CN109295218A

CN109295218A - 环状RNA标志物hsa_circ_0001788及其应用

Info

Publication number: CN109295218A
Application number: CN201811508733.0A
Authority: CN
Inventors: 顾爱华; 王刚; 颜青; 徐进; 翁振坤; 刘倩
Original assignee: Nanjing Medical University
Current assignee: Nanjing University; Nanjing Medical University
Priority date: 2018-12-11
Filing date: 2018-12-11
Publication date: 2019-02-01
Anticipated expiration: 2038-12-11
Also published as: CN109295218B

Abstract

本发明建立颅缝早闭患者circRNA表达谱，提供颅缝早闭患者血清circRNA标志物hsa_circ_0001788，揭示血清中hsa_circ_0001788对颅缝早闭的诊断价值，用于制备颅缝早闭患者诊断试剂盒，为临床上颅缝早闭患者的早期发现和治疗提供支持。血清circRNA具有稳定性好，不易降解等优点，有较高的辅助诊断价值，利于临床推广使用。本发明人采用circRNA芯片检测，以获取疾病特异和异常表达的血清circRNA表达谱，并应用qRT‑PCR的方法进行验证，具有严密的设计和评价体系。首次发现血清中hsa_circ_0001788作为一个重要的生物学检测指标，检测指标微创廉价，可应用于临床检测，在颅缝早闭临床的早期诊断、鉴别诊断具有重要作用，本发明也从分子水平上为颅缝早闭的诊断提供新的思路，有望提高颅缝早闭的早期诊断率。

Description

环状RNA标志物hsa_circ_0001788及其应用

技术领域

本发明属于生物技术、预防医学和临床医学领域，公开了一种与颅缝早闭辅助诊断相关的circRNA标志物及其应用，具体的，为环状RNA标志物hsa_circ_0001788及其应用。

背景技术

颅缝早闭是一种常见的颅额面畸形，其发病率约为1/2500，居先天性颅面骨畸形发病率的第二位。其特征是在大脑发育完成前，存在一条或多条骨缝的过早融合，导致颅骨、大脑、面部和中枢神经系统发育受限。该疾病将对患者样貌产生严重影响，部分情况下，狭小的颅腔可阻碍脑组织发育，造成智力、运动发育落后。目前，颅缝早闭的诊断主要依据头型异常及3D颅骨CT三维重建，但由于颅缝早闭临床上的高度异质性且表型重叠，很难在早期准确诊断。因此，寻找特异强、灵敏度高、取材方便、不易降解的颅缝早闭诊断生物标志物显得尤为重要。

环状RNA(circular RNA，circRNA)是近年来新发现的一类特殊的非编码RNA分子。与传统的线性RNA不同，circRNA分子呈封闭环状结构，能够通过多种机制影响生物学功能，参与疾病的发生发展。circRNA在血清中可长期稳定存在，RNA酶降解作用、煮沸、反复冻融、酸碱环境、长期保存等各种处理方法均不会对circRNA造成影响。目前，国内外学者在多种疾病患者的血清中检测出表达异常的circRNAs，但有关颅缝早闭相关的circRNA研究报道较少。若能筛选出颅缝早闭特异性异常表达的circRNA，并研制出相应的早期辅助诊断试剂盒，对提高我国颅缝早闭诊断水平将是一次强有力的推动。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供颅缝早闭患者血清circRNA标志物，建立颅缝早闭患者circRNA表达谱，揭示血清中circRNA对颅缝早闭的诊断价值，为临床上颅缝早闭患者的早期发现和治疗提供支持。

本发明具体技术方案如下：

本发明的第一个目的是提供一种用于颅缝早闭诊断的血清circRNA标志物，所述标志物为hsa_circ_0001788，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示：

GAUCUCCCAGCCAUCCAGCCCCGGCUAGUGGCGGUCAGCAAAACCAAACCUGCAGACAUGGUGAUCGAGGCCUAUGGACAUGGGCAGCGCACUUUUGGCGAGAACUACGUUCAGGAACUGCUAGAAAAAGCAUCAAAUCCCAAAAUUCUGUCUUUGUGUCCUGAGAUCAAAUGGCACUUCAUUGGCCACCUACAGAAACAAAAUGUCAACAAAUUGAUGG

SEQ ID No.1所示序列中任意的U均可被T替代。

本发明的第二个目的是提供前述的血清circRNA标志物在制备辅助诊断颅缝早闭试剂盒中的应用。

本发明的第三个目的是提供前述的血清circRNA标志物检测及表达谱的建立方法，包括以下步骤：

(1)采用Trizol LS试剂盒提取颅缝早闭患者与对照人群外周血清中总RNA，利用高通量检测手段，建立外周血血清circRNAs表达谱，筛选出候选的差异表达的circRNA，即hsa_circ_0001788；

(2)采用qRT-PCR方法，扩大样本量，对步骤(1)选出候选的差异表达的circRNA即hsa_circ_0001788进行验证；采用ROC法，分析评价血清中hsa_circ_0001788表达水平对颅缝早闭患者的诊断价值。

具体的：

(1)采用Invitrogen公司Trizol LS试剂盒提取26例颅缝早闭患者与23例对照人群(颅脑外伤)外周血清中总RNA；随机选取其中5例颅缝早闭患者和5例对照人群外周血总RNA，利用Arraystar采用公司circRNA芯片技术，检测5例颅缝早闭患者与5例对照人群外周血血清circRNAs表达谱，筛选出差异表达的circRNAs，即hsa_circ_0001788；

(2)采用qRT-PCR方法，进一步扩大颅缝早闭患者和对照人群的样本量，检测步骤(1)筛选出的hsa_circ_0001788表达水平；采用ROC法，分析评价血清中hsa_circ_0001788表达水平对颅缝早闭患者的诊断价值。

本发明的第四个目的是提供一种用于扩增前述血清circRNA标志物的引物对，所述引物对的核苷酸序列如下所示：

hsa_circ_0001788Forward：5’-CCACCTACAGAAACAAAATGTCAA-3’(SEQ ID No.2)；

hsa_circ_0001788Reverse：5’-GGCTGGATGGCTGG GAGAT-3’(SEQ ID No.3)。

本发明的第五个目的是提供前述的引物对在制备辅助诊断颅缝早闭试剂盒中的应用。

本发明的第六个目的是提供一种辅助诊断颅缝早闭试剂盒，所述试剂盒用于定量检测血清中hsa_circ_0001788。

进一步的，所述试剂盒包括SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示的引物组。

进一步的，所述试剂盒包括SEQ ID No.1所示的血清circRNA标志物。

进一步的，所述试剂盒还包括针对SEQ ID No.1所示的血清circRNA标志物的逆转录试剂、内参引物对、荧光定量PCR反应液。

所述诊断试剂盒还可以包括PCR反应常用的酶和试剂，如逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl₂，DEPC水和Taq酶等；还可以含有标准品和/或对照品。

进一步的，所述的内参引物对包括β-actin内参基因的上游引物和下游引物，所述内参引物对的核苷酸序列如下所示：

β-actin Forward：5’-GTGGCCGAGGACTTTGATTG-3’(SEQ ID No.4)，

β-actin Reverse：5’-CCTGTAACAACGCATCTCATATT-3’(SEQ ID No.5)。

本发明的第七个目的是提供一种检测前述的血清circRNA标志物的方法，包括如下步骤：

1)提取人外周血血清总RNA；

2)测定总RNA浓度和纯度，将提取的外周血血清总RNA一半量进行RNA酶消化，另一半采用等体积的DEPC水处理；

3)通过逆转录随机引物在逆转录酶的作用下逆转录成cDNA；

4)在实时荧光定量PCR仪上，采用SEQ ID No.2～5所示的用于扩增血清circRNA标志物的引物对和内参引物对，对步骤(3)获得的cDNA和内参基因进行扩增检测；

5)采用2^-ΔΔCt法进行hsa_circ_0001788相对于内参的定量。

本发明的有益效果在于：

血清circRNA具有稳定性好，不易降解等优点，有较高的辅助诊断价值，利于临床推广使用。本发明人采用circRNA芯片检测以获取疾病特异和异常表达的血清miRNAs表达谱，并应用qRT-PCR的方法进行验证，具有严密的设计和评价体系。首次发现血清中hsa_circ_0001788作为一个重要的生物学检测指标，检测指标微创廉价，可应用于临床检测，在颅缝早闭临床的早期诊断、鉴别诊断具有重要作用，本发明也从分子水平上为颅缝早闭的诊断提供新的思路，有望提高颅缝早闭的早期诊断率。

附图说明

图1：颅缝早闭患者和对照人群血清中has_circRNA_001788表达值。

图2：颅缝早闭各临床亚型患者血清中has_circRNA_001788表达值。

图3：颅缝早闭患者与对照人群血清has_circRNA_001788表达值的ROC曲线。

具体实施方式

以下结合实施例，对本发明进行详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的包含范围不限于下述的实施例。下面的实施例中未注明的条件和方法均按照常规进行。

实施例1样本收集：

收集26例新诊断颅缝早闭的患者，同时收集23例匹配的对照。所有病例均经CT确诊。对照为颅脑外伤的患者。所有研究对象监护人均签署知情同意书，并提供患儿300μL外周血血清样本。

实施例2血清RNA提取：

参照Invitrogen公司Trizol LS(10296028)试剂盒说明书进行操作。具体步骤如下：

①0.25mL血清样品加入0.75mL TRIzol LS试剂；②混匀样本，室温静置5min，4℃12000g离心5min，取上清；③加入0.2mL氯仿，混匀，室温静置2-3min，4℃ 12000g离心15min，取上清；④加异丙醇0.5mL，室温放置10min，4℃ 12000g离心10min，弃上清液并轻轻吸干；⑤加75％乙醇1mL，混匀，离心4℃，7500g，5min；⑥弃上清，倒置于干净滤纸上片刻，4℃5000g离心3min；⑦用枪头移去乙醇，加入20-50μL DEPC水，混匀；⑧55-60℃水浴10-15min，NanoDrop ND-2000仪器检测RNA浓度与纯度。

实施例3 circRNA表达谱筛选

随机选择5例颅缝早闭患者与5例对照人群外周血总RNA，委托上海康成生物工程有限公司，利用Arraystar公司Human circular RNA Array V2.0芯片，检测5例颅缝早闭患者与5例对照人群外周血血清circRNAs表达谱，筛选出差异表达的circRNA即hsa_circ_0001788，进行扩大样本的验证。

实施例4 RNA酶(RNase R)消化：

①将提取的血清RNA均匀分到两个灭菌的PCR管中；②向其中一管加入1U/μgRNase R(RNR-07250，epicentre)和20μL 1×RNase R缓冲液，另一管加入相同体积的DEPC水；③两管37℃水浴10min；④95℃反应3min，灭活RNase R。

实施例5逆转录：

采用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(AppliedBiosystemsTM，4368814)进行逆转录得到cDNA。逆转录反应体系总体积为20μL，包括10×RTBuffer 2μL，25×dNTP Mix(100mM)0.8μL，10×RT Random Primers 2μL，MultiScribeTMReverse Transcriptase1μL，DEPC水4.2μL，RNA 2μg/10μL。逆转录步骤为：25℃反应10min，37℃反应120min，85℃反应5min，4℃保存反应样本。逆转录使用仪器为东胜龙梯度PCR仪。

实施例6实时荧光定量PCR：

采用SYBR-Green染料法(Real-time qPCR Master Mix，Takara,Japan)进行实时荧光定量PCR，以检测血清中hsa_circ_0001788及β-actin表达水平。

所用引物序列如下：

hsa_circ_0001788Forward:5’-CCACCTACAGAAACAAAATGTCAA-3’(SEQ ID No.2)，

hsa_circ_0001788Reverse:5’-GGCTGGATGGCTGG GAGAT-3’(SEQ ID No.3)；

β-actin Forward:5’-GTGGCCGAGGACTTTGATTG-3’(SEQ ID No.4)，

β-actin Reverse:5’-CCTGTAACAACGCATCTCATATT-3’(SEQ ID No.5)。

反应体系：SYBR 10μL，Forward Primer(10μM)0.5μL，ReversePrimer(10μM)0.5μL，cDNA(1:10稀释)2μL，加水至总体积为20μL。反应条件为：95℃，预变性30s；95℃，5s；60℃，30s；40个反应循环。

实时荧光定量PCR使用仪器型号为罗氏RT-PCR LC480Ⅱ。

实施例7分析hsa_circ_0001788在颅缝早闭患者和对照人群中的表达水平：

在hsa_circ_0001788(目的)与β-actin(内参)扩增效率相同的情况下，可以直接计算hsa_circ_0001788相对于内参的定量：ΔCT＝CT_目的-CT_内参，ΔΔCT＝ΔCT_病例-ΔCT_对照。采用2^-ΔΔCT表示病例组hsa_circ_0001788表达相对于对照组变化的倍数。

实施例8分析评价血清circRNA表达谱对颅缝早闭患者的诊断价值

采用单因素方差分析比较病例组与对照组间hsa_circ_0001788表达水平分布差异。ROC(receiver operator characteristic curve)法，评价血清hsa_circ_0001788表达水平对颅缝早闭患者的诊断价值。

采用IBM SPSS Statistics Premium V25.0和MedCalc v15.8软件进行统计分析，P<0.05认为有统计学差异，所有统计学检验均为双侧检验。

实施例9结果：

1.研究对象一般特征

本次研究共纳入26例颅缝早闭患者，其中矢状缝早闭患者10例，人字缝早闭患者2例，Apert综合征患者2例，Crouzon综合征患者2例，冠状缝早闭患者6例，额缝早闭患者1例，多颅缝早闭3例；共选取23名性别、年龄相匹配的脑外伤患者作为对照。

2.hsa_circ_0001788在颅缝早闭患者和对照人群中的表达值

由图1可见，hsa_circ_0001788表达值在颅缝早闭患者血清中的表达水平显著高于对照人群(P＝0.005)。

图2为hsa_circ_0001788在不同人群血清样本中的表达值，结果显示：hsa_circ_0001788在对照人群血清中的平均表达值均低于各类颅缝早闭患者血清中的平均表达值。

3.hsa_circ_0001788对颅缝早闭的诊断价值

ROC曲线分析结果如图3所示，hsa_circ_0001788曲线下面积为0.759(95％CI：0.616-0.870)，Youden指数为0.532，灵敏度为92.31％，特异度为60.87％，提示hsa_circ_0001788对颅缝早闭具有一定的诊断价值，可用于制备颅缝早闭检测试剂盒。

序列表

<110> 南京医科大学

<120> 环状RNA标志物hsa_circ_0001788及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 220

<212> RNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

gaucucccag ccauccagcc ccggcuagug gcggucagca aaaccaaacc ugcagacaug 60

gugaucgagg ccuauggaca ugggcagcgc acuuuuggcg agaacuacgu ucaggaacug 120

cuagaaaaag caucaaaucc caaaauucug ucuuuguguc cugagaucaa auggcacuuc 180

auuggccacc uacagaaaca aaaugucaac aaauugaugg 220

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccacctacag aaacaaaatg tcaa 24

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggctggatgg ctgggagat 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtggccgagg actttgattg 20

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cctgtaacaa cgcatctcat att 23

Claims

1.一种用于颅缝早闭诊断的血清circRNA标志物，其特征在于，所述标志物为hsa_circ_0001788，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述的血清circRNA标志物在制备辅助诊断颅缝早闭试剂盒中的应用。

3.权利要求1所述的血清circRNA标志物检测及表达谱的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)采用Trizol LS试剂盒提取颅缝早闭患者与对照人群外周血清中RNA，利用circRNA芯片技术，建立外周血血清circRNAs表达谱，筛选出候选的差异表达的circRNA，所述差异表达的circRNA为权利要求1所述的hsa_circ_0001788；

(2)采用qRT-PCR方法，扩大样本量对步骤(1)选出的候选的差异表达的circRNA进行验证；采用ROC法，分析评价血清中hsa_circ_0001788表达水平对颅缝早闭患者的诊断价值。

4.一种用于扩增权利要求1所述的血清circRNA标志物的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如下所示：

hsa_circ_0001788Forward：5’-CCACCTACAGAAACAAAATGTCAA-3’(SEQ ID No.2)；

hsa_circ_0001788Reverse：5’-GGCTGGATGGCTGGGAGAT-3’(SEQ ID No.3)。

5.权利要求4所述的引物对在制备辅助诊断颅缝早闭试剂盒中的应用。

6.一种辅助诊断颅缝早闭试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于定量检测血清中hsa_circ_0001788的表达。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求4所述的引物组。

8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的血清circRNA标志物。

9.根据权利要求6至8任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括针对权利要求1所述的血清circRNA标志物的逆转录试剂、内参引物对、荧光定量PCR反应液。

10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的内参引物对包括β-actin内参基因的上游引物和下游引物，所述内参引物对的核苷酸序列如下所示：

β-actinForward：5’-GTGGCCGAGGACTTTGATTG-3’(SEQ ID No.4)，

β-actinReverse：5’-CCTGTAACAACGCATCTCATATT-3’(SEQ ID No.5)。

11.一种检测权利要求1所述的血清circRNA标志物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)提取外周血血清总RNA，测定总RNA浓度和纯度；

2)将提取的外周血血清总RNA一半量进行RNA酶消化，另一半采用等体积的DEPC水处理；

3)通过逆转录随机引物在逆转录酶的作用下逆转录成cDNA；

4)在实时荧光定量PCR仪上，采用用于扩增血清circRNA标志物的引物对和内参引物对，对步骤(3)获得的cDNA和内参基因进行扩增检测；

5)采用2^-ΔΔCt法进行hsa_circ_0001788相对于内参的定量。