CN108796086A - 一种环状RNAcircBCBM1及其非诊断性荧光定量检测方法 - Google Patents

一种环状RNAcircBCBM1及其非诊断性荧光定量检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种环状RNA circBCBM1及其在PCR扩增时，环状RNA circBCBM1的引物等；该环状RNA在乳腺癌脑转移细胞中高表达，在其他乳腺癌细胞及正常细胞中低表达，其亚细胞定位在细胞核；本发明的环状RNA circBCBM1填补了目前缺乏乳腺癌脑转移相关环状RNA的空白，本发明的环状RNA circBCBM1在乳腺癌脑转移风险预测及临床诊断分子标志物方面和乳腺癌脑转移新型药物研发的靶点方面均具有广泛的应用空间。

Description

一种环状RNAcircBCBM1及其非诊断性荧光定量检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体说是一种环状RNA circBCBM1及其非诊断性荧光定量检测方法。
背景技术
肿瘤脑转移发病率占9％-17％，其导致的死亡率占20％。乳腺癌仅次于肺癌是引发脑转移的第二位实体恶性肿瘤。约25％的晚期乳腺癌患者最终发展为脑转移。乳腺癌脑转移(breast cancer brain metastases，BCBM)严重影响患者的认知、言语、动作协调性及生活质量。乳腺癌脑转移致死率高、预后极差，患者的中位生存期仅为6个月，1年存活率低于20％。
circRNA是一类新型的ncRNA，是由特殊的末端反向互补的前体mRNA经过可变剪切并首尾环化形成，不具备5’→3’极性及3’poly A末端，表现出与线性RNA不同的特性。circRNA的主要特点：呈封闭环状结构，不易被RNase R降解，比线性RNA更稳定；具有丰富的多样性；大多数来源于外显子，少部分由内含子直接环化形成；具有时空特异性；多数为内源性，少数外源性；具有高度保守性，部分具有快速的进化性改变。circRNA由于其表达的时空特异性、调控的复杂性及其在疾病发生中的重要作用越来越受到大家的重视，逐渐成为ncRNA领域的一个新的研究热点。
目前，还没有乳腺癌脑转移相关circRNA的报道，在该领域需要进行更深入的研究。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是提供一种环状RNA circBCBM1及其非诊断性荧光定量检测方法。
本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：
一种环状RNA circBCBM1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
SEQ ID NO:1：
优选的，PCR扩增时，环状RNA circBCBM1的引物为：
上游引物：ctgggccact gatgactcct
下游引物：tcctggacac ggtagctcca。
优选的，环状RNA circBCBM1在乳腺癌脑转移细胞中高表达，在其他乳腺癌细胞及正常细胞中低表达，并且亚细胞定位在细胞核。
本发明还包括环状RNA circBCBM1在乳腺癌脑转移中的非诊断性荧光定量检测方法，该荧光定量检测方法包括以下步骤：
①RNA提取及逆转录：分别培养231-BR细胞，乳腺癌细胞BT-474、T47D、MCF7和人胚胎肾细胞293T，然后分别使用TRIzol提取细胞总RNA，逆转录为cDNA；
②采用实时荧光定量PCR检测步骤①的不同细胞中的circBCBM1的表达水平，GAPDH作为内参基因，具体扩增体系如下：
cDNA 2μl，2×TB Green Premix Ex Taq II 10μl，上游引物(10μM)0.8μl，下游引物(10μM)0.8μl，ROX 0.4μl，ddH2O调整总体积至20μl；
扩增条件：95℃30s；95℃5s，60℃34s，40个循环。
本发明还包括环状RNA circBCBM1的用途，在作为乳腺癌脑转移风险预测及临床诊断分子标志物方面的应用。
本发明还包括环状RNA circBCBM1的用途，在作为乳腺癌脑转移新型药物研发的靶点方面的应用。
本发明相比现有技术具有以下优点：
本发明所述的RNA circBCBM1及其在乳腺癌脑转移中非诊断性荧光定量检测方法填补了目前缺乏乳腺癌脑转移相关circRNA的空白，RNA circBCBM1是一种新型的环状RNA，本发明的RNA circBCBM1具有成环特性，强稳定性，亚细胞定位在细胞核中，并且在乳腺癌脑转移细胞中高表达，在其他乳腺癌细胞及正常细胞中低表达，本发明的RNA circBCBM1在乳腺癌脑转移风险预测及临床诊断分子标志物方面和乳腺癌脑转移新型药物研发的靶点方面均具有广泛的应用空间。
附图说明
图1为琼脂糖凝胶电泳检测环状RNA circBCBM1及其线性转录本以基因组DNA(gDNA)及cDNA为模板的扩增结果图。
图2为实时荧光定量PCR检测circBCBM1在231-BR细胞质及细胞核的相对表达水平结果图；
图3为实时荧光定量PCR检测RNase R处理后circBCBM1及其线性转录本相对表达水平的变化图；
图4为实时荧光定量PCR检测circBCBM1在乳腺癌脑转移细胞系231-BR及其他乳腺癌和正常细胞系相对表达水平图。
具体实施方式
本发明的目的是提供一种环状RNA circBCBM1及其应用，通过以下技术方案实现：
一种环状RNA circBCBM1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
SEQ ID NO:1：
其在circBase ID为has_circ_0000732，长度为269bp，对应亲本基因位于chr17:1540002-1540356；
优选的，PCR扩增时，环状RNA circBCBM1的引物为：
上游引物：ctgggccact gatgactcct
下游引物：tcctggacac ggtagctcca。
优选的，环状RNA circBCBM1在乳腺癌脑转移细胞中高表达，在其他乳腺癌细胞及正常细胞中低表达，并且亚细胞定位在细胞核。
本发明还包括环状RNA circBCBM1在乳腺癌脑转移中的非诊断性荧光定量检测方法，该荧光定量检测方法包括以下步骤：
①RNA提取及逆转录：分别培养231-BR细胞，乳腺癌细胞BT-474、T47D、MCF7和人胚胎肾细胞293T，然后分别使用TRIzol提取细胞总RNA，逆转录为cDNA；
②采用实时荧光定量PCR检测步骤①的不同细胞中的circBCBM1的表达水平，GAPDH作为内参基因，具体扩增体系如下：
cDNA 2μl，2×TB Green Premix Ex Taq II 10μl，上游引物(10μM)0.8μl，下游引物(10μM)0.8μl，ROX 0.4μl，ddH2O调整总体积至20μl；
扩增条件：95℃30s；95℃5s，60℃34s，40个循环。
本发明还包括环状RNA circBCBM1的用途，在作为乳腺癌脑转移风险预测及临床诊断分子标志物方面的应用。
本发明还包括环状RNA circBCBM1的用途，在作为乳腺癌脑转移新型药物研发的靶点方面的应用。
以下结合具体实施例来对本发明作进一步的描述。
本发明实施例中材料和试剂的来源：
材料来源：
1.细胞株：乳腺癌脑转移细胞系231-BR和乳腺癌亲代细胞系MDA-MB-231由美国国立卫生研究院(NIH)国家癌症研究所惠赠。乳腺癌细胞系BT-474、T47D、MCF7和人胚胎肾细胞系293T购自中国科学院细胞库。
2.引物：本发明所有引物均在生工生物(上海)股份有限公司合成。
试剂来源：
1.DNA及RNA提取、逆转录及PCR试剂：DNA提取试剂盒购自Qiagene公司，RNA提取TRIzol购自ThermoFisher公司，逆转录及实时荧光定量PCR试剂购自TAKARA公司。
2.其他试剂：细胞质及细胞核分离试剂盒NE-PER购自ThermoFisher公司，RNase R试剂盒购自Epicentre公司。
主要试剂配方
50×TAE配方：每升含Tris 242g，EDTA 18.612g，冰乙酸57.1mL，pH为8.3，室温贮存。
1.5％琼脂糖：1.5g琼脂糖溶解于100mL 1×TAE。
实施例1
环状RNA circBCBM1的成环特性：
①引物设计及合成：设计针对circBCBM1跨剪接位点的反向特异性引物，上游引物为ctgggccact gatgactcct，下游引物为tcctggacac ggtagctcca；设计circBCBM1对应的线性转录本引物，上游引物为tggagctacc gtgtccagga tg，下游引物为gcggctcgatgaagctgtgg；设计内参基因GAPDH的引物，上游引物为tgagaacggg aagcttgtca，下游引物为atcgccccac ttgattttgg；
②DNA及RNA提取和逆转录：培养231-BR细胞，提取细胞全基因组DNA(gDNA)，使用TRIzol提取细胞总RNA，总RNA逆转录为cDNA；
其中RNA的提取可按以下步骤进行：
⑴在细胞培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积加1ml，用移液器吸打几次，室温(15～30℃)放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离；
⑵每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟；
⑶4℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层；RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60％；
⑷把水相转移到新管中，用异丙醇沉淀水相中的RNA，每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟；
⑸4℃10000×g离心10分钟，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀；移去上清；⑹用75％乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75％乙醇；4℃7500×g离心5分钟，弃上清；
⑺室温放置干燥RNA沉淀，加入50μl无RNase的水，用枪头吸打几次，55℃放置5分钟使RNA溶解。-80℃保存；
⑻使用NanoDrop 2000紫外-可见分光光度计检测RNA浓度和纯度。
其中RNA的逆转录可按以下步骤进行：
逆转录反应使用TAKARA公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit试剂盒；
首先，按下列组份配制RT反应液(反应液配制在冰上进行)。
试剂 使用量 终浓度
5×PrimeScript Buffer 2μl 1×
PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5μl 25pmol
Random 6mers(100μM) 0.5μl 50pmol
Total RNA
RNase Free dH2O 至10μl
注：10μl反应体系可最大使用500ng的Total RNA。
其次，逆转录反应在Applied Biosystems Veriti PCR仪进行，条件如下:37℃15分钟(逆转录反应)；85℃5秒(逆转录酶的失活反应)；4℃保存；
③PCR扩增：扩增体系2μl cDNA，10μl 2×master mix，0.8μl上游引物(10μM)，0.8μl下游引物(10μM)，ddH2O调整总体积至20μl；扩增条件95℃30s；95℃5s，60℃34s，30个循环；
④琼脂糖凝胶电泳：1.5％琼脂糖稳压100V 15min，琼脂糖凝胶成像，结果如图1所示，其中M表示marker，泳道1和4为circBCBM1，泳道2和5为circBCBM1对应的线性转录本，泳道3和6为内参基因GAPDH；由图1可以看出，仅针对环状circBCBM1的反向引物仅能在cDNA中检测到而不能在gDNA检测到，而线性引物可以在cDNA中和gDNA中检测到，说明环状circBCBM1在231-BR细胞中存在，且circBCBM1具有成环特性。
实施例2
环状RNA circBCBM1的稳定性：
①RNA提取、处理及逆转录：培养231-BR细胞，使用TRIzol提取细胞总RNA。RNase R处理组2μg RNA加入3U RNase R，对照组加入等体积DEPC水，37℃处理30min；纯化RNA，进行逆转录；
其中RNA的提取和逆转录过程同实施例1；
②实时荧光定量PCR扩增：反应在Applied Biosystems 7500Real-Time PCR仪上进行；
首先，按下列组份配制PCR反应液(反应液配制在冰上进行)
试剂 使用量 终浓度
TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×) 10μl 1×
PCR Forward Primer(10μM) 0.8μl 0.4μM
PCR Reverse Primer(10μM) 0.8μl 0.4μM
ROX Reference Dye or Dye II(50×) 0.4μl 1×
RT反应液(cDNA 溶液) 2μl
灭菌水 6μl
Total 20μl
其次，Real-Time PCR扩增程序
反应条件：95℃30秒预变性；95℃5秒，60℃34秒，40个循环。
实时荧光定量PCR的检测结果如图2所示，经RNase R处理后circBCBM1相对表达水平下降少，而circBCBM1对应线性RNA相对表达水平下降多，说明circBCBM1更能耐受RNaseR的消化，进一步证实了circBCBM1的存在及稳定性。
实施例3
环状RNA circBCBM1的亚细胞定位：
采用实时荧光定量PCR检测环状RNA circBCBM1的亚细胞定位。利用NE-PER试剂盒分离细胞质和细胞核，使用TRIzol分别提取细胞质和细胞核中的总RNA，逆转录后通过实时荧光定量PCR检测细胞质和细胞核中circBCBM1的表达水平，其中RNA的提取和逆转录过程同实施例1，实时荧光定量PCR的反应体系和条件参照实施例2，GAPDH作为内参基因。
结果如图3所示，circBCBM1在细胞核中相对表达水平是细胞质的7.16倍，说明circBCBM1的亚细胞定位主要在细胞核。
实施例4
环状RNA circBCBM1的在乳腺癌脑转移细胞及其他乳腺癌和正常细胞差异表达：
采用实时荧光定量PCR检测环状RNA circBCBM1在乳腺癌脑转移细胞及其他乳腺癌和正常细胞差异表达水平。分别提取乳腺癌脑转移细胞231-BR，乳腺癌细胞BT-474、T47D、MCF7和人胚胎肾细胞293T的总RNA，逆转录后通过实时荧光定量PCR检测不同细胞中circBCBM1的表达水平。具体的操作步骤为：
①RNA提取及逆转录：分别培养231-BR细胞，乳腺癌细胞BT-474、T47D、MCF7和人胚胎肾细胞293T，然后分别使用TRIzol提取细胞总RNA，逆转录为cDNA；
其中RNA的提取和逆转录过程同实施例1；
②采用实时荧光定量PCR检测步骤①的不同细胞中的circBCBM1的表达水平，GAPDH作为内参基因，PCR检测仪和实时荧光定量PCR的反应液及反应条件同实施例2；
结果如图4所示，相对于乳腺癌脑转移细胞，circBCBM1在乳腺癌细胞BT-474、T47D、MCF7和人胚胎肾细胞293T细胞中相对表达水平低，差异具有统计学意义(p<0.001)。这说明circBCBM1在乳腺癌脑转移细胞中高表达，提示circBCBM1可作为乳腺癌脑转移的风险预测及临床诊断分子标志物，也可以作为乳腺癌脑转移新型药物研发的靶点。
序列表
<110> 聊城人民医院
<120> 一种环状RNAcircBCBM1及其非诊断性荧光定量检测方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 269
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
gccagcgaga gatggagcta ccgtgtccag gatgaagctg caggtctggg ggacactgac 60
cagcttgggc tccacgctgc cctgccgttc cctcagctcc cacaagctac cctgggtgac 120
agtctcacat cacgacccgg aggtcccctt caaccacagc ttcatcgagc cgccctctgc 180
cggctgggcc actgatgact ccttctcatc cgatcctgag tctggagagg cagatgaggt 240
tcctgcctac tgtgtgccac cccaagaag 269

Claims (6)

1.一种环状RNA circBCBM1，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的一种环状RNA circBCBM1，其特征在于：PCR扩增时，环状RNAcircBCBM1的引物为：
上游引物：ctgggccact gatgactcct
下游引物：tcctggacac ggtagctcca。
3.根据权利要求1所述的一种环状RNA circBCBM1，其特征在于：环状RNA circBCBM1在乳腺癌脑转移细胞中高表达，在其他乳腺癌细胞及正常细胞中低表达，并且亚细胞定位在细胞核。
4.环状RNA circBCBM1在乳腺癌脑转移中的非诊断性荧光定量检测方法，其特征在于，该荧光定量检测方法包括以下步骤：
①RNA提取及逆转录：分别培养231-BR细胞，乳腺癌细胞BT-474、T47D、MCF7和人胚胎肾细胞293T，然后分别使用TRIzol提取细胞总RNA，逆转录为cDNA；
②采用实时荧光定量PCR检测步骤①的不同细胞中的circBCBM1的表达水平，GAPDH作为内参基因，具体扩增体系如下：
cDNA 2μl， 2×TB Green Premix Ex Taq II 10μl，上游引物 (10μM) 0.8μl，下游引物(10μM) 0.8μl，ROX 0.4μl，ddH2O调整总体积至20μl；
扩增条件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40个循环。
5.环状RNA circBCBM1的用途，其特征在于，在作为乳腺癌脑转移风险预测及临床诊断分子标志物方面的应用。
6.环状RNA circBCBM1的用途，其特征在于，在作为乳腺癌脑转移新型药物研发的靶点方面的应用。
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