CN104357443B

CN104357443B - 一种用于膀胱癌筛查的长链非编码rna的检测及其应用

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Publication number: CN104357443B
Application number: CN201410687379.8A
Authority: CN
Inventors: 范祖森; 李翀; 杜颖; 杨昭; 何璐云; 王彦英; 阎新龙; 朱平平
Original assignee: Institute of Biophysics of CAS
Current assignee: Institute of Biophysics of CAS
Priority date: 2014-11-25
Filing date: 2014-11-25
Publication date: 2017-03-15
Anticipated expiration: 2034-11-25
Also published as: CN104357443A

Abstract

本发明涉及一种用于膀胱癌筛查的长链非编码RNA的检测及其应用，具体是利用长链非编码表达谱芯片技术，通过差异分析，筛选到一条在人膀胱癌组织中显著高表达的lncRNA，命名为lncRNA‑AC1。与正常组织相比，lncRNA‑AC1在人膀胱癌组织中显著高表达，并在大样本荧光定量PCR实验中进一步证实lncRNA‑AC1在人膀胱癌组织中的表达量明显高于正常组织。这一新型的lncRNA‑AC1将进一步丰富膀胱癌发病机制的研究，也为膀胱癌的早期诊断及预后监测提供了新的肿瘤标志物和治疗靶点。

Description

一种用于膀胱癌筛查的长链非编码RNA的检测及其应用

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种长链非编码RNA及其应用，具体而言，本发明涉及一种长链非编码RNA在制备膀胱癌辅助诊断或者预后制剂中的应用。

背景技术

膀胱癌为泌尿系最常见的恶性肿瘤，发病率在美国被列为男性恶性肿瘤的第四位，女性恶性肿瘤的第七位，仅次于前列腺癌。在我国发病率为第八位，居泌尿系肿瘤第一位。膀胱癌约95％来源于膀胱上皮，绝大多数为恶性，其中以移行细胞癌最常见，占80％以上。膀胱癌在肿瘤切除后的“预防复发”是临床的一个重要难题。目前用于膀胱灌注预防复发的药物，虽然在一定程度上能降低膀胱癌术后复发率，但是因特异性差、肿瘤多药耐药性(MDR)等问题的存在，总体疗效并不理想。高达40％～80％的患者要发生一次或多次复发，10％～15％的患者发展为更高级别的肿瘤或发生转移。

由于膀胱癌极易复发，早期有效检测肿瘤的发生、发展及提高抗癌药物的疗效显得尤为重要，发掘新型膀胱肿瘤标志物作为诊断与治疗的靶点一直是膀胱肿瘤研究的热点。长链非编码RNA(lncRNA)是指长度超过200个核苷酸、具有调控基因表达作用的非编码RNA。LncRNA原先被认为是基因组转录的“噪音”，是RNA聚合酶II转录的副产物，没有生物学功能，然而，近几年研究表明，lncRNA参与了X染色体沉默、基因组印记、染色质修饰、转录激活或抑制等多种重要的细胞调控功能。目前已发现的lncRNA主要分布在细胞核中，少部分分布在细胞质中。细胞核中lncRNA主要通过介导染色质修饰分子DNA甲基转移酶DNMT3、PRC2复合物、H3K4甲基转移酶MLL1复合物、H3K9甲基转移酶等到特定的基因组区域而发挥功能。根据作用位点的不同，主要分为cis(调控相邻基因的表达)和trans(调控远端基因的表达)作用的lncRNA。然而，对于这两类lncRNA，靶向作用的机制还急需深入研究和分析，尤其是cis作用的lncRNA如何停留在它们靶基因的转录位点，以及trans作用的lncRNA如何找到它们的远距离靶点。近年的研究发现，lncRNA参与了细胞内多种重要生命活动，具有多样的调控机制。

发明内容

本发明利用长链非编码表达谱芯片技术，通过差异分析，筛选到一条在人膀胱癌组织中显著高表达的lncRNA，命名为lncRNA-AC1，其转录区域位于2号染色体，全长849bp。与正常组织相比，lncRNA-AC1在人膀胱癌组织中显著高表达，并在大样本荧光定量PCR实验中进一步证实lncRNA-AC1在人膀胱癌组织中的表达量明显高于正常组织。这一新型的lncRNA-AC1将进一步丰富膀胱癌发病机制的研究，也为膀胱癌的早期诊断及预后监测提供了新的肿瘤标志物和治疗靶点。

发明人提供的3对膀胱癌和癌旁组织，通过SIGMA公司的TRIZOL试剂(货号T9424)所需步骤提取总RNA后，采用上海康成生物工程有限公司代理的ArrayStar公司的lncRNA芯片产品(Human LncRNA Microarray V3.0Service)进行检测，筛选出一条在膀胱癌组织中显著高表达的lncRNA，命名为lncRNA-AC1，其核酸序列如SEQ ID No.1所示。后期经过30对人膀胱癌与癌旁组织样本荧光定量PCR验证，发现26对样本中，肿瘤组织的lncRNA-AC1显著高于癌旁组织。lncRNA-AC1作为膀胱癌的新靶点，为膀胱癌的临床治疗和药物开发提供理论基础。

具体而言，本发明的第一个方面提供一种在膀胱癌组织中高表达的lncRNA，其名称为lncRNA-AC1，其核酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明的第二个方面提供本发明第一个方面所述lncRNA-AC1用于制备诊断膀胱癌的药物或试剂盒的用途。

在一个优选的实施方案中，所述lncRNA-AC1用于膀胱癌的辅助诊断。

本发明的第三个方面提供一种用于诊断膀胱癌的试剂盒，其中包括：

1)用于扩增lncRNA-AC1的特异性引物对；

2)标准DNA模板；

3)PCR反应液。

在一个优选的实施方案中，所述特异性引物对包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID No.2，下游引物序列为SEQ ID No.3。

在一个更优选的实施方案中，所述试剂盒为荧光定量PCR检测试剂盒，所述引物适用于SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、复合探针的检测。

在一个更优选的实施方案中，所述试剂盒中的PCR反应液为荧光定量PCR反应液，并进一步包含荧光染料。

在一个更优选的实施方案中，所述荧光定量PCR反应液包括dNTP、Mg²⁺、Taq酶及buffer缓冲液，所述荧光染料为SYBR Green II，Taq酶为热启动酶。

本发明的荧光定量PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，特异性好，具有良好的应用前景。

本发明的第四个方面提供一种检测长链非编码RNA的方法，所述方法包括以下步骤：

1)提取样品总RNA；

2)制备样品cDNA；

3)扩增lncRNA-AC1。

在一个优选的实施方案中，所述方法包括如下步骤：

1)提取样品总RNA：按照SIGMA公司的TRIZOL试剂(货号T9424)所需试剂及步骤提取总RNA，再用7300real time PCR system核算定量仪定量(Applied Biosystems AB)定量所提取的RNA的纯度和浓度。

2)制备样品cDNA：采用北京康润诚业生物科技有限公司StarScript II One-stepRT-PCR试剂盒(货号A215-01)对提取的总RNA反转录合成cDNA。

第一步打开RNA二级结构，反应体系及条件如下：

试剂	用量
		Oligo dT	1ul
RNA	1-2ug
		DEPC水	补齐至20ul

将上述组分混合后70度反应5min然后冰浴10min

第二步反转录反应，反应体系及条件如下：

试剂	用量
		2.5mM dNTP	2.5ul
5×RT buffer	6ul
		HPR(RNase抑制剂)	0.6ul
MLV(逆转录酶)	0.4ul

将上述组分混合均匀后42℃孵育1h，然后70度灭活10min，即得到cDNA。

3)扩增lncRNA-AC1：采用北京康润诚业生物科技有限公司2×RealStar PowerSYBR Mixture UNG荧光定量试剂盒(货号A312)，以反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增。

荧光定量PCR体系：

荧光定量PCR程序：95℃30s预变性，接40个循环：95℃30s，60℃30s。

通过对阳性样品的检测，发现本发明定量试剂盒检测准确率为83％-87％，连续3次重复实验，实验结果稳定。

本发明的第五个方面提供一种辅助检测膀胱癌的方法，所述方法包括以下步骤：

1)提取样品总RNA；

2)制备样品cDNA；

3)定量扩增lncRNA-AC1，并根据相对定量结果进行判断。

本发明的第六个方面提供本发明第一个方面所述的lncRNA-AC1用作膀胱癌药物的新靶点的用途。

本发明还公开了一种检测膀胱癌的染料类荧光定量PCR试剂盒的使用方法，荧光定量PCR体系：

上游引物；下游引物各1ul(10uM)；DNA模板cDNA 1ul；50XROX 2ul；2×SYBR GreenII 10uL，加离子水至5uL。荧光定量PCR程序：95℃30s预变性，接40个循环：95℃30s，60℃30s。

附图说明

图1.LncRNA芯片聚类图，显示6对膀胱癌与癌旁组织差异表达的LncRNA芯片聚类。

图2.针对lncRNA-AC1的序列设计的1对特异性引物PCR扩增后行琼脂糖凝胶电泳测试引物的效果。

图3.30例膀胱癌临床样本的lncRNA-AC1验证qRT-PCR检测结果。

图4.qRT-PCR检测膀胱癌组织样本中lncRNA-AC1的扩增曲线。

具体实施方式

实施例1：人膀胱癌与癌旁组织的lncRNA芯片表达分析

一、材料和方法

1.材料

组织样本来自于3对膀胱癌患者的住院病例手术切除样本，每对包含膀胱癌组织和配对的癌旁组织。

2.方法

(1)肿瘤组织和正常组织总RNA的提取：按Qiagen公司的RNA提取试剂盒(RNeasyMicro Kit，货号74004)说明书提取膀胱癌组织和癌旁组织的总RNA。

(2)对样品RNA进行Cy5荧光标记(委托上海康成生物工程有限公司进行“ArrayStar Human LncRNA Microarray V3.0Service”进行标记服务)

(3)反转录合成第一链cDNA：以Total RNA为起始，含有T7启动子序列的Oligo(dT)Primer(上海康成生物工程有限公司)为引物，使用CbcScript酶(上海康成生物工程有限公司)合成第一链cDNA。

(4)合成第二链cDNA：DNA聚合酶(上海康成生物工程有限公司)以RNA片段为引物，合成第二链cDNA，并纯化双链cDNA。

(5)体外转录合成cRNA：以cDNA为模板，利用T7Enzyme Mix(上海康成生物工程有限公司)合成cRNA。

(6)随机引物反转录：取1ug cRNA，用随机引物进行反转录。

(7)杂交与清洗：cDNA溶于杂交液(25％甲酰胺，5×SSC，0.1％SDS，0.5％BSA)中45℃杂交过夜，用SSC(上海康成生物工程有限公司)的液体中洗5分钟，玻片甩干后即可用于扫描。

(8)芯片扫描，图像分析，差异基因筛选：芯片用Agilent Microarray Scanner(Agilent p/n G2565BA)进行扫描，并转化为数字信号。将原始数据输入到6eneSpring GX软件中，进行差异基因筛选。

二、结果

关于人膀胱癌的LncRNA芯片聚类分析见图1。芯片筛查发现多条表达上调和表达下调的lncRNAs。其中lncRNA-AC1显示出在癌组织中表达显著上调，鉴于其可能在人膀胱癌的癌组织中存在特异性表达，本发明通过以下实施例采用大规模样本分批次进行指标的重复验证。

实施例2：qRT-PCR初步验证lncRNA-AC1在膀胱癌的癌组织和癌旁组织中的差异表达

一、实验材料

选取30对(不同于芯片测试的样本)人膀胱癌的癌组织(由昆明医科大学第二附属医院提供)和配对癌旁组织，对lncRNA-AC1的表达差异进行qRT-PCR验证。

二、实验方法和结果

1.引物特异性鉴定

(1)特异性引物的设计:从Ensemble数据库提取lncRNA-AC1相关的转录本序列，并用根据转录本的序列通过NCBI的引物设计工具(Primer BLAST)设计引物；

设计后的引物序列如下：

上游引物：SEQ ID No.2

下游引物：SEQ ID No.3

(2)将人膀胱癌组织与癌旁组织按照SIGMA公司的TRIZOL试剂(货号T9424)所需试剂及步骤提取总RNA，再用7300real time PCR system核算定量仪定量(AppliedBiosystems AB)定量所提取的RNA的纯度和浓度。

(3)采用北京康润诚业生物科技有限公司StarScript II One-step RT-PCR试剂盒(货号A215-01)对提取的总RNA反转录合成cDNA。

第一步打开RNA二级结构，反应体系及条件如下：

试剂	用量
		Oligo dT	1ul
RNA	1-2ug
		DEPC水	补齐至20ul

将上述组分混合后70度反应5min然后冰浴10min

第二步反转录反应，反应体系及条件如下：

试剂	用量
		2.5mM dNTP	2.5ul
5*RT buffer	6ul
		HPR(RNase抑制剂)	0.6ul
MLV(逆转录酶)	0.4ul

将上述组分混合均匀后42度孵育1h，然后70度灭活10min，即得到cDNA。

(4)lncRNA-AC1的扩增：采用北京康润诚业生物科技有限公司2×RealStar PowerSYBR Mixture UNG荧光定量试剂盒(货号A312)，以反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增。

荧光定量PCR体系：

(5)电泳检测，选用DM2000DNA Marker(北京康为世纪生物科技有限公司，货号CW0632)。结果如图2所示：扩增片段大小与预期相同，扩增产物只有一条带。该引物对符合上述标准。上游的特异性引物，其序列见序列表SEQ ID No.2，下游的特异性引物，其序列见序列表SEQ ID No.3。

2.样品总RNA的提取：

采用液氮研磨法，按照SIGMA公司的TRIZOL试剂(货号T9424)所需试剂及步骤提取膀胱癌组织或肿瘤的Total RNA。主要操作步骤如下：

(1)新鲜组织样品迅速放入装有液氮的研钵中进行研磨，最终研磨成粉末状；

(2)每个研钵中加入1ml TRIZOL试剂，继续研磨3-5分钟，直至成匀浆状；

(3)把上述匀浆转移到1.5ml无菌无酶离心管中，每1份匀浆中加入0.2ml氯仿。混匀后12000g离心10分钟。RNA存在于上层水相中；

(4)吸取上层水相(约200-300ul)转移到1.5ml无菌无酶新管中，0.5ml异丙醇混匀，12000g离心10分钟；

(5)弃上清，用75％的乙醇洗涤RNA沉淀一次，用20ul无RNA酶的水吹打几次溶解RNA，保存于-80℃低温冰箱。

3.标准DNA模板的制备

根据lncRNA-AC1碱基序列(其核酸序列如序列表SEQ ID No.1所示)，委托上海生工合成。

取样2ul合成产物，连接到pUC-T TA克隆载体(北京康为世纪生物科技有限公司，货号CW0801)，随后转化到DH5a感受态细胞中。通过序列为SEQ ID No.2和SEQ ID No.3的特异性引物筛选阳性克隆,提取质粒DNA，质粒DNA用7300real time PCR system核算定量仪定量,并做10倍系列稀释作为标准曲线(标准DNA模板浓度范围在10²-10⁶拷贝/u1)。

4.敏感性实验

将标准DNA模板质粒按比例稀释为10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶拷贝/u1，进行荧光定量PCR，检测灵敏度。最低检出浓度为10²拷贝/u1。

5.合成cDNA模板

取上述30对膀胱癌组织和配对癌旁组织的总RNA，采用北京康润诚业生物科技有限公司StarScript II One-step RT-PCR试剂盒(货号A215-01)对提取的总RNA反转录合成cDNA。

第一步打开RNA二级结构，反应体系及条件如下：

试剂	用量
		Oligo dT	1ul
RNA	1-2ug
		DEPC水	补齐至20ul

将上述组分混合后70度反应5min然后冰浴10min

第二步反转录反应，反应体系及条件如下：

6.荧光定量PCR检测lncRNA-AC1表达量

采用北京康润诚业生物科技有限公司2X RealStar Power SYBR Mixture UNG荧光定量试剂盒(货号A312)，以反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增。

荧光定量PCR体系：

根据qRT-PCR的相对定量公式：2^-△Ct，分别计算出lncRNA-AC1在膀胱癌患者癌组织(T)和癌旁组织(N)中的表达水平，结果如图3所示：lncRNA-AC1在癌旁组织中的表达水平主要集中在0.27-3.16之间，而癌组织中的lncRNA-AC1的表达量主要集中在0.86-14.5之间，明显高于正常组织。以上结果说明，lncRNA-AC1在肿瘤组织中普遍高表达。本实验结果显示：lncRNA-AC1在30例膀胱癌与癌旁组织中，26例上调，阳性检出率＝上调表达例数/总检测例数×100％＝26/30＝86.7％。LncRNA-AC1可以作为膀胱癌诊断的新肿瘤标志物，用于膀胱癌的筛查。

实施例3：利用lncRNA-AC1的差异表达对膀胱癌组织进行筛查

一、实验材料

选取100份人膀胱癌组织和100份癌旁组织(由昆明医科大学第二附属医院提供)，对lncRNA-AC1的表达差异进行qRT-PCR检测。

二、实验方法和结果

1.引物特异性鉴定

(1)采用如下特异性引物序列：

上游引物：SEQ ID No.2

下游引物：SEQ ID No.3

(2)将人膀胱癌组织与癌旁组织按照SIGMA公司的TRIZOL试剂(货号T9424)所需试剂及步骤提取总RNA，再用7300real time PCR system核酸定量仪定量(AppliedBiosystems AB)定量所提取的RNA的纯度和浓度。

第一步打开RNA二级结构，反应体系及条件如下：

试剂

用量

Oligo dT	1ul
		RNA	1-2ug
DEPC水	补齐至20ul

将上述组分混合后70度反应5min然后冰浴10min

第二步反转录反应，反应体系及条件如下：

荧光定量PCR体系：

2.样品总RNA的提取：

(3)把上述匀浆转移到1.5ml无菌无酶离心管中，每1份匀浆中加入0.2ml氯仿。混匀后12000g离心10分钟。RNA在于上层水相中；

3.合成cDNA模板

取上述100例膀胱癌组织和100例癌旁组织的总RNA，采用北京康润诚业生物科技有限公司StarScript II One-step RT-PCR试剂盒(货号A215-01)对提取的总RNA反转录合成cDNA。

第一步打开RNA二级结构，反应体系及条件如下：

试剂	用量
		Oligo dT	1ul
RNA	1-2ug
		DEPC水	补齐至20ul

将上述组分混合后70度反应5min然后冰浴10min

第二步反转录反应，反应体系及条件如下：

4.荧光定量PCR检测lncRNA-AC1表达量

荧光定量PCR体系：

试剂	用量
		2*MIX	10ul
50*ROX	2ul
		引物	各1ul
DNA模板	1ul
		RNase Free d H2O	补齐至20ul

qRT-PCR检测膀胱癌组织样本中lncRNA-AC1的扩增曲线如图4所示。产物扩增曲线在反应的早期就可能被监测到，起始点表示产物聚集的对数期开始，该期产物的荧光信号呈指数增长，检测仪将此点定义为Ct值。根据Ct值可以预测靶基因产物的起始浓度，即在PCR反应条件相同的情况下，靶基因起始浓度越大，则Ct值就越低。我们将癌旁对照组均值的95％可信区间的上界(X±1.83SD)作为本诊断实验的Cut-off值，其值为3.918。在此分界值条件下，本诊断实验的灵敏度为92％，特异度为83％。

临床灵敏度可用来衡量某种试验检测出有病者的能力，灵敏度是将实际有病的人正确地判定为真阳性的比例。

本实验灵敏度＝92/(92+8)×％＝92％。

临床特异度是衡量试验正确地判定无病者的能力，特异度是将实际无病的人正确地判定为真阴性的比例。

本实验特异度＝83/(17+83)×％＝83％。

值得注意的是，由于RNA在细胞外环境中很不稳定，因此，它若存在于组织中，则强烈提示肿瘤存在于此处。LncRNA作为全新的长链非编码RNA，不仅能成为膀胱癌诊断的肿瘤标志物，而且有望成为膀胱癌治疗靶点，具有十分重要的科学意义和生理意义。

Claims

1.lncRNA-AC1用于制备诊断膀胱癌的诊断剂或试剂盒的用途，所述lncRNA-AC1的核酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种用于诊断膀胱癌的试剂盒，其中包括：

1)用于扩增lncRNA-AC1的特异性引物对；

2)标准DNA模板；

3)PCR反应液，

其中，所述lncRNA-AC1的核酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，所述特异性引物对包括上游引物和下游引物，其中上游引物序列为SEQ ID No.2，下游引物序列为SEQ ID No.3。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，所述试剂盒为荧光定量PCR检测试剂盒，所述引物适用于SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、复合探针的检测。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，所述试剂盒中的PCR反应液为荧光定量PCR反应液，并进一步包含荧光染料。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，所述荧光定量PCR反应液包括dNTP、Mg²⁺、Taq酶及缓冲液，所述荧光染料为SYBR Green II，Taq酶为热启动酶。

7.lncRNA-AC1用作膀胱癌药物筛选的靶点的用途，所述lncRNA-AC1的核酸序列如SEQID No.1所示。