CN107177676B - 长链非编码rna nonhsat113026用于肾癌诊断分子标志物的用途 - Google Patents

长链非编码rna nonhsat113026用于肾癌诊断分子标志物的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了长链非编码RNA NONHSAT113026(LncRNA NONHSAT113026)用于肾癌诊断分子标记物的用途，所述LncRNA NONHSAT113026的核酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明的有益效果为：在目前肾癌的诊断仍缺乏可信度及特异性高的分子标记物的情况下，本发明提供的LncRNA NONHSAT113026可用于肾癌诊断分子标记物的用途，长链非编码RNA调控机制是肿瘤发病机理研究中的一个新领域，LncRNA NONHSAT113026在不同病理学亚型的肾癌组织和癌旁组织中均有表达，且在癌组织中的表达水平均显著低于癌旁组织，差异具有统计学意义，提示LncRNA NONHSAT113026作为肾癌诊断分子标志物的可行性及临床应用价值。

Description

长链非编码RNA NONHSAT113026用于肾癌诊断分子标志物的 用途
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及长链非编码RNA NONHSAT113026(LncRNA NONHSAT113026)用于肾癌诊断分子标志物的用途。
背景技术
肾细胞癌是来源于肾小管上皮的恶性肿瘤，可分为肾透明细胞癌、乳头状肾细胞癌和嫌色细胞肾细胞癌，其中肾透明细胞癌占85～95％。肾癌发病隐匿，临床表现不典型，要依赖影像学检查才能发现，初期诊断率并不高，大约有30％的患者在诊断时已发生转移，失去了手术时机。目前临床上肾癌的早期诊断仍缺乏特异性标志物。本发现对提高肾细胞癌的诊断率和生存率，寻找高灵敏度和高特异性的肾癌诊断分子标记物有重大的临床意义。
人类基因组中仅有约2％的基因编码蛋白质，大部分基因转录形成非编码的RNA(ncRNAs)。其中长链非编码RNA(LncRNAs)是一类长度大于200个核苷酸、缺少特异完整开放阅读框、无蛋白质编码功能的RNA。LncRNA参与了基因组印记、转录控制、转录后调控、蛋白功能调节等信号转导过程中的重要环节。目前，研究发现了多种与肿瘤发生发展相关的LncRNA。2012年8月28日《Genome Biology》报道，斯坦福大学医学院研究人员进行首次大型的癌症1ncRNA表达谱分析，对64个肿瘤样品高通量RNA-seq测序，在各种肿瘤类型之间找出差异表达的1065组LncRNA。这表明LncRNA的表达紊乱与人类的病理学进程，特别是癌变过程直接相关。因此LncRNA被寄望成为肿瘤治疗的重要分子靶点，解读LncRNA在肿瘤发生中的作用机制将是肿瘤研究中的新突破口。
发明内容
本发明的目的就是针对目前临床上，肾癌的检测仍缺乏高灵敏度和高特异性的早期诊断指标，由此提供了LncRNA NONHSAT113026用于作为肾癌诊断标志物的用途。
前期研究中，专利申请人采用全基因组表达谱芯片筛选技术发现了大量的肾癌相关差异表达基因，结果已发表在SCI杂志Medicine(2016,95(2):e2507)上。经PCR方法检测发现，与癌旁组织比较，所有肾癌组织中LncRNA NONHSAT113026(序列号：NONHSAG043886)表达水平显著降低。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：LncRNA NONHSAT113026用于作为肾癌诊断标志物的用途，所述长链非编码RNA NONHSAT113026的核酸序列如SEQ ID No.1所示。
长链非编码RNA NONHSAT113026的核酸序列为：
ATATATAAAATAAAATCACTGCTCAGCAGTAGTCAGTTTATAAACCAGAATCCATGAGACTGAGTTCTATTTCTTGTGCAGACTGCAACAGCCTGAATGGAGTCCTGCAGTGTACCTGTGAAGACAGCTACACCTGGTTTCCTCCCTCATGCCTTGATCCCCAGAACTGCTACCTTCACACGGCTGGAGCACTCCCAAGCTGTGAATGTCATCTCAACAACCTCAGCCAGAGTGTCAATTTCTGTGAGAGAACAAAGATTTGGGGCACTTTCAAAATTAATGAAAGGTTTACAAATGACCTTTTGAATTCATCTTCTGCTATATACTCCAAATATGCAAATGGAATTGAAATTCAACTTAAAAAAGCATATGAAAGAATTCAAGGTTTTGAGTCGGTTCAGGTCACCCAATTTCGAAATGGAAGCATCGTTGCTGGGTATGAAGTTGTTGGCTCCAGCAGTGCATCTGAACTGCTG TCAGCCATTGAACATGTTGCCGAGAAGGCTAAGACAGCCCTTCACAAGCTGTTTCCATTAGAAGACGGCTCTTTCAGAGTGTTCGGAAAAG。
本发明的第二个目的是提供了检测肾癌组织中LncRNA NONHSAT113026表达水平的检测方法，所述的检测方法为荧光定量聚合酶链式反应qRT-PCR，该检测方法所需材料包括：
1)用于扩增LncRNA NONHSAT113026的特异性引物对，所述LncRNA NONHSAT113026的核酸序列如SEQ ID No.1所示；
2)标准DNA模板；
3)PCR反应液。
LncRNA NONHSAT113026扩增所使用的特异性引物对包括上游引物和下游引物，其中上游引物序列为SEQ ID No.2(5’-TACACCTGGTTTCCTCCCTCAT-3’)，下游引物序列为SEQID No.3(5’-AAAGTGCCCCAAATCTTTGTTC-3’)。
LncRNA NONHSAT113026的检测方法为荧光定量PCR法。
本发明的有益效果为：本发明提供的长链非编码RNA NONHSAT113026可用作肾癌诊断分子标记物，达到肾癌早诊断、早治疗的用途。长链非编码RNA调控机制是肿瘤发病机理研究中的一个新领域，LncRNA NONHSAT113026在不同病理学亚型的肾癌组织和癌旁组织中均有表达，且在癌组织中的表达水平均显著低于癌旁组织，差异具有统计学意义，提示LncRNA NONHSAT113026作为肾癌诊断分子标志物的可行性及临床应用价值。LncRNANONHSAT113026在肾癌不同组织学亚型中的检测结果如下：肾透明细胞癌中，p<0.0001；肾乳头状细胞癌中，p<0.0001；肾嫌色细胞癌中，p＝0.0004。
附图说明
图1显示为NONHSAT113026在肾透明细胞癌组织及对应癌旁组织中的表达。
图2显示为NONHSAT113026在肾嫌色细胞癌组织及对应癌旁组织中的表达。
图3显示为NONHSAT113026在肾乳头状细胞癌组织及对应癌旁组织中的表达。
具体实施方式
实施例1：
1、样品来源：
收集2012年1月至2017年1月在新疆医科大学附属肿瘤医院行根治性肾切除术的病例，排除有双重癌的患者。病人术前均未接受放化疗及生物治疗，随机选取83例肾透明细胞癌、10例肾嫌色细胞癌、10例肾乳头状细胞癌的癌组织及对应癌旁组织，所有病例的病理诊断均由两位经验丰富的病理科医生核实其诊断。所有标本常规取材，新鲜组织立即置液氮中，24小时后转移至-80℃冰箱保存备用。
2、RNA提取及逆转录：
Trizol法分别提取肾癌组织及癌旁组织的总RNA。利用宝生物逆转录试剂盒进行RNA的逆转录反应。逆转录体系为10μl：5×PrimeScriptTM Buffer 2μl，PrimeScript RTEnzyme 0.5μl，Random 6mers 0.5μl，Total RNA 2μl，RNase Free ddH2O 5μl。循环体系为：37℃15min，85℃5sec，4℃。
3、荧光定量PCR：
通过荧光定量PCR方法检测组织中LncRNA NONHSAT113026的表达水平。利用lifeSYBR GREEN试剂盒进行逆转录产物的荧光定量PCR。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计并合成，荧光定量PCR引物序列如表1所示。荧光定量体系为20μl：2×SYBRGREEN Mix 10μl，F primer 0.5μl，R primer 0.5μl，cDNAμl，ddH2O 7μl。PCR循环为：50℃2min，95℃2min，95℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，循环数为40。荧光定量PCR相对定量内参基因为GAPDH。如图1-图3所示，以2-ΔCt表示癌组织和癌旁组织中LncRNANONHSAT113026的表达量，不同病理学亚型的肾癌与癌旁组织中LncRNA NONHSAT113026的表达水平差异分析采用配对t检验。NONHSAT113026在不同病理亚型的肾癌组织与相应癌旁组织中表达水平的差异如表2所示。
表1引物序列：
引物名称 引物序列(5’-3’)
GAPDH F TGACTTCAACAGCAGCACCCA
GAPDH R CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA
NONHSAT113026F TACACCTGGTTTCCTCCCTCAT
NONHSAT113026R AAAGTGCCCCAAATCTTTGTTC
表2 LncRNA NONHSAT113026在肾癌及癌旁组织中的表达水平差异：
Figure BDA0001314031210000051
本发明的技术关键点和欲保护点：
通过qRT-PCR检测，发现在不同肾癌病理学亚型中，LncRNA NONHSAT113026在癌组织的表达水平均显著低于癌旁组织，提示NONHSAT113026作为肾癌诊断分子标志物的可行性及临床应用价值。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
<110> 柳惠斌
<120> 长链非编码RNA NONHSAT113026用于肾癌诊断分子标志物的用途
<210> 1
<211> 567
<212> DNA
<213> 长链非编码RNA NONHSAT113026的核酸序列
<400> 1
atatataaaa taaaatcact gctcagcagt agtcagttta taaaccagaa tccatgagac 60
tgagttctat ttcttgtgca gactgcaaca gcctgaatgg agtcctgcag tgtacctgtg 120
aagacagcta cacctggttt cctccctcat gccttgatcc ccagaactgc taccttcaca 180
cggctggagc actcccaagc tgtgaatgtc atctcaacaa cctcagccag agtgtcaatt 240
tctgtgagag aacaaagatt tggggcactt tcaaaattaa tgaaaggttt acaaatgacc 300
ttttgaattc atcttctgct atatactcca aatatgcaaa tggaattgaa attcaactta 360
aaaaagcata tgaaagaatt caaggttttg agtcggttca ggtcacccaa tttcgaaatg 420
gaagcatcgt tgctgggtat gaagttgttg gctccagcag tgcatctgaa ctgctgtcag 480
ccattgaaca tgttgccgag aaggctaaga cagcccttca caagctgttt ccattagaag 540
acggctcttt cagagtgttc ggaaaag 567
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 上游引物序列
<400> 2
tacacctggt ttcctccctc at 22
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 下游引物序列
<400> 3
aaagtgcccc aaatctttgt tc 22

Claims (3)

1.长链非编码RNA NONHSAT113026在制备肾癌诊断分子标记物中的应用，其特征在于，所述长链非编码RNA NONHSAT113026的核酸序列如SEQ ID No.1所示；所述肾癌为肾嫌色细胞癌或肾乳头状细胞癌。
2.检测肾癌组织中LncRNA NONHSAT113026表达水平的检测试剂在制备肾癌诊断试剂中的用途，其特征在于，检测试剂的检测方法为荧光定量聚合酶链式反应qRT-PCR，该检测试剂所需材料包括：
1)用于扩增LncRNA NONHSAT113026的特异性引物对，所述LncRNA NONHSAT113026的核酸序列如SEQ ID No.1所示；
2)标准DNA模板；
3)PCR反应液；
所述肾癌为肾嫌色细胞癌或肾乳头状细胞癌。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述特异性引物对包括上游引物和下游引物，其中上游引物序列为SEQ ID No.2，下游引物序列为SEQ ID No.3。
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