNo.3；GAPDH作为内源性对照，其上游特异性引物序列为SEQIDNo.4，下游特异性引物序列为SEQIDNo.5。
试剂盒为荧光定量PCR检测试剂盒，所述引物用于SYBRGreen、Taqman探针、分子信标、双杂交探针、符合探针的检测。
试剂盒中的PCR反应液为荧光定量PCR反应液，反应液里含有荧光染料。
荧光定量PCR反应液包括dNTP、Mg2+、Taq酶及buffer缓冲液；荧光染料为SYBRGreenII，Taq酶为热启动酶。
优点及效果：
本发明提出了一种胃癌新型分子标志物长链非编码RNA-KRT18P55的检测试剂盒，具有如下优点：
本发明提供一条在人胃癌组织中显著高表达的lncRNA，该基因被命名为：角蛋白18假基因55(keratin18pseudogene55，KRT18P55)，其转录区域位于17号染色体反义链2660301bp到26634408bp之间，其基因全长为1950bp。通过实时荧光定量PCR，lncRNA-KRT18P55在97例人胃癌组织中相对于其配对正常胃组织显著高表达，且lncRNA-KRT18P55的表达水平与97名患者胃癌劳伦分型(Lauren分型)发生显著相关。因此，lncRNA-KRT18P55有望成为胃癌发生与诊断评估的新型标志物与治疗靶点。
利用本发明的检测制剂可以检测lncRNA-KRT18P55在胃组织中的表达水平，为胃癌发生与诊断评估提供有力的分子生物学基础，具有深远的临床意义和推广性。
附图说明：
图1为实时荧光定量PCR分析lncRNA-KRT18P55在97对胃癌组织与正常胃组织中的表达差异(-ΔΔCt值比较)。
图2为实时荧光定量PCR分析lncRNA-KRT18P55在97对胃癌组织与正常胃组织中的表达差异(2-ΔCt值比较，*P<0.05；**P<0.01)。
具体实施方式：
下面结合附图对本发明做进一步的说明：
本发明提供一条在人胃癌组织中显著高表达的lncRNA，该基因被命名为：角蛋白18假基因55(keratin18pseudogene55，KRT18P55)，其转录区域位于17号染色体反义链2660301bp到26634408bp之间，其基因全长为1950bp。通过实时荧光定量PCR验证发现，在97名接受胃癌根治性手术患者的胃癌组织及其配对正常胃组织样本中，lncRNA-KRT18P55在胃癌组织中的表达量相对于其配对正常胃组织显著上升(P<0.01)。
通过SPSS17.0(SPSSInc，Chicago，IL，USA)软件的非参数检验(Mann-WhitneyU及Kruskall-Wallis)，将上述97对胃癌组织及其配对正常组织荧光定量PCR结果与97名患者的临床病理资料相结合分析发现，lncRNA-KRT18P55的表达水平与胃癌的劳伦分型(Lauren分型)显著相关(P＝0.032)。因此，lncRNA-KRT18P55有望成为胃癌发生与诊断评估的新型分子标志物及治疗靶点。
在胃癌组织中高表达的新型分子标志物lncRNA-KRT18P55的基因序列为SEQIDNo.1。
在上述发现的基础上，本发明提供了所述lncRNA-KRT18P55在制备评估胃癌发生与诊断试剂盒中的用途。
胃癌新型分子标志物lncRNA-KRT18P55可用于制备检测胃癌发生与诊断试剂盒，应用于评估胃癌的发生与诊断，以给患者及时地治疗、有效地干预措施，提高患者的生存质量。
上述检测胃组织中lncRNA-KRT18P55表达量的试剂盒，该试剂盒包括：
(1)从胃组织中抽提总RNA；所用试剂：TRIzol(LifeTechnologies公司；货号：15596-026)、三氯甲烷、异丙醇、75％乙醇、无酶水；
(2)以总RNA为模板将lncRNA-KRT18P55逆转录为cDNA；所用试剂：Takara公司反转录试剂盒(PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser；货号：RR047A)：gDNAEraser、5XgDNAEraserBuffer、PrimeScriptRTEnzymeMixI、5XPrimerScriptBuffer2、RTPrimerMix、RNaseFreedH2O。
(3)将cDNA实时定量PCR；所用试剂：lncRNA-KRT18P55实时荧光定量PCR特异性引物、GAPDH内参实时荧光定量PCR特异性PCR引物、实时荧光定量SYBR染料(Takara公司；PremixExTaqTMII；货号：RR820A)、无酶水。
特异性引物对包括上游引物和下游引物，lncRNA-KRT18P55上游特异性引物序列为SEQIDNo.2，下游特异性引物序列为SEQIDNo.3；GAPDH作为内源性对照，其上游特异性引物序列为SEQIDNo.4，下游特异性引物序列为SEQIDNo.5。(特异性引物序列由上海生工生物工程有限公司设计并合成)。
试剂盒为荧光定量PCR检测试剂盒，所述引物用于SYBRGreen、Taqman探针、分子信标、双杂交探针、符合探针的检测。
试剂盒中的PCR反应液为荧光定量PCR反应液，并包含荧光染料。
荧光定量PCR反应液包括dNTP、Mg2+、Taq酶及buffer缓冲液；荧光染料为SYBRGreenII，Taq酶为热启动酶。
实施例1
制备检测患者胃组织中lncRNA-KRT18P55试剂盒(50次反应)
实施例2
胃组织中lncRNA-KRT18P55的检测
1.胃癌组织的保存：收集中国医科大学附属第一医院肿瘤外科2009-2010年间接受胃癌根治术患者胃癌组织及其配对的正常胃组织97对。置于1.5ml的RNase/DNase-free离心管中，经液氮桶转移至-80℃深低温冰箱保存。
2.胃组织总RNA的提取：取胃癌组织及其配对的正常胃组织50-100mg于RNase/DNase-free离心管(Axygen公司，1.5ml)中，加入TRIzol1ml于离心管中将组织剪碎并匀浆。冰上静置5min后，每管加入200ul/mlTRIzol氯仿，用手剧烈震荡15-30s后，静置5min，4℃12000g离心15min；取上层水相500ul加入新1.5ml的RNase/DNase-free离心管(Axygen公司，1.5ml)中，加入预冷的异丙醇500ul/mlTRIzol轻柔混匀后，静置10min，4℃12000g离心10min；弃上清，加入75％RNaseFreedH2O稀释的乙醇1ml混匀，4℃8500g离心5min，尽量弃上清，室温干燥10min，加入适量RNaseFreedH2O溶解RNA；提取的总RNA使用NanophotometerP-Class(ImplenGmbH，Munich，Germany)测定浓度及纯度，OD260/280比值在1.80-2.0之间，-80℃保存。
3.lncRNA-KRT18P55逆转录得到cDNA：
i.在RNase/DNase-freePCR管(Axygen公司，200μl)中配置去DNA反应液，体系为10μl如下：
(注：加入的RNA体积由RNA的浓度确定，x＝1μg/RNA浓度，此步骤使用的试剂为Takara公司的PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser；货号：RR047A)。
将装有配置好反应液的PCR管放入PCR仪(PCRSystem9700)中42℃孵育2min。
ii.在RNase/DNase-freePCR管(Axygen公司，200μl)中配置反转录反应液，体系为10μl。
(注：此步骤使用的试剂为Takara公司的PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser；货号：RR047A)
将i与ii得到的溶液混合得到20μl体系，PCR仪(PCRSystem9700)37℃孵育5min，85℃孵育5s，得到cDNA。
4.实时荧光定量PCR检测：
i.配置实时荧光定量PCR反应液：
(注：上下游特异性引物均由上海生工生物工程有限公司设计并合成，此步骤试剂为Takara公司的PremixExTaqTMII；货号：RR820A)
ii.严格保证在冰上操作的前提下，使用移液器(Eppendoff公司)将实时荧光定量PCR反应液加入到PCR排管中(Genview公司)，封盖后，放入PCR(Roche480II)定量检测仪中，程序设定为：95℃30s，接着45个循环：95℃5s，60℃30s。
(注：退火温度为56℃-62℃，60℃为最佳)
绘制溶解曲线，检查引物的特异性，程序设定为：95℃5s，60℃1min。采用LightCycler480softwarerelease1.5.1.62进行数据分析。
5.数据分析：本实验数据采用相对定量2-ΔΔCt的方法进行分析，GAPDH作为内参基因，数据利用SPSS17.0软件进行分析，所有统计结果均以P<0.05认为存在显著差异。
用上述方法可得：97名进行胃癌根治术患者中，lncRNA-KRT18P55在80对胃癌组织中相对于配对正常胃组织上调(2-ΔΔCt>1)，如图1所示。
97对胃癌组织及其配对正常胃组织中lncRNA-KRT18P55表达量的平均2-ΔCt值分别为0.76±0.73和0.38±0.34。结果表明lncRNA-KRT18P55在胃癌组织中的表达量比配对的正常胃组织显著上升(P<0.01)，如图2所示。
另一方面，非参数检验Mann-WhitneyU及Kruskall-Wallis分析发现，lncRNA-KRT18P55的表达水平与胃癌Lauren分型显著相关(P＝0.032)，如表1所示。
aKRT18P55表达水平中位数(上四分位数-下四分位数)；
b5名患者被诊断为早期胃癌，未被统计于此项目中；
*显著统计学差异(P＜0.05)。
表1为lncRNA-KRT18P55与97例胃癌患者临床病理因素的关系。
以上研究表明，lncRNA-KRT18P55可作为胃癌发生与诊断评估的新型分子标志物。
利用本发明的检测制剂可以检测lncRNA-KRT18P55在胃组织中的表达水平，为胃癌发生与诊断评估提供有力的分子生物学基础，具有深远的临床意义和推广性。
SEQIDNo.1：
AGTTAAGGCCTTTGTCCGTTGAGGTCAGGACTAGGTGGTCTCAGCCAATGGGGACAGAGCGGTCACGGGGACCGGGTTTGCGCGGCTCCGAGGCCTAACCAGGCAGCCGAGCCTGCCTGCGTCCCGAGGCCGCCTTCCCGGGACCTCTGCACCCTCAGGTCCTCCGTTGGGTGGTGTTCGGGCGGCCGCCAGGCTTCCCGGCCCGCCACTCCCGCTGCCACCCAAAGGCGCTGCGTGCCGGCGGCTTGGTGGAGTTTCGTCGAGGCCCGGCAGGCTTGGGCCAGGAGATCCAGCGGCCGGGCGGGGTCCCGGCTGAGAGAGGCCGATGCCGCCGTCAGTCACCGAGATGGGGTGGGGACGCTTCAAGGCCTGGGTCTGGCCAGGGGGCAGTCACAGCAGGGCCCTAGGGTAATCACTTTGATCAACATGACGAAGGACACTTGGAAACTGAACAAGCATCACTTGACAAGCCTACAGAATCCATAAGATGGATCATTGCTTAATTTCGGGTCTTAGCCAGTTAGATTTACCTTCAGCTTTAACAAAAAATTGGCCGTCAAAACCTGAGTCCTGTCCTCTTGCTCTCCTCCCCGGACAGCATGAACTTCACCACTTGCTCCACCCTCTCCACCAACTACCAGTCCCTGGGCACTGTCCAGGCACCCAGCTATGTGCCCAGCTGGTCAGCAGTGTGGCCAGTGTCTATGCAGGCATCAGGGGCTCTGGTTCCCGGATCTCCATGTCCTGCTTCACCAGCTTCCAGGGCAGCATGGGGTCCAGGGGCCTGCCCGCAGTGATGGCCGGGGGTCTGGCAGGAATGGGAGTCATCCAGAATGAGAAGGAAACCATGCAAAGCCTCAACGACCACCTGGCCTCCTACCTGGACAGAGTTAGGAGCCTGGATACCAAGAACTGGAAGCTGGAGAGCCAGGAGCACCTGGAGAAGAAGGGACCCCAGGTCAGAGACTGGAGCCATGACTTCAAGACCATCGAGAACCTGAGGGCTCAGATCTTTGCAAATACTGTGGACAGTGCCCACATTGTTCTGCAGATCGACAATGCCTGTCTTGCTGGTGATGACTTTAGGGTCAAGTATGAGACAGAGCTGGCCATGTGCCAGTCTGTGGAGAGTGACATCCATGGGCTCCACAAGGTCATTGATGACACCAATGTCACTTGGCTGCAGCTGGAAGCAGAGATCAAGGCTCTCAAGGAGAAGCTGCTCTTCATGAAGAAGAACCATGAAGAGGAAGTAAAGGGCCTATAAGCCCAGATTGCCAGCTCTGGGTTGACTGTGGAGGTAGATGCCCCCAAATCTCATGACCTTGCCAAAATCTTGGCAGACATTGGGCCCAATATGACGAGCTGGCTCCGAAGAACTTAGAGGAGCTGGGCAAGTACTGGTCTCCGCAGATTGAGGAGAGCACCGCAGTTGTCACCACGCAGTCTGCCGAGGTTGGAGCTGCTGAGATGACGCTCACGGAGCTGAGACATACAGTCCAGTCCTTGGAGATCGACCTGGACTCCATGAGCAATCTGAAGGCCAGCTTGGAGAACAGCCTGAGGGAGGTGGAGGCCTGTTACACCCTGCGGACGGAGCAGCTCAACAGGATCCTGCTGCACTTGGAGTCAGAGCTGGCACAGACCCGGGCAGAGGGACAGCACTAGGCCCAGGAGTATGAGGCCCTGCTGAACATCAAGGTCAAGCTGGAGGCTGAGATCGCCACCTACCACCGCCTGCTGGAAGACAGTGAGGACTTCAATCTTTCAATCTTGGTGATGCCCTGGACAGCAGCAACTCCATGCAAACCATCCAAAAGACTACCACCTGCCGGATATTGGATGGCAAAGTGGTGTCTGAGACCAGTGATGCCAAAGTTCTGATACCTTAAGCCAGCAGAAGCAGGGGACCCTTTGGGGAGCAGGAGGCCAATAAAAAGTTCAGAGGTT
SEQIDNo.2
5’-CAGGAATGGGAGTCATCCAG-3’
SEQIDNo.3
5’-CCAGGCTCCTAACTCTGTCC-3’
SEQIDNo.4
5’-CGGATTTGGTCGTATTGGG-3’
SEQIDNo.5
5’-CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3’。

Claims (7)

1.评估胃癌发生与诊断相关的分子标志物lncRNA-KRT18P55，其特征在于：lncRNA-KRT18P55的基因序列为SEQIDNo.1。
2.根据权利要求1所述分子标志物lncRNA-KRT18P55的用途，其特征在于：用于制备检测胃癌发生与诊断的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的检测胃癌发生与诊断的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：
(1)从胃组织中抽提总RNA试剂；
(2)以总RNA为模板将lncRNA-KRT18P55逆转录为cDNA试剂；
(3)将cDNA实时定量PCR试剂；
lncRNA-KRT18P55上游特异性引物序列为SEQIDNo.2，下游特异性引物序列为SEQIDNo.3。
4.根据权利要求2或3所述的检测胃癌发生与诊断的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：
(1)从胃组织中抽提总RNA；所用试剂：TRIzol、三氯甲烷、异丙醇、75％乙醇、无酶水；
(2)以总RNA为模板将lncRNA-KRT18P55逆转录为cDNA；所用试剂：Takara公司反转录试剂盒：gDNAEraser、5XgDNAEraserBuffer、PrimeScriptRTEnzymeMixI、5XPrimerScriptBuffer2、RTPrimerMix、RNaseFreedH2O；
(3)将cDNA实时定量PCR；所用试剂：lncRNA-KRT18P55实时荧光定量PCR特异性引物、GAPDH内参实时荧光定量PCR特异性PCR引物、实时荧光定量SYBR染料、无酶水；
lncRNA-KRT18P55上游特异性引物序列为SEQIDNo.2，下游特异性引物序列为SEQIDNo.3；GAPDH作为内源性对照，其上游特异性引物序列为SEQIDNo.4，下游特异性引物序列为SEQIDNo.5。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：试剂盒为荧光定量PCR检测试剂盒，所述引物用于SYBRGreen、Taqman探针、分子信标、双杂交探针、符合探针的检测。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：试剂盒中的PCR反应液为荧光定量PCR反应液，反应液里含有荧光染料。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：荧光定量PCR反应液包括dNTP、Mg2+、Taq酶及buffer缓冲液；荧光染料为SYBRGreenII，Taq酶为热启动酶。
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