CN101423873A - 环介导等温扩增检测人前列腺癌特异基因dd3pca3试剂盒 - Google Patents
环介导等温扩增检测人前列腺癌特异基因dd3pca3试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101423873A CN101423873A CNA2008102447226A CN200810244722A CN101423873A CN 101423873 A CN101423873 A CN 101423873A CN A2008102447226 A CNA2008102447226 A CN A2008102447226A CN 200810244722 A CN200810244722 A CN 200810244722A CN 101423873 A CN101423873 A CN 101423873A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequence
- primer
- pca3
- follows
- pair
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种定性检测前列腺癌特异基因DD3PCA3的试剂盒及检测方法，所述试剂盒包括以下试剂：引物、DNA聚合酶、逆转录酶、10倍LAMP反应缓冲液和显色剂、阳性对照、阴性对照；本发明采用LAMP法定性检测前列腺癌特异基因DD3PCA3，因而特异性、敏感性高于普通PCR；而且由于不需经3个温度重复，检测时间比PCR法短，逆转录反应和等温扩增反应可在同一反应管中同时进行，减少了操作步骤和反应时间；结果判断不需经电泳，特别适合临床单位用于快速定性。
Description
技术领域
本发明涉及一种定性检测基因的试剂盒及检测方法，具体涉及一种定性检测人前列腺癌特异基因DD3PCA3的试剂盒及检测方法。
背景技术
前列腺癌位(Pca)居西方国家男性癌症发病率的第二位，在我国及亚洲国家，前列腺癌的发病率近年也在明显增高，有统计说明，我国前列腺癌已居泌尿男生殖系统肿瘤的前三位，而且发病年龄也日趋年轻化，前列腺癌的早期治疗可能使患者获得治愈，所以早期诊断和治疗对愈后至关重要。
目前临床通过检测前列腺特异性抗原(PSA)，达到诊断前列腺癌的目的。但PSA为前列腺特异性抗原，而非前列腺癌特异性抗原，在前列腺增生症和前列腺炎等良性前列腺病变中亦可升高，且近来有研究发现PSA在前列腺以外的器官亦可能高表达，暴露出PSA在Pca诊断中的局限性。
因此，寻找更为敏感、特异的肿瘤标记物用于Pca的早期诊断和预后检测具十分重要的意义。
DD3PCA3是前列腺癌的特异性基因，在前列腺癌组织中高度表达，正常前列腺组织或者前列腺增生中无表达或低表达，其他肿瘤组织及器官中均无表达。核酸扩增(PCR)为基础的分子生物学技术的迅速发展，为DD3PCA3的检测提供了一种快速、灵敏的方法，但普通PCR假阳性太高，不适合临床使用。荧光定量PCR具有灵敏、准确的优点，但采用TaqMan探针法操作烦琐、费用较高。
环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)不需PCR经过的变性、复性、延伸三个阶段，可在等温条件下1小时内将目的序列扩增109倍以上，因此不需特殊设备，检测时间更短、敏感性更高；同时4条的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，特异性更高，因此在基因检测上明显优于PCR。
但在实际应用中，引物设计及实验条件优化比较烦琐，所以至今国内外尚未见有关LAMP检测前列腺癌特异基因DD3PCA3的文献和专利报道。
发明内容
本发明目的是解决环介导等温扩增检测前列腺癌特异基因DD3PCA3技术领域的难点，设计合适的引物和优化的测试条件，提供一种定性检测人前列腺癌特异基因DD3PCA3的试剂盒及检测方法，解决了普通PCR假阳性太高和荧光定量PCR存在的费用高的问题。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种环介导等温扩增检测人前列腺癌特异基因DD3PCA3的引物，其特征在于：由一对外引物和一对内引物组成，其序列分别如下所示：
外引物1具有序列表中SEQ ID NO.2所述的碱基序列，具体序列如下所示：AGTGACATGTTTTTGCACATT；
外引物2具有序列表中SEQ ID NO.3所述的碱基序列，具体序列如下所示：CATCCTTTAAGGAACACATCAA；
内引物1具有序列表中SEQ ID NO.4所述的碱基序列，具体序列如下所示：TCCCAGGGATCTCTGTGCTTCAGCCCCTTTAAATATCCAC；
内引物2具有序列表中SEQ ID NO.5所述的碱基序列，具体序列如下所示：CGCCATCTTGGGTCATCGATATGTCCTTCCCTCACAAG；
其中，所述的一对外引物与一对内引物的摩尔数之比为1：6～8。
设计的引物位于人DD3PCA3基因外显子3和外显子4a中，具有序列表中SEQ ID NO.1所述的碱基序列，具体序列为：
AGTGACATGTTTTTGCACATTTCCAGCCCCTTTAAATATCCACACACACAGGAAGCACAAAAGGAAGCACAGAGATCCCTGGGAGAAATGCCCGGCCGCCATCTTGGGTCATCGATGAGCCTCGCCCTGTGCCTGGTCCCGCTTGTGAGGGAAGGACATTAGAAAATGAATTGATGTGTTCCTTAAAGGATG。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种人前列腺癌特异基因DD3PCA3定性检测试剂盒，其特征在于：由一套引物、10倍环介导等温扩增反应缓冲液、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照、逆转录酶和显色剂组成；所述的一套引物是由一对外引物和一对内引物组成，其序列分别如下所示：
所述引物包括2条外引物和2条内引物，其序列分别如下：
外引物1具有序列表中SEQ ID NO.2所述的碱基序列，具体序列如下所示：AGTGACATGTTTTTGCACATT；
外引物2具有序列表中SEQ ID NO.3所述的碱基序列，具体序列如下所示：CATCCTTTAAGGAACACATCAA；
内引物1具有序列表中SEQ ID NO.4所述的碱基序列，具体序列如下所示：TCCCAGGGATCTCTGTGCTTCAGCCCCTTTAAATATCCAC；
内引物2具有序列表中SEQ ID NO.5所述的碱基序列，具体序列如下所示：CGCCATCTTGGGTCATCGATATGTCCTTCCCTCACAAG；
其中，所述的一对外引物与一对内引物的摩尔数之比为1：6～8；所述DNA聚合酶为具有链置换作用的Bst DNA聚合酶，活力为8个活性单位/微升；所述阳性对照为含人前列腺癌特异基因DD3PCA3cDNA的样品；阴性对照为双蒸水；所述逆转录酶采用鸟类成髓细胞白血病病毒逆转录酶，活力为10个活性单位/微升；所述显色剂为20×SYBR Green I。
1.上述技术方案中，所述10倍环介导等温扩增反应缓冲液(通常用“10×LAMP反应液”表示，数字10表示使用时稀释的倍数)由200mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCL)、100mM氯化钾(KCl)、100mM硫酸铵((NH4)2SO4)、40～100mM硫酸镁(MgSO4)、4～10M甜菜碱(Betaine)、5～10mM的dNTPs和1％的质量百分浓度的曲拉通X-100(Triton X-100)组成。
2.上述技术方案中，所述阳性对照的制备方法为：按常规的Trizol法由前列腺癌组织中提取RNA，逆转录成cDNA后，PCR法扩增包含等温扩增区的一段序列，具体序列如序列表中SEQ ID NO.1所述；扩增片段经测序鉴定后，装入T载体克隆后，抽提质粒DNA，测定DNA浓度，然后调整浓度为每微升106拷贝作为阳性对照。
3.上述技术方案中，所述的mM是摩尔浓度的单位，指的是每升溶液中所含有溶质的摩尔数。
4.上述技术方案中，所述的SYBR Green I为高灵敏度的DNA荧光染料，SYBR Green I与双链DNA的亲和力非常高。对分子生物学中常用的酶没有抑制作用。
一种检测人前列腺癌特异基因DD3PCA3的检测方法，具体包括以下步骤：
(1)常规方法提取组织、血液或尿液中的RNA；
(2)配置扩增体系，在每25μl扩增体系中，含外引物5pmol，内引物30～40pmol，10倍环介导等温扩增反应缓冲液2.5μl，步骤(1)中RNA提取液2～5μl，1μl的Bst酶，0.1μl鸟类成髓细胞白血病病毒逆转录酶，其余为水；60～65℃恒温反应1小时；
(3)反应结束后加1μl显色剂，于紫外灯下观察，颜色变为绿色说明检测结果阳性。
上述技术方案中，步骤(2)中RNA提取液的用量根据提取物来源不同而调整，具体调整方法为：组织来源的RNA提取物用1～2μl，血液、尿液等体液用4～5μl。
本发明工作原理是：环介导等温扩增反应过程是先由外引物扩增出内引物扩增所需要的模板，即起始反应物模板的合成；紧接着由内引物引导合成靶基因DNA片段，由于内引物扩增的DNA片段含有该引物5’端DNA片段的反向互补序列，因而这些反向互补序列之间通过杂交形成茎环结构另外一条内引物与其互补链退火杂交后引导链置换合成反应，在扩增的DNA片段的另外一端产生了新的茎环结构，形成哑铃状结构，在1小时内该循环反应可使靶DNA累积到109拷贝，电泳后可见扩增终产物由大小不等的DNA片段组成，呈梯状条带，也可通过荧光染料来观察扩增结果。LAMP的整个反应分三步完成，即起初反应物模板的合成、循环扩增阶段、延伸和再循环。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
1.本发明中采用LAMP法，环介导等温扩增利用Bst酶的链置换特性，设计4条引物，识别靶序列的6个区域，在等温条件下生成大量重复的茎环状结构，因而特异性、敏感性高于普通PCR；
2.本发明由于不需经3个温度重复，检测时间比PCR法短；
3.本发明中逆转录反应和等温扩增反应可在同一反应管中同时进行，减少了操作步骤和反应时间；
4.本发明的结果判断不需经电泳，特别适合临床单位用于快速定性，对于常规的定性检测，不需任何特殊设备，利用普通恒温水槽就可完成反应，手提紫外灯下甚至肉眼就可对结果作出判断。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
实施例一：一种环介导等温扩增检测前列腺癌组织标本DD3PCA3的方法，该方法
(1)肿瘤组织标本RNA提取
取100mg新鲜手术切除前列腺癌组织标本，液氮存在下于研钵中磨碎后，采用Trizol试剂提取总RNA，加25ul含焦磷酸二乙酯(DEPC)处理的水中保存。
(2)逆转录—环介导等温反应体系(检测管)
10×LAMP反应液 2.5μl
一对外引物 5pmol
一对内引物 30pmol
RNA提取液(检测物) 2μl
鸟类成髓细胞白血病病毒逆转录酶 0.1μl
Bst酶 1μl
DEPC处理的双蒸水 补至25μl
(3)同样成分比例配置阳性对照和阴性对照反应体系
阳性对照管
10×LAMP反应液 2.5μl
一对外引物 5pmol
一对内引物 30pmol
阳性对照cDNA溶液 1μl
鸟类成髓细胞白血病病毒逆转录酶0.1μl
Bst酶 1μl
DEPC处理的双蒸水 补至25μl
阴性对照管
10×LAMP反应液 2.5μl
一对外引物 5pmol
一对内引物 30pmol
阴性对照双蒸水 1μl
鸟类成髓细胞白血病病毒逆转录酶 0.1μl
Bst酶 1μl
DEPC处理的双蒸水 补至25μl
(4)恒温水浴中于63℃反应1小时。
(5)反应结束后分别中检测管，阳性对照管，阴性对照管中加1μl显色剂，于紫外灯下观察颜色变化，并与阳性和阴性对照比较，如检测管变为绿色说明检测结果阳性。
实施例二：
环介导等温扩增检测外周血标本DD3PCA3基因表达
(1)外周血标本RNA提取
抽取5ml静脉血用乙二胺四乙酸钠抗凝，于4℃用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，收集单个核细胞至1.5ml Eppendorf管中，采用Trizol试剂提取总RNA，加15ul含焦磷酸二乙酯(DEPC)处理的水中保存。
(2)逆转录—环介导等温反应体系(检测管)
10×LAMP反应液 2.5μl
一对外引物 5pmol
一对内引物 30pmol
RNA提取液(检测物) 4μl
鸟类成髓细胞白血病病毒逆转录酶 0.1μl
Bst酶 1μl
DEPC处理的双蒸水 补至25μl
(3)配置阳性对照和阴性对照反应体系
其他成分比例同检测管，但阳性对照为1μl cDNA，阴性对照为1μl双蒸水。
(4)恒温水浴中于63℃反应1小时。
(5)反应结束后分别中检测管，阳性对照管，阴性对照管中加1μl显色剂，于紫外灯下观察颜色变化，并与阳性和阴性对照比较，如检测管变为绿色说明检测结果阳性。
SEQUENCE LISTING
<110>苏州大学
<120>环介导等温扩增检测人前列腺癌特异基因DD3PCA3试剂盒
<160>5
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>192
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
<210>4
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
<210>5
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
Claims (4)
1.一种环介导等温扩增检测人前列腺癌特异基因DD3PCA3的引物，其特征在于：由一对外引物和一对内引物组成，其序列分别如下所示：
外引物1具有序列表中SEQ ID NO.2所述的碱基序列，具体序列如下所示：AGTGACATGTTTTTGCACATT；
外引物2具有序列表中SEQ ID NO.3所述的碱基序列，具体序列如下所示：CATCCTTTAAGGAACACATCAA；
内引物1具有序列表中SEQ ID NO.4所述的碱基序列，具体序列如下所示：TCCCAGGGATCTCTGTGCTTCAGCCCCTTTAAATATCCAC；
内引物2具有序列表中SEQ ID NO.5所述的碱基序列，具体序列如下所示：CGCCATCTTGGGTCATCGATATGTCCTTCCCTCACAAG；
其中，所述的一对外引物与一对内引物的摩尔数之比为1：6～8。
2.一种人前列腺癌特异基因DD3PCA3定性检测试剂盒，其特征在于：由一套引物、10倍环介导等温扩增反应缓冲液、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照、逆转录酶和显色剂组成；所述的一套引物是由一对外引物和一对内引物组成，其序列分别如下所示：
所述引物包括2条外引物和2条内引物，其序列分别如下：
外引物1具有序列表中SEQ ID NO.2所述的碱基序列，具体序列如下所示：AGTGACATGTTTTTGCACATT；
外引物2具有序列表中SEQ ID NO.3所述的碱基序列，具体序列如下所示：CATCCTTTAAGGAACACATCAA；
内引物1具有序列表中SEQ ID NO.4所述的碱基序列，具体序列如下所示：TCCCAGGGATCTCTGTGCTTCAGCCCCTTTAAATATCCAC；
内引物2具有序列表中SEQ ID NO.5所述的碱基序列，具体序列如下所示：CGCCATCTTGGGTCATCGATATGTCCTTCCCTCACAAG；
其中，所述的一对外引物与一对内引物的摩尔数之比为1：6～8；所述DNA聚合酶为具有链置换作用的Bst DNA聚合酶，活力为8个活性单位/微升；所述阳性对照为含人前列腺癌特异基因DD3PCA3cDNA的样品；阴性对照为双蒸水；所述逆转录酶采用鸟类成髓细胞白血病病毒逆转录酶，活力为10个活性单位/微升；所述显色剂为20×SYBR Green I。
3.根据权利要求2所述的人前列腺癌特异基因DD3PCA3定性检测试剂盒，其特征在于：所述10倍环介导等温扩增反应缓冲液由200mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、40～100mM硫酸镁、4～10M甜菜碱、5～10mM的dNTPs和1％的质量百分浓度的曲拉通X-100组成。
4.权利要求2所述试剂盒定性检测人前列腺癌特异基因DD3PCA3的检测方法，具体包括以下步骤：
(1)常规方法提取组织、血液或尿液中的RNA；
(2)配置扩增体系，在每25μl扩增体系中，含外引物5pmol，内引物30～40pmol，10倍环介导等温扩增反应缓冲液2.5μl，步骤(1)中RNA提取液2～5μl，1μl的Bst酶，0.1μl鸟类成髓细胞白血病病毒逆转录酶，其余为水；60～65℃恒温反应1小时；反应结束后加1μl显色剂，于紫外灯下观察，颜色变为绿色说明检测结果阳性。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2008102447226A CN101423873A (zh) | 2008-11-26 | 2008-11-26 | 环介导等温扩增检测人前列腺癌特异基因dd3pca3试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2008102447226A CN101423873A (zh) | 2008-11-26 | 2008-11-26 | 环介导等温扩增检测人前列腺癌特异基因dd3pca3试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101423873A true CN101423873A (zh) | 2009-05-06 |
Family
ID=40614754
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNA2008102447226A Pending CN101423873A (zh) | 2008-11-26 | 2008-11-26 | 环介导等温扩增检测人前列腺癌特异基因dd3pca3试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101423873A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103436594A (zh) * | 2012-10-16 | 2013-12-11 | 科蒂亚(新乡)生物技术有限公司 | 一种bdna在尿液中检测pca3的应用 |
| CN104531863A (zh) * | 2014-12-19 | 2015-04-22 | 钱学庆 | 一种人类尿液中pca3基因检测方法和引物 |
| CN104862309A (zh) * | 2015-04-22 | 2015-08-26 | 复旦大学 | 一种特异性检测肿瘤标志物mucin 1的LAMP方法 |
| CN105063230A (zh) * | 2015-09-15 | 2015-11-18 | 贾瑞鹏 | 一种检测人类前列腺癌特异性基因的环介导等温扩增试剂盒及其应用 |
-
2008
- 2008-11-26 CN CNA2008102447226A patent/CN101423873A/zh active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103436594A (zh) * | 2012-10-16 | 2013-12-11 | 科蒂亚(新乡)生物技术有限公司 | 一种bdna在尿液中检测pca3的应用 |
| CN104531863A (zh) * | 2014-12-19 | 2015-04-22 | 钱学庆 | 一种人类尿液中pca3基因检测方法和引物 |
| CN104862309A (zh) * | 2015-04-22 | 2015-08-26 | 复旦大学 | 一种特异性检测肿瘤标志物mucin 1的LAMP方法 |
| CN104862309B (zh) * | 2015-04-22 | 2018-08-07 | 复旦大学 | 一种特异性检测肿瘤标志物mucin 1的LAMP方法 |
| CN105063230A (zh) * | 2015-09-15 | 2015-11-18 | 贾瑞鹏 | 一种检测人类前列腺癌特异性基因的环介导等温扩增试剂盒及其应用 |
| CN105063230B (zh) * | 2015-09-15 | 2019-04-05 | 贾瑞鹏 | 一种检测人类前列腺癌特异性基因的环介导等温扩增试剂盒及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102367478B (zh) | 用于KRAS基因突变分型的ARMS-qPCR检测试剂盒及检测方法 | |
| JP6155194B2 (ja) | 良性甲状腺新生物と悪性甲状腺新生物を区別するためのバイオマーカーとしてのｍｉＲＮＡ | |
| CA2957396A1 (en) | Method of determining pik3ca mutational status in a sample | |
| CN104357443B (zh) | 一种用于膀胱癌筛查的长链非编码rna的检测及其应用 | |
| CN103710460A (zh) | 定量检测egfr基因突变的试剂盒及其用途 | |
| KR20130094342A (ko) | 인간 표피 성장 인자 수용체 유전자 내의 돌연변이를 탐지하기 위한 방법 및 조성물 | |
| CN106047989A (zh) | 一种环状rna在结直肠癌检验标志物中的应用 | |
| CN105802964B (zh) | 一种用于肝细胞癌筛查的cRNA-FUT8的检测及其应用 | |
| CN101423873A (zh) | 环介导等温扩增检测人前列腺癌特异基因dd3pca3试剂盒 | |
| US20180363065A1 (en) | Use of antisense long non-coding rnas for the diagnosis of prostate cancer | |
| CN107177676B (zh) | 长链非编码rna nonhsat113026用于肾癌诊断分子标志物的用途 | |
| WO2020084035A1 (en) | Use of long non-coding rna for the diagnosis of prostate cancer | |
| CN112813167B (zh) | 标志物linc01977及其应用 | |
| CN102021228B (zh) | 用于组织或全血egfr基因突变检测的特异性引物 | |
| WO2015115544A1 (ja) | 大腸がんの転移又は再発リスクの評価方法 | |
| CN101671728B (zh) | 一种检测癌胚抗原mRNA表达量的方法及专用试剂盒 | |
| CN105969874B (zh) | 用于检测微量组织中kras基因突变的引物组合及其应用 | |
| CN109652539A (zh) | 一种针对egfr t790m位点突变进行检测的试剂盒 | |
| KR102005146B1 (ko) | 악성중피종 진단용 바이오마커 및 이의 용도 | |
| CN107604068A (zh) | 一种利用长链非编码rna检测膀胱癌的试剂盒 | |
| CN112646892B (zh) | 一组乳腺癌早期诊断的piRNA生物标志物及其应用 | |
| CN109517894B (zh) | 一种与肝癌相关的非编码rna生物标志物及其应用 | |
| JP2013085542A (ja) | 胃癌の検出方法、胃癌の血液マーカーおよびその使用 | |
| KR102546809B1 (ko) | 자궁경부암의 급성 종양 반응 진단을 위한 정보 제공 방법 | |
| CN116121245B (zh) | 小分子rna及其在子宫内膜异位症早期诊断中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Open date: 20090506 |