CN106011139A - 一种用于膀胱癌筛查的环状rna的检测及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于膀胱癌筛查的环状RNA的检测及其应用，具体是利用环状RNA芯片，通过差异分析，筛选到一条在人膀胱癌组织中显著高表达的circRNA，命名为cRNA‑ZFR。与正常组织相比，cRNA‑ZFR在人膀胱癌组织中显著高表达，并在大样本荧光定量PCR实验中进一步证实cRNA‑ZFR在人膀胱癌组织中的表达量明显高于正常组织。这一新型的cRNA‑ZFR将为进一步研究膀胱癌的发病机制提供新的思路，也为膀胱癌的早期筛查及预后监测提供了新的靶标。

Description

一种用于膀胱癌筛查的环状RNA的检测及其应用
技术领域
本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种环状RNA及其应用，具体而言，本发明涉及一种环状RNA在制备膀胱癌辅助诊断或者预后监测制剂中的应用。
背景技术
膀胱癌为泌尿系最常见的恶性肿瘤，约95％来源于膀胱上皮。目前用于膀胱癌预防复发的药物疗效并不理想。高达40％-80％的患者会发生一次或多次复发，10％-15％的患者会发展为更高级别的肿瘤或发生转移。因此，发掘新型膀胱肿瘤标志物用于早期有效检测肿瘤的发生、发展及预后监测显得尤为重要。环状RNA(circRNA)是由多个外显子组成的封闭的环状非编码RNA分子。以往对于circRNA的认识主要来自于病毒，类病毒和拟病毒，但是近年来随着RNA测序和生物信息学技术的发展，使得大规模分析转录组数据成为可能，人类基因表达的circRNA也逐渐被了解。circRNA多数位于细胞质中，与线性RNA相比更稳定，且许多circRNA的表达水平不低于线性RNA的表达水平。一些circRNA拥有miRNA的应答原件(MRE)，可以充当分子“海绵”，结合并封闭miRNA，从而抑制miRNA的活性；此外，circRNA很可能也是一种重要的新型转录后调控因子，具有调控其他RNA水平、与蛋白质直接结合调节蛋白质活性和作为蛋白质的模板，指导其合成等功能。
发明内容
本发明利用环状表达谱芯片技术，通过差异分析，筛选到一条在人膀胱癌组织中显著高表达的circRNA，命名为cRNA-ZFR，其转录区域位于5号染色体，全长1561bp。与正常组织相比，cRNA-ZFR在人膀胱癌组织中显著高表达。在大样本荧光定量PCR实验中进一步证实cRNA-ZFR在 人膀胱癌组织中的表达量明显高于正常组织。这一新型的cRNA-ZFR将为进一步研究膀胱癌的发病机制提供新的思路，也为膀胱癌的早期筛查及预后监测提供了新的靶标。
发明人提供的3对膀胱癌和癌旁组织，采用上海康成生物工程有限公司代理的ArrayStar公司的circRNA芯片产品(Human CircRNA Microarray V3.0Service)进行检测，筛选出一条在膀胱癌组织中显著高表达的circRNA，命名为cRNA-ZFR，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。通过35对人膀胱癌与癌旁组织样本的荧光定量PCR验证，发现有32对样本中的cRNA-ZFR在肿瘤组织中显著高表达。
具体而言，本发明提供了一种在膀胱癌组织中高表达的circRNA，其名称为cRNA-ZFR，其对应的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1(5’→3’方向)或其互补序列所示。所述cRNA-ZFR可以是分离的和/或人工合成的。
本发明提供了本发明第一个方面所述cRNA-ZFR用于制备诊断膀胱癌的药物或试剂盒的用途。还提供了能够检测权利要求1所述的环状RNA(cRNA-ZFR)的表达的试剂(如靶向其的特异性引物对)在制备诊断膀胱癌的诊断剂或试剂盒中的用途。
在一个优选的实施方案中，所述cRNA-ZFR用于膀胱癌的辅助诊断。
本发明的第三个方面提供一种用于诊断膀胱癌的试剂盒，其中包括：
1)用于扩增cRNA-ZFR的特异性引物对；
2)标准DNA模板；
3)PCR反应液。
在一个优选的实施方案中，所述特异性引物对包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID No.2，下游引物序列为SEQ ID No.3。
在一个更优选的实施方案中，所述试剂盒为荧光定量PCR检测试剂盒，所述引物适用于SYBR Green、TaqMan探针、分子杂交探针的检测。
在一个更优选的实施方案中，所述试剂盒中的PCR反应液为荧光定量PCR反应液，并包含荧光染料。
在一个更优选的实施方案中，所述荧光定量PCR反应液包括dNTP、Mg2+、Taq酶及buffer缓冲液，所述荧光染料为SYBR Green II，Taq酶 为热启动酶。
本发明的荧光定量PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，特异性好，具有良好的应用前景。
本发明提供了一种检测环状RNA的方法，所述方法包括以下步骤：
1)提取样品总RNA；
2)制备样品cDNA(例如来自膀胱癌组织的样品cDNA)；
3)扩增cRNA-ZFR。
在一个优选的实施方案中，所述方法包括如下步骤：
1)提取样品总RNA：按照SIGMA公司的TRIZOL试剂(货号T9424)所需试剂及步骤提取总RNA，再用7300实时PCR系统核算定量仪定量(Applied Biosystems AB)定量所提取的RNA的纯度和浓度。
2)制备样品cDNA：采用北京康润诚业生物科技有限公司StarScript II One-step RT-PCR试剂盒(货号A215-01)对提取的总RNA反转录合成cDNA。
第一步打开RNA二级结构，反应体系及条件如下：
试剂 用量
Oligo dT 1ul
RNA 1-2ug
DEPC水 补齐至20ul
第二步反转录反应，反应体系及条件如下：
试剂 用量
2.5mM dNTP 2.5ul
5×RT buffer 6ul
HPR(RNase抑制剂) 0.6ul
MLV(逆转录酶) 0.4ul
将上述组分混合均匀后42℃孵育1h，然后70度灭活10min，即得到cDNA。
3)扩增cRNA-ZFR：采用北京康润诚业生物科技有限公司2×RealStar Power SYBR Mixture UNG荧光定量试剂盒(货号A312)，以反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增。
荧光定量PCR体系：
荧光定量PCR程序：95℃30s预变性，接40个循环：95℃30s，56℃30s。
通过对阳性样品的检测，发现本发明定量试剂盒检测准确率为80％-85％，连续3次重复实验，实验结果稳定。
本发明的第五个方面提供一种辅助检测膀胱癌的方法，所述方法包括以下步骤：
1)提取样品总RNA；
2)制备样品cDNA；
3)定量扩增cRNA-ZFR，并根据相对定量结果进行判断。
本发明还提供了本发明所述的cRNA-ZFR用作膀胱癌药物的新靶点的用途。
本发明公开了一种检测膀胱癌的染料类荧光定量PCR试剂盒的使用方法，荧光定量PCR体系：
上游引物；下游引物各1ul(10uM)；DNA模板cDNA 1ul；50XROX 2ul；2×SYBR Green II 10uL，加离子水至5uL。荧光定量PCR程序：95℃30s预变性，接40个循环：95℃30s，56℃30s。
附图说明
图1.CircRNA芯片聚类图，显示3对膀胱癌与癌旁组织差异表达的CircRNA芯片聚类。
图2.针对cRNA-ZFR的序列设计的1对特异性引物PCR扩增后行琼脂糖凝胶电泳测试引物的效果。
图3. 35例膀胱癌临床样本的cRNA-ZFR验证qRT-PCR检测结果。
具体实施方式
实施例1：人膀胱癌与癌旁组织的circRNA芯片表达分析
一、材料和方法
1.材料
组织样本来自于3对膀胱癌患者的住院病例手术切除样本(所有组织样本均来自昆明医科大学第二附属医院泌尿外科)，每对包含膀胱癌组织和配对的癌旁组织。
2.方法
(1)肿瘤组织和正常组织总RNA的提取：按Qiagen公司的RNA提取试剂盒(RNeasy Micro Kit，货号74004)说明书提取膀胱癌组织和癌旁组织的总RNA。
(2)对样品RNA进行Cy5荧光标记(委托上海康成生物工程有限公司进行“ArrayStar Human CircRNA Microarray V3.0Service”进行标记服务)
(3)反转录合成第一链cDNA：以Total RNA为起始，含有T7启动子序列的Oligo(dT)Primer(上海康成生物工程有限公司)为引物，使用CbcScript酶(上海康成生物工程有限公司)合成第一链cDNA。
(4)合成第二链cDNA：DNA聚合酶(上海康成生物工程有限公司)以RNA片段为引物，合成第二链cDNA，并纯化双链cDNA。
(5)体外转录合成cRNA：以cDNA为模板，利用T7Enzyme Mix(上海康成生物工程有限公司)合成cRNA。
(6)随机引物反转录：取1ug cRNA，用随机引物进行反转录。
(7)杂交与清洗：cDNA溶于杂交液(25％甲酰胺，5×SSC，0.1％SDS，0.5％BSA)中45℃杂交过夜，用SSC(上海康成生物工程有限公司)的液体中洗5分钟，玻片甩干后即可用于扫描。
(8)芯片扫描，图像分析，差异基因筛选：芯片用Agilent Microarray Scanner(Agilent p/n G2565BA)进行扫描，并转化为数字信号。将原始数据输入到6eneSpring GX软件中，进行差异基因筛选。
二、结果
关于人膀胱癌的CircRNA芯片聚类分析见图1。芯片筛查发现多条表达上调和表达下调的circRNAs。其中cRNA-ZFR显示出在癌组织中表达显著上调，鉴于其可能在人膀胱癌的癌组织中存在特异性表达，本发明通过以下实施例采用大规模样本分批次进行指标的重复验证。
实施例2：qRT-PCR初步验证cRNA-ZFR在膀胱癌的癌组织和癌旁组织中的差异表达
一、实验材料
选取35对(不同于芯片测试的样本)人膀胱癌的癌组织(由昆明医科大学第二附属医院提供)和配对癌旁组织，对cRNA-ZFR的表达差异进行qRT-PCR验证。
二、实验方法和结果
1.引物特异性鉴定
(1)特异性引物的设计:从Ensemble数据库提取cRNA-ZFR相关的转录本序列，并用根据转录本的序列通过NCBI的引物设计工具(Primer BLAST)设计引物；
设计后的引物序列如下：
上游引物：SEQ ID No.2
下游引物：SEQ ID No.3
(2)将人膀胱癌组织与癌旁组织按照SIGMA公司的TRIZOL试剂(货号T9424)所需试剂及步骤提取总RNA，再用7300实时PCR系统核算定量仪定量(Applied Biosystems AB)定量所提取的RNA的纯度和浓度。
(3)采用北京康润诚业生物科技有限公司StarScript II One-step RT-PCR试剂盒(货号A215-01)对提取的总RNA反转录合成cDNA。
第一步打开RNA二级结构，反应体系及条件如下：
试剂 用量
Oligo dT 1ul
RNA 1-2ug
DEPC水 补齐至20ul
第二步反转录反应，反应体系及条件如下：
试剂 用量
2.5mM dNTP 2.5ul
5*RT buffer 6ul
HPR(RNase抑制剂) 0.6ul
MLV(逆转录酶) 0.4ul
将上述组分混合均匀后42度孵育1h，然后70度灭活10min，即得到cDNA。
(4)cRNA-ZFR的扩增：采用北京康润诚业生物科技有限公司2×RealStar Power SYBR Mixture UNG荧光定量试剂盒(货号A312)，以反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增。
荧光定量PCR体系：
荧光定量PCR程序：95℃30s预变性，接40个循环：95℃30s，56℃30s。
(5)电泳检测，选用DM2000DNA Marker(北京康为世纪生物科技有限公司，货号CW0632)。结果如图2所示：扩增片段大小与预期相同，扩增产物只有一条带。该引物对符合上述标准。上游的特异性引物，其序列见序列表SEQ ID No.2，下游的特异性引物，其序列见序列表SEQ ID No.3。
2.样品总RNA的提取：
采用液氮研磨法，按照SIGMA公司的TRIZOL试剂(货号T9424)所需试剂及步骤提取膀胱癌组织或肿瘤的Total RNA。主要操作步骤如下：
(1)新鲜组织样品迅速放入装有液氮的研钵中进行研磨，最终研磨成粉末状；
(2)每个研钵中加入1ml TRIZOL试剂，继续研磨3-5分钟，直至成匀浆状；
(3)把上述匀浆转移到1.5ml无菌无酶离心管中，每1份匀浆中加入0.2ml氯仿。混匀后12000g离心10分钟。RNA存在于上层水相中；
(4)吸取上层水相(约200-300ul)转移到1.5ml无菌无酶新管中，0.5ml异丙醇混匀，12000g离心10分钟；
(5)弃上清，用75％的乙醇洗涤RNA沉淀一次，用20ul无RNA酶的水吹打几次溶解RNA，保存于-80℃低温冰箱。
3.标准DNA模板的制备
根据cRNA-ZFR碱基序列(其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示)，委托上海生工合成。
取样2ul合成产物，连接到pUC-T TA克隆载体(北京康为世纪生物科技有限公司，货号CW0801)，随后转化到DH5a感受态细胞中。通过序列为SEQ ID No.2和SEQ ID No.3的特异性引物筛选阳性克隆,提取质粒DNA，质粒DNA用7300实时PCR系统核算定量仪定量,并做10倍系列稀释作为标准曲线(标准DNA模板浓度范围在102-106拷贝/u1)。
4.敏感性实验
将标准DNA模板质粒按比例稀释为102、103、104、105、106拷贝/u1，进行荧光定量PCR，检测灵敏度。最低检出浓度为102拷贝/u1。
5.合成cDNA模板
取上述30对膀胱癌组织和配对癌旁组织的总RNA，采用北京康润诚业生物科技有限公司StarScript II One-step RT-PCR试剂盒(货号A215-01)对提取的总RNA反转录合成cDNA。
第一步打开RNA二级结构，反应体系及条件如下：
试剂 用量
Oligo dT 1ul
RNA 1-2ug
DEPC水 补齐至20ul
第二步反转录反应，反应体系及条件如下：
将上述组分混合均匀后42度孵育1h，然后70度灭活10min，即得到cDNA。
6.荧光定量PCR检测cRNA-ZFR表达量
采用北京康润诚业生物科技有限公司2X RealStar Power SYBR Mixture UNG荧光定量试剂盒(货号A312)，以反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增。
荧光定量PCR体系：
荧光定量PCR程序：95℃30s预变性，接40个循环：95℃30s，56℃30s。
根据qRT-PCR的相对定量公式：2- △ Ct，分别计算出cRNA-ZFR在膀胱癌患者癌组织(T)和癌旁组织(N)中的表达水平，结果如图3所示：cRNA-ZFR在癌旁组织中的表达水平主要集中在0.32-3.76之间，而癌组织中的cRNA-ZFR的表达量主要集中在0.82-15.7之间，明显高于正常组织。以上结果说明，cRNA-ZFR在肿瘤组织中普遍高表达。本实验结果显示：cRNA-ZFR在35例膀胱癌与癌旁组织中，32例上调，阳性检出率＝上调表达例数/总检测例数×100％＝32/35＝91.4％。CRNA-ZFR可以作为膀胱癌诊断的新肿瘤标志物，用于膀胱癌的筛查。
实施例3：利用cRNA-ZFR的差异表达对膀胱癌组织进行筛查
一、实验材料
选取100份人膀胱癌组织和100份癌旁组织(由昆明医科大学第二附属医院提供)，对cRNA-ZFR的表达差异进行qRT-PCR检测。
二、实验方法和结果
1.引物特异性鉴定
(1)采用如下特异性引物序列：
上游引物：SEQ ID No.2
下游引物：SEQ ID No.3
(2)将人膀胱癌组织与癌旁组织按照SIGMA公司的TRIZOL试剂(货号T9424)所需试剂及步骤提取总RNA，再用7300实时PCR系统核酸定量仪定量(Applied Biosystems AB)定量所提取的RNA的纯度和浓度。
(3)采用北京康润诚业生物科技有限公司StarScript II One-step RT-PCR试剂盒(货号A215-01)对提取的总RNA反转录合成cDNA。
第一步打开RNA二级结构，反应体系及条件如下：
试剂 用量
Oligo dT 1ul
RNA 1-2ug
DEPC水 补齐至20ul
第二步反转录反应，反应体系及条件如下：
试剂 用量
2.5mM dNTP 2.5ul
5*RT buffer 6ul
HPR(RNase抑制剂) 0.6ul
MLV(逆转录酶) 0.4ul
将上述组分混合均匀后42度孵育1h，然后70度灭活10min，即得到cDNA。
(4)cRNA-ZFR的扩增：采用北京康润诚业生物科技有限公司2×RealStar Power SYBR Mixture UNG荧光定量试剂盒(货号A312)，以反转 录的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增。
荧光定量PCR体系：
试剂 用量
2×MIX 10ul
50×ROX 2ul
引物 各1ul
DNA模板 1ul
RNase Free ddH2O 补齐至20ul
荧光定量PCR程序：95℃30s预变性，接40个循环：95℃30s，56℃30s。
2.样品总RNA的提取：
采用液氮研磨法，按照SIGMA公司的TRIZOL试剂(货号T9424)所需试剂及步骤提取膀胱癌组织或肿瘤的Total RNA。主要操作步骤如下：
(1)新鲜组织样品迅速放入装有液氮的研钵中进行研磨，最终研磨成粉末状；
(2)每个研钵中加入1ml TRIZOL试剂，继续研磨3-5分钟，直至成匀浆状；
(3)把上述匀浆转移到1.5ml无菌无酶离心管中，每1份匀浆中加入0.2ml氯仿。混匀后12000g离心10分钟。RNA在于上层水相中；
(4)吸取上层水相(约200-300ul)转移到1.5ml无菌无酶新管中，0.5ml异丙醇混匀，12000g离心10分钟；
(5)弃上清，用75％的乙醇洗涤RNA沉淀一次，用20ul无RNA酶的水吹打几次溶解RNA，保存于-80℃低温冰箱。
3.合成cDNA模板
取上述100例膀胱癌组织和100例癌旁组织的总RNA，采用北京康润诚业生物科技有限公司StarScript II One-step RT-PCR试剂盒(货号A215-01)对提取的总RNA反转录合成cDNA。
第一步打开RNA二级结构，反应体系及条件如下：
试剂 用量
Oligo dT 1ul
RNA 1-2ug
DEPC水 补齐至20ul
第二步反转录反应，反应体系及条件如下：
试剂 用量
2.5mM dNTP 2.5ul
5*RT buffer 6ul
HPR(RNase抑制剂) 0.6ul
MLV(逆转录酶) 0.4ul
将上述组分混合均匀后42度孵育1h，然后70度灭活10min，即得到cDNA。
4.荧光定量PCR检测cRNA-ZFR表达量
采用北京康润诚业生物科技有限公司2X RealStar Power SYBR Mixture UNG荧光定量试剂盒(货号A312)，以反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增。
荧光定量PCR体系：
试剂 用量
2*MIX 10ul
50*ROX 2ul
引物 各1ul
DNA模板 1ul
RNase Free ddH2O 补齐至20ul
荧光定量PCR程序：95℃30s预变性，接40个循环：95℃30s，56℃30s。
qRT-PCR检测膀胱癌组织样本中cRNA-ZFR的扩增曲线。产物扩增曲线在反应的早期就可能被监测到，起始点表示产物聚集的对数期开始，该期产物的荧光信号呈指数增长，检测仪将此点定义为Ct值。根据Ct值可以预测靶基因产物的起始浓度，即在PCR反应条件相同的情况下，靶基因起始浓度越大，则Ct值就越低。我们将癌旁对照组均值的95％可信 区间的上界(X±1.83SD)作为本诊断实验的Cut-off值，其值为4.673。在此分界值条件下，本诊断实验的灵敏度为93％，特异度为83％。
临床灵敏度可用来衡量某种试验检测出有病者的能力，灵敏度是将实际有病的人正确地判定为真阳性的比例。
本实验灵敏度＝93/(93+7)×％＝93％。
临床特异度是衡量试验正确地判定无病者的能力，特异度是将实际无病的人正确地判定为真阴性的比例。
本实验特异度＝85/(15+85)×％＝85％。
CircRNA作为全新的环状RNA，不仅能成为膀胱癌诊断的肿瘤标志物，而且有望成为膀胱癌治疗靶点，具有十分重要的科学意义和生理意义。
SEQ ID No.1
cRNA-ZFR序列：
GCTACTTGGGAGGCTGAGACAGGAGAATCGCTTGAACCCAGGAGGCCGAGGTTGCAGTGATCTGAGATCGTGCACTCCAGCCTGGGGGACAGAGTGACACTCCGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAATGCCTGTTTTGGGTTCTTCATTTTTTTCCTATAACTGTAACTATATTGAGCATTCTATATTTATCATCAGTTCTTTGTTATATTAGCTCCAGAATAACTTACGACCATTTAGAGTACTGAACAAACTCAGTAGTTTATTGTACATACTCATTAAGGTGGATTTTTGTGTTCCCTCTTGTCTTGTTGTCTTTGTGCTAGTGCACTGTGTCCAGTAATCTTTCCTTCGGATTTCGTTTTGGTGGGTAGGGTTTATATTTCCAGAAATTGTTTATTATATTACTAAATTAATAAGTTAACCTTTTGTTCCTCATATTGGATTATGTAAATTTATTGAAAATAACTCCGTGGATATATTAAAGTGCCAACAAGCTCTCAAATGGCTCATGTGACACTGATGCTACCTTAAGGAAGTGTCTTGCTCACCTGGTCAAACACCCATTCCTCACTGCATTTTGCCAATTCAATCCATTTTAGATGTAACCTCGGGTATGGTGAAAGACCCACCGGACGTCTTGGACAGGCAAAAATGCCTTGACGCTCTGGCTGCTCTACGCCACGCTAAGTGGTTCCAGGTTCGGAACATCATTTTACTTTTTTCTTGTAGCCTTATGAGAGAAGTAGTTCAGTACAACATGTTTAACTGTGCTTAAACATTTCAAAAGACTGCCCAAGCAATACTATTTTAAATTAAATATCAGAAAATATGTTAACATAGAAAGCTGGGTATGATGATCTGCATATTGCAGTTATTATTAATTTGACAATGAACTTAGGTTTGGGGAGTGTTTTGTAGTTGGGGTTTTTTTATTTTTTATTTTTAGTGGCTATATTTAAAGTTGACTTGTTTAGGAACATCACATGTTTGTGTATATATATTATATTCCATAAGGCTGCAGATTAACTTTGCTTTAAATAATGGAATATGTGTTTAAAGCTTTGTGTATAGTTTTAAGATTTTTTTCCCCCTCTTTCTCTAAGTTAATAAGTGTAGGGAGTGAAAGGTGAGGAAGCAGCTGTTTGGTTTAGTGACTTTGCAGTCATGCAAAGGCACAGAAGGGAAACCAAACAGATTTCCTTAACCTTTCAGTCCCTAGACAAACTTTTTAGCTCTTTACTTTTTCTTTTATTTCTAATGTAGGCAGACTTTTTTTTTTTAAGTTTACTGTTTTAAATGAACACAGGTCAAGGTTCACAGGGGATCAAGAAATATTATTCTTGTATAATCTGTTTACTTTGACCTAAATACCAGCTTTTAAATACTAACCCTGGCATAAAATACTGCTGTAAATGGCAGCTCATTGAATCCAATTTTAAGTGTGATTGTTTTTGTTTTTATCTGAGCTTCCATTGAACGGTGGTATTTTAACTTTTTTTCATCAAGGGATATATTCAGTATTTCTAAGATTAATTCAATTGGTTTTTATGTT
SEQ ID No.2
上游引物：5’-AATAAGTTAACCTTTTGTT-3’
SEQ ID No.3
下游引物：5’-TTAAATATCAGAAAATATG-3’ 。

Claims (10)

1.一种环状RNA，名称为cRNA-ZFR，其对应的cDNA序列如SEQ IDNo.1或其互补序列所示。
2.根据权利要求1所述的环状RNA，其在膀胱癌组织中相对于癌旁正常组织高表达。
3.权利要求1所述的环状RNA(cRNA-ZFR)用于制备诊断膀胱癌的诊断剂或试剂盒的用途。
4.能够检测权利要求1所述的环状RNA(cRNA-ZFR)的表达的试剂在制备诊断膀胱癌的诊断剂或试剂盒中的用途。
5.一种用于诊断膀胱癌的试剂盒，其包括：
1)用于扩增权利要求1所述的环状RNA(cRNA-ZFR)的特异性引物对；
2)标准DNA模板；和
3)PCR反应液。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中所述特异性引物对包括上游引物和下游引物，其中上游引物序列为SEQ ID No.2，下游引物序列为SEQID No.3。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其中所述试剂盒为荧光定量PCR检测试剂盒，所述引物适用于SYBR Green、TaqMan探针和/或分子杂交探针的检测。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其中所述试剂盒中的PCR反应液为荧光定量PCR反应液，并进一步包含荧光染料，优选所述荧光定量PCR反应液包括dNTP、Mg2+、Taq酶及缓冲液，所述荧光染料为SYBR GreenII，和/或Taq酶为热启动酶。
9.一种检测环状RNA的方法，所述方法包括以下步骤：
1)提取样品总RNA；
2)制备样品cDNA；和
3)定量扩增cRNA-ZFR。
10.权利要求1所述的环状RNA(cRNA-ZFR)用作膀胱癌药物的靶点的用途。
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