CN109439800A

CN109439800A - 检测hiv-1基因pr区和rt区基因突变的试剂盒及方法

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Publication number: CN109439800A
Application number: CN201811347060.5A
Authority: CN
Inventors: 蒋析文; 刘悦; 李瑞玲; 董子维; 朱小亚
Original assignee: Daan Gene Co Ltd Zhongshan University
Current assignee: Daan Gene Co Ltd Zhongshan University
Priority date: 2018-11-13
Filing date: 2018-11-13
Publication date: 2019-03-08
Anticipated expiration: 2038-11-13
Also published as: CN109439800B

Abstract

本发明提供了一种检测HIV‑1基因PR区和RT区基因突变的试剂盒及方法，具体地，本发明公开了一种检测HIV患者血浆中的HIV‑1病毒pol基因PR区与RT区基因突变的方法、引物、及包括该引物混合液的试剂盒。本发明基于一代测序平台，具有同时检测突变位点多、准确度高、样本易获取等优点。

Description

检测HIV-1基因PR区和RT区基因突变的试剂盒及方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种检测HIV-1病毒pol基因RT区以及PR区基因突变的试剂盒及方法。

背景技术

人类免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiencyVirus；abbr:HIV)，即艾滋病(AIDS，获得性免疫缺陷综合征)病毒，是造成人类免疫系统缺陷的一种病毒。截至2014年，全球约有3690万人感染HIV病毒，平均每天就有6000人中招，死于艾滋病的人数高达1200万。2016年1月相关报告显示，中国感染HIV病毒的总人数，已经超过100万大关。

HIV的治疗，目前HIV的一线治疗药物主要为蛋白酶抑制剂PIs，核苷类NRTI和非核苷类逆转录酶抑制剂NNRTI3类抗病毒药物组合治疗，大部分患者在治疗一段时间后会出现不同程度的耐药。主要是因为HIV是反转录病毒，其反转录酶在HIV复制时具有DNA复制能力但没有校正能力，使HIV有高度的遗传变异性。长时间用同一种药物治疗后，病毒复制过程中的高频突变和抗病毒药物产生的选择压力导致HIV-1病毒原发感染的几个月内就可形成大量的基因突变病毒，即准种。一旦突变发生在逆转录酶、蛋白酶主要编码基因序列，就可能引起此类酶分子发生结构和功能改变，从而导致HIV-1病毒对作用于这2种酶的抑制剂不再敏感，而产生耐药性。

HIV-1病毒pol基因编码聚合酶前体蛋白，经切割形成蛋白酶、整合酶、逆转录酶、核糖核酸酶H，均为病毒增殖所必需。当pol基因的PR区以及RT区发生突变的时候可能会导致蛋白酶和逆转录酶的结构发生改变，并因此改变HIV-1病毒对临床上的蛋白酶抑制剂PIs、核苷类NRTI和非核苷类逆转录酶抑制剂NNRTI这3类抗病毒药物的敏感性发生改变，可能会导致耐药的出现。因此，在HIV患者使用这3类药物治疗之前对HIV-1病毒pol基因的PR区以及RT区的基因突变型别进行检测和耐药分析有利于为HIV患者治疗药物的筛选提供参考，并可实时监测患者用药期间的耐药突变。

因此，本领域迫切需要开发能够有效同时检测HIV-1病毒pol基因PR区以及RT区多个位点基因突变的技术以满足临床需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测HIV-1病毒pol基因RT区以及PR区突变的试剂盒及方法。

本发明的第一方面，提供了一种用于检测HIV-1病毒pol基因PR区以及PT区突变的RT-PCR扩增引物对，所述RT-PCR扩增引物对包括：如SEQ ID NO.:1所示的RT-PCR上游引物；和，如SEQ ID NO.:2所示的RT-RCR下游引物。

本发明的第二方面，提供了一种用于检测HIV-1病毒pol基因PR区以及PT区突变的PCR扩增引物对，所述PCR扩增引物对包括：如SEQ ID NO.:3所示的PCR上游引物；和，如SEQID NO.:4所示的PCR下游引物。

本发明的第三方面，提供了一种用于检测HIV-1病毒pol基因PR区以及PT区突变的测序引物组，所述测序引物组包括选自下组的一种或多种测序引物：

测序引物Ⅰ：SEQ ID NO：5；

测序引物Ⅱ：SEQ ID NO：6；

测序引物Ⅲ：SEQ ID NO：7；

测序引物Ⅳ：SEQ ID NO：8；

测序引物Ⅴ：SEQ ID NO：9；和

测序引物Ⅵ：SEQ ID NO：10。

本发明的第四方面，提供了一种用于检测HIV-1基因PR区以及PT区突变的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的RT-PCR扩增引物对。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括本发明第二方面所述的PCR扩增引物对。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括本发明第三方面所述的测序引物组。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括突变型阳性对照，野生型阳性对照和阴性对照。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括选自下组的一种或多种组分：

RT-PCR酶系(包括热启动Taq酶、和逆转录酶)、PCR酶系(包括热启动Taq酶)、测序染料、测序反应液、去离子甲酰胺。

在另一优选例中，所述RT-PCR引物和所述PCR引物在反应体系中的最终浓度为0.2μmol/L。

在另一优选例中，所述测序引物在反应体系中的终浓度为0.16μmol/L。

本发明的第五方面，提供了一种一代测序法检测HIV-1病毒pol基因PR区以及PT区突变的方法，所述方法包括步骤：

(1)提供待检测对象的HIV-1RNA样本；

(2)制备RT-PCR扩增反应体系，并进行RT-PCR扩增反应获得RT-PCR扩增反应产物：

其中，所述RT-PCR扩增反应体系包括步骤(1)提供的所述RNA样本、和本发明第一方面所述的RT-PCR扩增引物对；

(3)制备PCR扩增反应体系，并进行PCR扩增反应获得PCR扩增反应产物

其中，所述PCR扩增反应体系包括步骤(2)获得的RT-PCR扩增反应产物、和本发明第二方面所述的所述的PCR扩增引物对；

(4)制备测序PCR扩增反应体系，并进行测序PCR扩增反应获得测序PCR扩

增反应产物

其中，所述测序PCR扩增反应体系包括步骤(3)获得的PCR扩增反应产物、和本发明第三方面所述的测序引物组；

(5)对步骤(4)获得的测序PCR扩增反应产物进行测序。

本发明的第六方面，提供了本发明第一方面所述的RT-PCR扩增引物对、和/或本发明第二方面所述的PCR扩增引物对、和/或本发明第三方面所述的测序引物组的用途，用于制备一代测序检测试剂盒，所述一代测序检测试剂盒用于检测HIV-1病毒pol基因PR区以及PT区基因突变。

应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了使用对照RT-PCR引物对1的电泳结果。

图2显示了使用对照RT-PCR引物对2的电泳结果。

图3显示了使用对照PCR扩增引物对1的电泳结果。

图4显示了使用对照PCR扩增引物对2的电泳结果。

图5显示了使用本发明试剂盒的电泳结果。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种检测HIV患者体内HIV-1病毒pol基因PR区以及RT区突变的试剂盒及方法，实验结果表明，本发明的方法和试剂盒基于一代测序平台能检出2×10³copies/ml的病毒载量和20％的突变比率，具有同时检测突变位点多、准确度高、样本易获取等优点。

本发明涉及HIV检测技术领域，公开了一种检测HIV患者血浆中的HIV-1病毒pol基因PR区以及RT区基因突变的方法、引物及包括该引物混合液的试剂盒。提供了检测HIV-1病毒pol基因PR区以及RT区突变的扩增引物及测序引物。本申请以HIV患者血浆中的HIV-1病毒RNA为模板，在测得HIV-1病毒pol基因PR区以及RT区突变的同时还可对临床上，蛋白酶抑制剂PIs，核苷类NRTI和非核苷类逆转录酶抑制剂NNRTI这3类抗HIV-1的药物相关耐药进行分析。本试剂盒对HIV-1病毒pol基因PR区以及RT区基因突变进行检测，基于一代测序平台能检出2×10³copies/ml的病毒载量和20％的突变比率，具有同时检测的突变位点多、检测结果准确度高、样本易获取等优点。

具体地，本发明提供了一种基于一代测序平台，检测HIV患者HIV-1病毒pol基因PR区以及RT区突变的方法、扩增引物、测序引物及包括该扩增引物混合液的试剂盒，检测样本为HIV患者的血浆中的HIV-1病毒。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

一代测序法(Sanger法测序)

一代测序法(Sanger法测序)，在检测HIV-1病毒基因突变时具有较高的特异性和高度的准确性，其主要是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种链终止核苷酸为止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，最后经过检测读取出待测样本目的片段序列的每个碱基信息。

大量研究表明，HIV-1病毒pol基因PR区以及RT基因突变与临床上，蛋白酶抑制剂PIs，核苷类NRTI和非核苷类逆转录酶抑制剂NNRTI3类抗HIV-1的药物的耐药密切相关。因此，随着患者蛋白酶抑制剂PIs，核苷类NRTI和非核苷类逆转录酶抑制剂NNRTI3类抗HIV-1的药物的耐药出现，检测患者感染的HIV-1病毒pol基因PR区以及PT区突变型别可为HIV患者治疗药物的筛选提供参考，并可实时监测患者用药期间的耐药突变，具体可见参考文献。

本发明提供了一种检测HIV患者HIV-1病毒pol基因PR区以及RT区基因突变的方法、扩增引物、测序引物及其试剂盒，具有同时检突变位点多、准确度高、样本易获取等优点。

在本发明的一个优选地实施方式中，野生型HIV-1病毒pol基因PR区以及RT区基因序列如SEQ ID NO.:19所示(AB746342.2)。

在本发明的一个优选地实施方式中，本发明提供了一种用于一代测序法检测HIV-1病毒pol基因PR区以及PT区突变的RT-PCR扩增引物对和PCR扩增引物对；其中，所述RT-PCR引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.:1和SEQ ID NO.:2所示，所述PCR引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.:3和SEQ ID NO.:4所示。

在本发明的另一个优选地实施方式中，本发明提供了一种用于一代测序法检测HIV-1病毒pol基因PR区以及PT区突变的测序引物，所述测序引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.:5～NO.:10所示。

在本发明的另一个优选地实施方式中，本发明提供了一种用于一代测序法检测HIV-1基因PR区以及PT区突变的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的扩增引物对。

在本发明的另一个优选地实施方式中，本发明提供了一种一代测序法检测HIV-1病毒pol基因PR区以及PT区突变的方法，所述方法包括步骤：

(1)提供待检测对象的HIV-1RNA样本；

(2)制备RT-PCR扩增反应体系：

其中，所述RT-PCR扩增反应体系包括步骤(1)提供的所述RNA样本、所述的RT-PCR扩增引物对

(3)制备PCR扩增反应体系

其中，所述PCR扩增反应体系包括步骤(2)提供的RT-PCR扩增反应产物、所述的PCR扩增引物对。

(4)PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定

(5)PCR扩增反应产物纯化

(6)制备测序PCR扩增反应体系

其中，所述测序PCR扩增反应体系包括步骤(4)提供的纯化的PCR扩增反应产物、所述的测序引物

(7)测序PCR扩增反应产物纯化

(8)纯化后测序PCR产物在ABI 3500测序仪上进行测序检测

本发明的具体技术方案如下：

一种检测HIV患者的血浆中的HIV-1病毒pol基因PR区以及RT区区基因突变的方法、扩增引物、测序引物及包括该扩增引物混合液的试剂盒。提供了用于检测HIV-1病毒pol基因PR区以及RT区基因突变所需的特异性扩增引物及测序引物。本申请以HIV患者的血浆中的HIV-1病毒RNA为模板，在测得HIV-1病毒pol基因PR区以及RT区基因突变型别的同时还可对临床上3类(蛋白酶抑制剂PIs，核苷类NRTI和非核苷类逆转录酶抑制剂NNRTI)抗HIV-1的药物相关耐药进行分析。本试剂盒对HIV-1病毒pol基因PR区以及RT区基因突变进行检测，基于一代测序平台能检出2×10³copies/ml的病毒载量和20％的突变比率，具有同时检测的突变位点多、准确度高、样本易获取等优点。

在本发明的一个优选地实施方式中，本发明公开了一种检测HIV患者的血浆中的HIV-1病毒PR区以及RT区基因突变的RT-PCR扩增引物对、PCR扩增引物对和测序引物：

所述检测HIV-1病毒pol基因PR区以及RT区基因突变的引物对包括RT-PCR扩增引物对和PCR引物对；其中，所述RT-PCR引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.:1和SEQ ID NO.:2所示，所述PCR引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.:3和SEQ ID NO.:4所示，测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.:5～NO.:10所示。

优选地，所述RT-PCR扩增引物在反应体系中的终浓度为0.2μmol/L，所述PCR扩增引物在反应体系中的终浓度为0.2μmol/L，所述测序引物在反应体系中的终浓度为0.16μmol/L，

检测HIV-1基因的PR区以及RT区基因突变的引物核苷酸序列信息：

RT-PCR上游引物SEQ ID NO：1；RT-PCR下游引物SEQ ID NO：2；

PCR上游引物SEQ ID NO：3；PCR下游引物SEQ ID NO：4；

测序引物ⅠSEQ ID NO：5；测序引物ⅡSEQ ID NO：6；

测序引物ⅢSEQ ID NO：7；测序引物ⅣSEQ ID NO：8；

测序引物ⅤSEQ ID NO：9；测序引物ⅥSEQ ID NO：10。

所述特异性扩增引物和测序引物，能够准确检测以血浆中HIV-1病毒RNA为模板的HIV-1病毒pol基因PR区以及RT区基因突变类型，在检测在测得HIV-1病毒pol基因PR区以及RT区突变型别的同时还可对临床上蛋白酶抑制剂PIs，核苷类NRTI和非核苷类逆转录酶抑制剂NNRTI，3类抗HIV-1的药物相关耐药进行分析。本发明结合一代测序平台可检出2×10³copies/ml浓度的病毒载量和20％的突变比率。

上述特异性扩增引物和测序引物所制备的试剂盒，基于一代测序平台可检测HIV-1病毒pol基因PR区以及RT区基因突变型别，为患者使用何种蛋白酶抑制剂PIs，核苷类NRTI和非核苷类逆转录酶抑制剂NNRTI抗HIV-1的药物进行治疗提供参考。

在本发明的另一个优选地实施方式中，本发明还公开了一种检测HIV患者血浆中的HIV-1病毒pol基因PR区以及RT区基因突变的的试剂盒，包括用于配制RT-PCR反应试剂的RT-PCR反应液、RT-PCR酶系；用于配制PCR反应试剂的PCR反应液；PCR酶系；用于配制测序PCR反应试剂的测序染料(BigDye)；测序反应液(BigDye Sequencing Buffer)、测序引物、和用于测序检测的高纯度去离子甲酰胺(Hi-Di Formamide)。

进一步地，所述RT-PCR反应液包括如下成分，如表1，

表1 RT-PCR反应液

其中，所述用于HIV-1基因RT-PCR扩增的引物分别如下，

检测HIV-1基因RT-PCR扩增引物，包括由SEQ ID NO：1所示的RT-PCR上游引物核苷酸序列，由SEQ ID NO：2所示的RT-PCR下游引物核苷酸序列，

优选地，所述上游引物在反应体系中的终浓度为0.2μmol/L，所述下游引物在反应体系中的终浓度为0.2μmol/L。

进一步地，所述RT-PCR酶系包括如下成分，如表2，

表2 RT-PCR酶系

编号	组分	组分中的主要成分
			1	RT-PCR酶系	dNTPs、DTT、逆转录酶Taq酶

进一步地，所述PCR反应液包括如下成分，如表3，

表3 PCR反应液

其中，所述用于HIV-1基因PCR扩增的引物分别如下，

检测HIV-1基因RT区以及PR区突变的PCR扩增引物，包括由SEQ ID NO：3所示的PCR上游引物核苷酸序列，由SEQ ID NO：4所示的PCR下游引物核苷酸序列。

进一步地，所述PCR酶系包括如下成分，如表4，

表4 PCR酶系

编号	组分	组分中的主要成分
			1	PCR酶系	dNTPs、DTT、Taq酶

进一步地，测序试剂包括如下成分，如表5：

表5测序试剂

其中，所述用于HIV-1病毒基因测序的引物分别如下，

检测HIV-1病毒基因测序引物，包括由SEQ ID NO：5所示的测序引物Ⅰ核苷酸序列，由SEQ ID NO：6所示的测序引物Ⅱ核苷酸序列，由SEQ ID NO：7所示的测序引物Ⅲ核苷酸序列，由SEQ ID NO：8所示的测序引物Ⅳ核苷酸序列，由SEQ ID NO：9所示的测序引物Ⅴ核苷酸序列，由SEQ ID NO：10所示的测序引物Ⅵ核苷酸序列，

优选地，所述测序引物在反应体系中的终浓度为0.16μmol/L。

进一步地，对照样本包括如下成分，如表6：

表6对照样本

编号	组分	组分中的主要成分
			1	阴性对照	阴性血浆
2	野生型阳性对照	含HIV-1野生目的片段的病毒样颗粒
			3	突变型阳性对照	含HIV-1突变目的片段的病毒样颗粒

本发明所述试剂盒适用样本为血浆。

本发明所述试剂盒用于判定检测有效性的标准为：每次检测均设置阴性对照组、野生型阳性对照组和突变型阳性对照组，当检测结果的突变型阳性对照组为突变阳性，野生型阳性对照组为野生型且阴性对照组为阴性时，表明实验结果有效。本发明所述试剂盒的检测灵敏度可达到2×10³copies/ml。

在本发明的另一个优选地实施方式中，本发明还公开了一种检测HIV患者血浆中HIV-1病毒PR区以及RT区基因突变的方法，具体步骤包括：

(1)处理待测样本并提取样本HIV-1RNA模板；待测样本为血浆；

(2)配制RT-PCR反应体系，将待测样本RNA模板、RT-PCR反应液、RT-PCR酶

系混合，制备得到dPCR反应液；RT-PCR反应体系构成如表7，

表7 RT-PCR反应体系

RNA模板	20μL
		RT-PCR反应液	27μL
RT-PCR酶系	3μL

(3)在PCR仪中进行RT-PCR扩增，所述RT-PCR的扩增条件为：第一阶段，50℃逆转录30分钟；第二阶段95℃15分钟预变性，第三阶段，(94℃20秒→55℃45秒→68℃2分钟)×35个循环扩增；最后68℃延伸7分钟；

(4)RT-PCR产物稀释，把RT-PCR的扩增产物稀释10倍

(5)配制PCR反应体系，将稀释后的RT-PCR产物、PCR反应液、PCR酶系混合制备得到PCR反应体系；PCR反应体系构成如表8，

表8 PCR反应体系

稀释10倍后的RT-PCR产物	30μL
		PCR反应液	17μL
PCR酶系	3μL

(6)在PCR仪中进行RT-PCR扩增，所述PCR的扩增条件为：第一阶段95℃15分钟预变性，第二阶段，(94℃20秒→55℃20秒→72℃1分钟)×30个循环扩增；最后72℃延伸10分钟

(7)PCR产物纯化，对扩增后的PCR产物进行纯化

(8)配制测序PCR反应体系，将纯化后的PCR产物，测序引物、测序染料(BigDye)、测序反应液(BigDye Sequencing Buffer)混合制备得到测序PCR反应体系；测序PCR反应体系构成表9～表14

表9测序引物Ⅰ测序PCR反应体系

纯化后PCR产物	XμL(约5-20ng)
		测序染料(BigDye)	2μL
测序反应液(BigDye Sequencing Buffer)	3μL
		测序引物Ⅰ	1μL
无菌纯化水14-Xμl	补足20μL

表10测序引物Ⅱ测序PCR反应体系

表11测序引物Ⅲ测序PCR反应体系

纯化后PCR产物	XμL(约5-20ng)
		测序染料(BigDye)	2μL
测序反应液(BigDye Sequencing Buffer)	3μL
		测序引物Ⅲ	1μL
无菌纯化水14-Xμl	补足20μL

表12测序引物Ⅳ测序PCR反应体系

纯化后PCR产物	XμL(约5-20ng)
		测序染料(BigDye)	2μL
测序反应液(BigDye Sequencing Buffer)	3μL
		测序引物Ⅳ	1μL
无菌纯化水14-Xμl	补足20μL

表13测序引物Ⅴ测序PCR反应体系

纯化后PCR产物	XμL(约5-20ng)
		测序染料(BigDye)	2μL
测序反应液(BigDye Sequencing Buffer)	3μL
		测序引物Ⅴ	1μL
无菌纯化水14-Xμl	补足20μL

表14测序引物Ⅵ测序PCR反应体系

纯化后PCR产物	XμL(约5-20ng)
		测序染料(BigDye)	2μL
测序反应液(BigDye Sequencing Buffer)	3μL
		测序引物Ⅵ	1μL
无菌纯化水14-Xμl	补足20μL

(9)在PCR仪中进行测序PCR扩增，所述测序PCR的扩增条件为：96℃1分钟→(96℃10秒→50℃5秒→60℃4分钟)×25个循环→4℃保温。

(10)测序PCR产物纯化，将测序PCR扩增后的测序PCR产物进行酒精纯化。

(11)用ABI 3500测序仪对纯化后的测序产物进行测序分析

(12)根据测序结果显示的基因序列信息与标准野生型序列进行比对，判定待测样本是否纯在突变。

所述扩增引物和测序引物的核苷酸序列信息分别如下：

RT-PCR上游引物(SEQ ID NO：1)5’-GGACAGGAAGGACACCAAATG-3’；

RT-RCR下游引物(SEQ ID NO：2)5’-GCTATCAAGTCTTTTGATGGGTCATA-3’；

PCR上游引物(SEQ ID NO：3)5’-AGARCCAACAGCCCCRCCAG-3’；

RCR下游引物(SEQ ID NO：4)5’-CCTGTTTTCTGCCAATTCTAAYTCTGC-3’；

测序引物Ⅰ(SEQ ID NO：5)5’-GGAGCAGATGATACAGTATTAGAAGA-3’；

测序引物Ⅱ(SEQ ID NO：6)5’-AAATTAAAGCCAGGAATGGATGG-3’

测序引物Ⅲ(SEQ ID NO：7)5’-GATGGAAAGGATCACCAGCAATATT-3

测序引物Ⅳ(SEQ ID NO：8)5’-GGAGCAGATGATACAGTATTAGAAGA-3’

测序引物Ⅴ(SEQ ID NO：9)5’-AATTTTCTCTTCTGTCAATGGCCA-3’

测序引物Ⅵ(SEQ ID NO：10)5’-CCATTTGTCAGGATGGAGTTCATA-3’

本申请采用一代测序法检测原理如下：测序方法采用Sanger法测序，主要是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的带有荧光标记的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，最后经过检测得出待测样本的基因序列信息。

检测方法

本发明提出一种检测HIV患者HIV-1基因RT区以及PR区基因突变的的方法、扩增引物、测序引物及试剂盒，该试剂盒基于一代测序平台，可检出突变基因0.1％的突变率。具体实施步骤如下，

步骤一、待测样本RNA模板提取

用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入含乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)或枸橼酸钠抗凝剂的玻璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5-10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，5-10分钟后即可分离出血浆，转移至1.5ml灭菌离心管。用于样本RNA的提取。使用中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸提取试剂盒(磁珠法)：粤穗食药监械(准)字2012第1400100号，或者核酸提取试剂盒(离心柱法)：粤穗食药监械(准)字2012第1400096号，按照试剂盒说明书进行核酸的提取，模板RNA可直接用于后续实验。

步骤二、RT-PCR体系的制备

RT-PCR体系配制前准备：取出试剂盒中的RT-PCR反应液、RT-PCR酶系，室温融化，涡旋震荡混匀后离心10秒，配制RT-PCR体系；RT-PCR体系中含RT-PCR反应液27μL；和RT-PCR酶系3μL。

步骤三、RT-PCR加样

取步骤一所制备的样本及试剂盒中的各对照样本RNA模板20μL加样至步骤二配制的RT-PCR反应体系的八连管中，使每管RT-PCR反应体系的总体积为50μL；盖紧八连管管盖。所述试剂盒的对照样本如表6。

步骤四、RT-PCR扩增

将八连管放入PCR仪，进行扩增，RT-PCR扩增的反应条件：50℃30分钟，95℃15分钟预变性，然后按(94℃20秒→55℃45秒→68℃2分钟)×35个循环扩增；最后68℃延伸7分钟。

步骤六、RT-PCR产物稀释

将RT-PCR产物转移到1.5mL无菌离心管中，加入450μL的灭菌水把RT-PCR产物稀释10倍

步骤七、PCR扩增体系的制备

PCR体系配制前准备：取出试剂盒中的PCR反应液、PCR酶系，室温融化，涡旋震荡混匀后离心10秒，配制PCR体系；PCR体系包括PCR反应液17μL；和PCR酶系

3μL。

步骤八、PCR加样

取步骤六制备的RT-PCR产物30μL加样至步骤七所制备的PCR扩增体系中使每管PCR反应体系的总体积为50μL；盖紧八连管管盖。

步骤九、PCR扩增

将八连管放入PCR仪，进行扩增，PCR扩增的反应条件：95℃15分钟预变性，然后按(94℃20秒→55℃20秒→72℃21分钟)×30个循环扩增；最后72℃延伸10分钟。

步骤十、PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定

取5μl PCR产物进行1-2％琼脂糖凝胶电泳，观察是否有目的条带扩增(目的条带大小为1300bp)如观察到明显的单一目的条带，则将上述PCR产物及时进行纯化处理。

步骤十一、PCR产物纯化

将步骤九所得的PCR产物使用生工生物工程股份有限公司的《生工SanPrep柱式产物纯化试剂盒》进行PCR产物纯化。

步骤十二、测序PCR扩增体系的制备

测序PCR体系配制前准备：取出试剂盒中的测序染料(BigDye)，测序反应液(BigDye Sequencing Buffer)，测序引物Ⅰ，测序引物Ⅱ，测序引物Ⅲ，测序引物Ⅳ，测序引物Ⅴ，测序引物Ⅵ，室温融化，涡旋震荡混匀后离心10秒，配制测序PCR体系；测序PCR体系构成如表9～表14。

步骤十三、测序PCR扩增：

将步骤十一制备的测序PCR扩增体系放于PCR仪上进行测PCR扩增,测序PCR扩增的反应条件:96℃1分钟→(96℃10秒→50℃5秒→60℃4分钟)×25个循环→4℃保温。

步骤十四、测序PCR产物纯化

将步骤十二得到的测序PCR扩增产物进行酒精纯化，纯化后的产物加入10μL高纯度去离子甲酰胺(Hi-Di Formamide)溶解。

步骤十五、测序检测及分析

将步骤十三得到的纯化后的测序PCR产物放于定性PCR仪上95℃变性5分钟，迅速置冰中冷却4分钟后，放于ABI 3500测序仪上进行测序检测，检测完成得到待测样本的Ⅰ～Ⅵ测序引物的测序结果后使用HIV耐药分析软件进行分析得出待测样本PR区以及RT区的突变类型和耐药水平；也将Ⅰ～Ⅵ测序引物的测序结果拼接后的序列使用斯坦福大学HIV耐药数据库进行结果分析出待测样本PR区以及RT区的突变类型和耐药水平。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明提供的用于扩增检测HIV-1基因RT区以及PR区基因突变区域部位目的核酸片段的引物对，特异性好，灵敏度高，可以对血浆中的HIV-1病毒核酸进行有效扩增，完全可以满足一代测序的需要；

(2)本发明优化了特异性的测序引物，使用了6条测序引物对HIV-1基因RT区以及PR区扩增片段进行双向多次测序，因而显著地增加了检测的准确率；

(3)本发明的方法可检突变类型多、所需样本少、性能稳定高效、准确性高。

本发明适用于HIV患者蛋白酶抑制剂PIs，核苷类NRTI和非核苷类逆转录酶抑制剂NNRTI3类抗HIV-1的药物的耐药机制及用药评估，实现治疗效果的动态追踪及对病人预后的实时监测，是探索HIV-1高效治疗的一条可行途径，值得推广应用。另外，本发明的方法同样适用于非诊断的目的，例如，在新药研发过程中，使用本发明的检测方法获得用作中间结果的基因突变信息，这些基因突变信息可以作为公众健康管理之需，也可以用于HIV-1耐药机制的研究及新药研发。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1

本实施例提供了一种检测HIV患者RT区以及PR区基因突变的试剂盒，其组成成分、包装及数量(24反应/盒)，如表7，

表7试剂盒的组成成分、包装及数量

实施例2：核酸灵敏度和突变灵敏度检测实验

核酸检测限样本为含有HIV-1病毒pol基因PR区以及RT区野生型片段的病毒样颗粒，稀释到2×10⁵copies/ml、2×10⁴copies/ml、2×10³copies/ml作为核酸检测限参考品；含有HIV-1病毒pol基因PR区以及RT区野生型片段的毒样颗粒和含有HIV-1病毒pol基因PR区以及RT区突变型片段的病毒样颗粒稀释至1×10⁵copies/ml，然后分别按照含有100％、80％、60％、40％、20％的突变的比例混合HIV-1野生和突变目的片段的毒样颗粒作为突变灵敏度参考品，阴性对照为阴性血浆；

取提取后的阴性对照和灵敏度参考品核酸20μL，加样至步骤二配制的RT-PCR反应体系的八连管中，使每管RT-PCR反应液总体积为50μL；盖紧八连管管盖，充分混匀，高速离心10秒；用于RT-PCR扩增；

RT-PCR的扩增条件：第一阶段，50℃逆转录30分钟；第二阶段95℃15分钟预变性，第三阶段，(94℃20秒→55℃45秒→68℃2分钟)×35个循环扩增；最后68℃延伸7分钟；

用灭菌水将RT-PCR产物稀释10倍；

取稀释后的RT-PCR产物30μL加入到步骤八配制的PCR反应体系的八连管中，使每管PCR反应液总体积为50μL；盖紧八连管管盖，充分混匀，高速离心10秒；用于PCR扩增；

PCR的扩增条件：第一阶段95℃15分钟预变性，第二阶段，(94℃20秒→55℃20秒→72℃1分钟)×30个循环扩增；最后72℃延伸10分钟；

取5μl PCR产物进行1-2％琼脂糖凝胶电泳，观察是否有目的条带扩增(目的条带大小为1300bp)如观察到明显的单一目的条带，则将上述PCR产物及时进行纯化处理；

将PCR产物进行纯化处理；

纯化后PCR产物按步骤十二测序PCR体系配方进行配制，高速离心10秒；用于测序PCR扩增；

测序PCR扩增条件：96℃1分钟→(96℃10秒→50℃5秒→60℃4分钟)×25个循环→4℃保温；

测序PCR产物进行酒精纯化；

将酒精纯化后的测序PCR产物放在ABI3500测序仪上进行测序检测，测序结果与HIV-1野生型序列进行比对，分析待测样本的突变型别。

用一代测序系统对本发明的核酸灵敏度进行检测，实际测得的突变结果如表8所示，

表8灵敏度检测结果

试剂盒的核酸灵敏度和突变灵敏度检测结果与理论值相符，表明引物具有较好的特异性，灵敏度检测良好；当突变型与野生型核酸混合的阳性对照样本突变率为20％时，一代测序系统可稳定检测出相应型别为突变野生杂合型，因此，本发明的检测限核酸灵敏度为2×10³copies/ml，突变灵敏度为20％。

实施例3：准确性检测

准确性参考品共10份，编号分别为P1-P10，为含有HIV-1突变和野生目的片段的病毒样颗粒，稀释至1×10⁵copies/ml作为阳性参考品，经PCR和克隆测序确认。

取提取后的阴性对照和准确性参考品核酸20μL，加样至步骤二配制的RT-PCR反应体系的八连管中，使每管RT-PCR反应液总体积为50μL；盖紧八连管管盖，充分混匀，高速离心10秒；用于RT-PCR扩增；

用灭菌水将RT-PCR产物稀释10倍；

将PCR产物进行纯化处理；

测序PCR产物进行酒精纯化；

将酒精纯化后的测序PCR产物放在ABI 3500测序仪上进行测序检测，测序结果与HIV-1野生型序列进行比对，分析待测样本的突变型别。

用一代测序系统对本发明试剂盒的准确性进行检测，得到结果如表9，

表9

根据上表所述结果，各质控品准确性的检测结果阳性率为100％，符合理论定性标准，表明本发明试剂盒的准确性检测符合要求。

实施例4临床样本检测

分别抽取30例HIV患者静脉血2毫升，注入含乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)或枸橼酸钠抗凝剂的玻璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5-10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀。提供血样的30名HIV患者已进行过耐药基因的检测，并且明确为携带Pol基因PR区以及RT区耐药突变，或者不含PR区以及RT区耐药突变；做好样本标记并确保标签信息无误，常温保存，4小时内分离出血浆，转移至1.5ml灭菌离心管，用于样本RNA的提取。使用中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸提取试剂盒(磁珠法)：粤穗食药监械(准)字2012第1400100号，或者核酸提取试剂盒(离心柱法)：粤穗食药监械(准)字2012第1400096号，按照试剂盒说明书进行核酸的提取，模板RNA可直接用于后续实验。

取提取后的临床样本核酸20μL，加样至步骤二配制的RT-PCR反应体系的八连管中，使每管RT-PCR反应液总体积为50μL；盖紧八连管管盖，充分混匀，高速离心10秒；用于RT-PCR扩增；

用灭菌水将RT-PCR产物稀释10倍；

将PCR产物进行纯化处理；

测序PCR产物进行酒精纯化；

检测结果为：30例样本中，12例样本含有PR区以及RT区耐药突变，18例样本不含PR区以及RT区耐药突变，所检结果与临床样本的突变型别一致性为100％。

对比例1

本发明人针对HIV-1病毒pol基因PR区以及PT区设计了数十对RT-PCR扩增引物，其中绝大部分引物的灵敏度较低、特异性较差，存在漏检，无法满足检测需要，典型的普通RT-PCR引物序列和检测效果数据如下：

对照RT-PCR引物对1

上游引物:5’-ATTGCAGGGCCCCTAGG-3’(SEQ ID NO.:11)；

下游引物:5’-ATTGTTCTTGGTAAATTTGATATGTCCA-3’(SEQ ID NO.:12)

对照RT-PCR引物对2：

上游引物:5’-AAGGGCTGTTGGAAATGTGGA-3’(SEQ ID NO.:13)；

下游引物:5’-CTGTATTTCAGCTATCAAGTCTTTTGATGG-3’(SEQ ID NO.:14)。

具体检测步骤、检测条件、同以上实施例，使用对照RT-PCR引物对1的检测结果如图1所示，图1中最左侧泳道为Marker，其余泳道为不同的临床血浆样本，靶基因阳性，检测结果表明对照RT-PCR引物对1在部分样本中无法检测出靶基因，灵敏度差且特异性较差。

使用对照RT-PCR引物对2的检测结果如图2所示，图2中最左侧泳道为Marker，其余泳道为不同的临床血浆样本，靶基因阳性，检测结果表明对照引物对2的特异性同样极差，且漏检情况严重。对照引物对1和对照引物对2均不能满足HIV-1RT-PCR的检测的要求。

对比例2

本发明人针对HIV-1病毒pol基因PR区以及PT区设计了数十对PCR扩增引物，其中绝大部分引物的灵敏度较低、特异性较差，无法满足检测需要，典型的PCR引物序列和检测效果数据如下：

对照PCR扩增引物对1：

上游引物:5’-GGAAATGTGGAAAGGAAGGAC-3’(SEQ ID NO.:15)；

下游引物:5’-TTCAGCTATCAAGTCTTTTGATGG-3’(SEQ ID NO.:16)

对照PCR扩增引物对2：

上游引物:5’-ACAAGGGGAGGCCAGGGAAT-3’(SEQ ID NO.:17)；

下游引物:5’-AAATTTCCCTGTTTTCTGCCAATTCTA-3’(SEQ ID NO.:18)。

具体检测步骤、检测条件、同以上实施例，使用对照PCR扩增引物对1的检测结果如图3所示，图3中最左侧泳道为Marker，其余泳道为不同的临床血浆样本经RT-PCR扩增获得的反应产物，检测结果表明对照PCR扩增引物对1的特异性差，且灵敏度差。

使用对照PCR扩增引物对2的检测结果如图4所示，图4中最左侧泳道为Marker，其余泳道为不同的临床血浆样本经RT-PCR扩增获得的反应产物检测结果表明对照PCR扩增引物对2的特异性同样极差。对照PCR引物对1和对照PCR引物对2均不能满足临床PCR检测的要求。

而适用本发明的PCR扩增引物对进行检测，检测结果如图5所示，目的条带单一、明亮，点样孔没有涂布也不没有杂带出现。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

参考文献:

1.Zhang M，Han XX，Cui WG，et al.The impacts of current antiretroviraltherapy regimens on Chinese AIDS patients and their implications for HIV-1drug resistance mutation[J].Jpn J Infect Dis,2008,6.1(5):361-365.

2.Phillips AN,Cambiano V,Miners A,et al.Effectiveness and Cost-effectiveness of potential responses to future high levels of Transmitted HIVdrug resistance in antiretroviral drug-naive Populations beginning treatment:modelling study and economic Analysis[J].Lancet HIV,2014,1(2):e85-93.DOI:10.1016/S2352-3018(14)70021-9

3.DeGruttola V,Dix L,D.Aquila R,et al.2000:The relation betweenbaseline HIV drug resistance and response to antiretroviral therapy:re-analysis of retrospective and prospective studies using a standardized dataanalysis plan.Antivir Ther,p.41-48.

4.Clutter DS,Jordan MR,Bertagnolio S,et al.HIV-1drug resistance Andresistance testing[J].Infect Genet Evol,2016,46:292-307.DOI:10.1016/j.Meegid.2016.08.031

5.HIV耐药基因变异现况研究石西南,张怀，黄德妤(医学综述2013年3月第19卷第6期Medical Recapitulate，Mar.2013，Vol.19，No.6)

序列表

<110> 中山大学达安基因股份有限公司

<120> 检测HIV-1基因PR区和RT区基因突变的试剂盒及方法

<130> 000014

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

ggacaggaag gacaccaaat g 21

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

gctatcaagt cttttgatgg gtcata 26

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

agarccaaca gccccrccag 20

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

cctgttttct gccaattcta aytctgc 27

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 5

ggagcagatg atacagtatt agaaga 26

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 6

aaattaaagc caggaatgga tgg 23

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 7

gatggaaagg atcaccagca atatt 25

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 8

ggagcagatg atacagtatt agaaga 26

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 9

aattttctct tctgtcaatg gcca 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 10

ccatttgtca ggatggagtt cata 24

<210> 11

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 11

attgcagggc ccctagg 17

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 12

attgttcttg gtaaatttga tatgtcca 28

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 13

aagggctgtt ggaaatgtgg a 21

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 14

ctgtatttca gctatcaagt cttttgatgg 30

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 15

ggaaatgtgg aaaggaagga c 21

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 16

ttcagctatc aagtcttttg atgg 24

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 17

acaaggggag gccagggaat 20

<210> 18

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 18

aaatttccct gttttctgcc aattcta 27

<210> 19

<211> 3000

<212> DNA

<213> 人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus)

<400> 19

ttttttaggg aaaatttggc cttcccacag ggggaggcca gggaatttcc tccagagcag 60

accagagcca acagccccgc cagcagagag cttcaggttc gaggagacaa ccccagctcc 120

gaggcaggaa ccgaaagaca gggaagcctt aactgccctc agatcactct ttggcagcga 180

ccccttgtct caataaaagt aggaggccag ataaaagagg ctctcttaga tacaggagca 240

gatgatacag tattagaaga aatagatttg ccaggaaaat ggaaaccaaa aatgatagga 300

ggaattggag gttttatcaa agtaagacaa tatgaacaaa tatctataga aatttgtgga 360

aaaaaggcta taggtacagt attagtggga cccacacctg tcaacataat tggaagaaat 420

atgttgaccc agcttggatg cacactaaat tttccaatca gtcccattga aactgtacca 480

gtaaaattaa agccaggaat ggatggccca aaagttaaac aatggccatt gacagaagag 540

aaaataaaag cattaacagc aatttgtgat gaaatggaga aggaaggaaa aattacaaaa 600

attgggcctg acaatccata taacactcca atatttgcca taaaaaagaa ggacagtact 660

aagtggagaa aattagtaga tttcagggaa ctcaataaaa gaactcaaga tttttgggaa 720

gtccaattag gaataccaca cccagcaggg ttaaaaaaga aaaagtcagt aacagtcctg 780

gatgtgggtg atgcatattt ctcagttcct ttagataaag acttcaggaa gtatactgca 840

tttaccatac ctagtgtaaa caatgagaca ccagggatta gatatcagta caatgtgctt 900

ccacagggat ggaaaggatc accagcaata ttccaatgta gcatgacaaa gatcttagag 960

ccttttagga aacaaaaccc agacatagtt atctatcaat acatggatga cttgtatgta 1020

ggatctgact tagaaatagg gcagcataga acaaaaatag aggaactgag agaacatctg 1080

ttaaagtggg gatttaccac accagacaag aaacatcaga aagaacctcc atttctttgg 1140

atggggtatg aactccatcc tgacaaatgg acagtacagc ctatacagct gccagaaaag 1200

gatagctgga ctgtcaatga tatacagaag ttagtgggaa aattaaactg ggcaagtcag 1260

atttacccag gaattaaagt aaagcaactt tgtagactcc ttaggggggc caaggcacta 1320

acagacatag taccactaac tgaagaagca gaattagaat tagcagaaaa cagggaaatt 1380

ttaaaagaac cagtacaggg agcatattat gacccatcaa aagaattgat agctgaaata 1440

cagaaacaag ggcaggacca atggacatat caaatttacc aagaaccatt taaaaatctg 1500

aaaacaggga agtatgcaaa aatgaggact gtccacacta atgatgtaag acagttaaca 1560

gaggctgtgc agaaaatagc catggaaagc atagtaatat ggggaaagat tcctaaattt 1620

agattaccaa tccagaaaga aacatgggag acatggtgga cagactattg gcaagccacc 1680

tggattcctg agtgggaatt tgttaatacc cctcccttag taaaattatg gtatcaactg 1740

gagaaagatc ccatagcagg agtagaaact ttctatgtag atggagcagc taatagggag 1800

actaaaatag ggaaagcagg gtatgttact gacagaggaa ggaagaaaat tgtttcccta 1860

actgaaacaa caaatcagaa gactgaattg caagcaattt atatagcttt gcaagattca 1920

ggatcagaag taaatatagt aacagattca cagtatgcat tagggatcat tcaagcacaa 1980

ccagataaga gtgaatcaga gttagttaac caaataatag aacaattaat aaaaaaggaa 2040

agggtctacc tgtcatgggt accagcacat aaaggaattg gaggaaatga acaagtagat 2100

aaattagtaa gtagtggcat caggaaagtg ctatttctag atggaataga taaagctcaa 2160

gaagagcatg aaaagtatca cagcaattgg aaagcaatgg ctagtgactt taatctgcca 2220

cccatagtag caaaagaaat agtagctagc tgtgatcaat gtcagctaaa aggggaagcc 2280

atgcatggac aagtagactg tagtccaggg atatggcaat tagattgtac acatttagaa 2340

ggaaaaatca ttctggtagc agtccatgta gccagtggct acatggaagc agaggttatc 2400

ccagcagaaa caggacaaga aacagcatac tttatattaa aattagcagg aagatggcca 2460

gtcaaagtaa tacatacaga caatggcagt aatttcacca gtgctgcagt taaggcagcc 2520

tgttggtggg caggtatccg acaggaattt ggaattccct acaatcccca aagtcaggga 2580

gtagtagaat ccatgaataa agaattaaag aaaattatag ggcaggtaag agatcaagct 2640

gagcacctta agacagcagt acaaatggca gtattcattc acaattttaa aagaaaaggg 2700

gggattgggg ggtacagtgc aggggaaaga atagtagaca taatagcaac agacatacaa 2760

actagagagc tacaaaaaca aattataaaa attcaaaatt ttcgggttta ttacagagac 2820

agcagagacc ccatttggaa aggaccagcc aaactactct ggaaaggtga aggggcagta 2880

gtaatacaag ataatagtga cataaaggta gtaccaagga ggaaagcaaa aatcattaag 2940

gactatggaa aacagatggc aggtgctgat tgtgtggcag gtagacagga tgaagattag 3000

Claims

1.一种用于检测HIV-1病毒pol基因PR区以及PT区突变的RT-PCR扩增引物对，其特征在于，所述RT-PCR扩增引物对包括：如SEQ ID NO.:1所示的RT-PCR上游引物；和，如SEQ IDNO.:2所示的RT-RCR下游引物。

2.一种用于检测HIV-1病毒pol基因PR区以及PT区突变的PCR扩增引物对，其特征在于，所述PCR扩增引物对包括：如SEQ ID NO.:3所示的PCR上游引物；和，如SEQ ID NO.:4所示的PCR下游引物。

3.一种用于检测HIV-1病毒pol基因PR区以及PT区突变的测序引物组，其特征在于，所述测序引物组包括选自下组的一种或多种测序引物：

测序引物Ⅰ：SEQ ID NO：5；

测序引物Ⅱ：SEQ ID NO：6；

测序引物Ⅲ：SEQ ID NO：7；

测序引物Ⅳ：SEQ ID NO：8；

测序引物Ⅴ：SEQ ID NO：9；和

测序引物Ⅵ：SEQ ID NO：10。

4.一种用于检测HIV-1基因PR区以及PT区突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的RT-PCR扩增引物对。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括权利要求2所述的PCR扩增引物对；和/或

所述试剂盒还包括权利要求3所述的测序引物组。

6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括突变型阳性对照，野生型阳性对照和阴性对照。

7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括选自下组的一种或多种组分：

RT-PCR酶系(包括热启动Taq酶、和逆转录酶)、PCR酶系(包括热启动Taq酶)、测序染料、测序反应液、和去离子甲酰胺。

8.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR引物，和/或所述PCR引物在反应体系中的最终浓度为0.2μmol/L；和/或

所述测序引物在反应体系中的终浓度为0.16μmol/L。

9.一种一代测序法检测HIV-1病毒pol基因PR区以及PT区突变的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(1)提供待检测对象的HIV-1RNA样本；

其中，所述RT-PCR扩增反应体系包括步骤(1)提供的所述RNA样本、和权利要求1所述的RT-PCR扩增引物对；

其中，所述PCR扩增反应体系包括步骤(2)获得的RT-PCR扩增反应产物、和权利要求2所述的所述的PCR扩增引物对；

(4)制备测序PCR扩增反应体系，并进行测序PCR扩增反应获得测序PCR扩增反应产物

其中，所述测序PCR扩增反应体系包括步骤(3)获得的PCR扩增反应产物、和权利要求3所述的测序引物组；

(5)对步骤(4)获得的测序PCR扩增反应产物进行测序。

10.如权利要求1所述的RT-PCR扩增引物对、和/或权利要求2所述的PCR扩增引物对、和/或权利要求3所述的测序引物组的用途，其特征在于，用于制备一代测序检测试剂盒，所述一代测序检测试剂盒用于检测HIV-1病毒pol基因PR区以及PT区基因突变。