CN113293202B - 一种定量检测机体中mRNA含量的实时荧光定量PCR试剂盒及检测方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种定量检测机体中mRNA含量的实时荧光定量PCR试剂盒及检测方法和应用，涉及mRNA检测技术领域。本发明所述试剂盒建立在RT‑PCR基础上，以mRNA作为标准品构建标准曲线，稀释的系列标准品溶液通过与待测样本同样的反转录、qPCR过程，更好的模拟样本检测过程，直观展示mRNA药物含量，减少质粒的构建工作，实现了生物样本中mRNA药物的快速、准确的定量检测，具有操作简单、灵敏度高、检测范围宽，特异性强等优点，可用于mRNA类药物临床前药物生物分布研究、临床研究生物样品检测和临床治疗患者的药物分布监测。

Description

一种定量检测机体中mRNA含量的实时荧光定量PCR试剂盒及 检测方法和应用

技术领域

本发明属于mRNA检测技术领域，具体涉及一种定量检测机体中mRNA含量的实时荧光定量PCR试剂盒及检测方法和应用。

背景技术

mRNA药物是近年来极具前景的分子治疗药物，在传染病预防、代谢性疾病、癌症和包括罕见病在内的多种疾病治疗领域均有巨大的应用潜力。mRNA药物的原理是基于mRNA指导蛋白合成的特性，经过必要化学修饰的mRNA，经由不同的递送系统进入细胞质中，利用细胞质内的自有核苷酸进行转录表达，生成机体所需要的蛋白质。由于mRNA药物具有不进入细胞核、不改变基因组、有瞬时活性、能通过生理代谢降解等优点，且生产成本低、开发的周期短、安全性高使得mRNA药物具有很大优势。但是至目前为止，尚未有mRNA药物得以经过美国FDA批准上市，多数mRNA药物仍处于临床研究阶段，mRNA药物的研发过程中，仍然需要建立系统的、完善的、稳定的检测分析和验证等技术方案，所使用的技术要求能特异性识别及检测不同来源的生物样本中mRNA药物的序列，截止目前尚未有商业化的试剂盒得以实现。传统的mRNA定量检测方法Northernblot、原位杂交等技术，由于操作复杂、具有放射性污染的可能、耗时长、灵敏度较低等缺点，并不适用于mRNA药物的定量检测。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种定量检测机体中mRNA含量的实时荧光定量PCR试剂盒及检测方法和应用，可实现生物样本中mRNA药物的快速、准确的定量检测。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种定量检测机体中mRNA含量的实时荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒包括：线性mRNA标准品，样本RNA提取试剂，线性mRNA标准品的特异性引物，反转录试剂和实时荧光定量PCR试剂。

优选的，所述反转录试剂的体系以10μL计，包括1μL 10×RT Mix，1μL SuperpuredNTPs，1μL Oligo-(dT)15，0.5μL Quant Reverse Transcriptase，1μL待测样本总RNA/线性mRNA标准品和余量的Nuclease-Free Water；

所述实时荧光定量PCR试剂的体系以10μL计，包括：5μL 2×SYBR Green Mix，2μLRTase Mix，0.2μL上游引物，0.2μL下游引物，1μL反转录产物和余量的Nuclease-FreeWater。

本发明还提供了上述试剂盒在制备定量检测机体中mRNA含量的工具中的应用。

优选的，利用所述工具检测机体中mRNA含量的方法包括实时荧光定量PCR。

本发明还提供了一种定量检测机体中mRNA含量的实时荧光定量PCR方法，包括以下步骤：利用Nuclease-Free Water稀释线性mRNA标准品，呈梯度浓度，得系列线性工作液；以所述系列线性工作液为模板，利用上述试剂盒中的反转录试剂进行反转录，得系列mRNA标准品cDNA；

分别以所述系列mRNA标准品cDNA和机体样本提取的RNA为模板为模板，利用上所述试剂盒中的实时荧光定量PCR试剂进行实时荧光定量PCR，利用所述系列mRNA标准品cDNA的数据建立标准曲线，利用所述标准曲线定量检测机体中mRNA含量；

所述标准曲线以Cp值为纵坐标，以所述系列线性工作液的浓度的对数为横坐标。

优选的，步骤(1)所述梯度浓度包括在0.01pg/μL～10000pg/μL的范围内设置梯度。

优选的，步骤(1)所述线性mRNA标准品的核苷酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列；

所述线性mRNA标准品的特异性引物包括mRNA-F1和mRNA-R1，所述mRNA-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述mRNA-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

优选的，步骤(3)所述实时荧光定量PCR的程序包括：预变性：95℃10min；

变性及退火延伸：95℃15sec，60℃20sec，70℃10sec，40个循环；

溶解曲线：95℃，15sec；70℃，30sec；95℃，保持。

优选的，步骤(4)所述机体样本包括脾脏、肾脏、脑、睾丸、小肠、骨髓、腹股沟淋巴结、注射局部肌肉或全血。

本发明还提供了上述试剂盒在制备以下(a)、(b)和(c)至少一种工具中的应用：

(a)mRNA类药物临床前药物生物分布研究的工具；

(b)临床研究生物样品检测的工具；

(c)临床治疗患者的药物分布监测的工具。

有益效果：本发明提供了一种定量检测机体中mRNA含量的实时荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒建立在RT-PCR基础上，以mRNA作为标准品构建标准曲线，与常规质粒为标准品方法相比，稀释的系列标准品溶液通过与待测样本同样的反转录、qPCR过程，更好的模拟样本检测过程，直观展示mRNA药物含量，减少质粒的构建工作，实现了生物样本中mRNA药物的快速、准确的定量检测。

本发明还提供了定量检测机体中mRNA含量的方法，2小时内快速检测生物样本mRNA药物含量，具有操作简单、灵敏度高、检测范围宽，特异性强等优点，可用于mRNA类药物临床前药物生物分布研究、临床研究生物样品检测和临床上治疗患者上的药物分布监测。

附图说明

图1为定量PCR检测猴体内mRNA药物浓度-Cp值拟合标准曲线图。

具体实施方式

本发明提供了一种定量检测机体中mRNA含量的实时荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒包括：线性mRNA标准品，样本RNA提取试剂，线性mRNA标准品的特异性引物，反转录试剂和实时荧光定量PCR试剂。

本发明所述线性mRNA标准品的序列优选与mRNA药物或mRNA疫苗中的mRNA序列相同。本发明对所述线性mRNA标准品的合成方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法合成所述线性mRNA即可；并基于所述线性mRNA的序列设计特异性引物，用以RT-PCR。在本发明实施例中，优选以SEQ ID NO.1所示的线性mRNA标准品为例，检测猴体内mRNA的含量。

本发明所述样本RNA提取试剂优选包括TRIzol Universal RNA Reagent。本发明所述反转录试剂的体系以10μL计，优选包括1μL 10×RT Mix，1μL Superpure dNTPs(2.5mMeach)，1μL Oligo-(dT)15，0.5μL Quant Reverse Transcriptase，1μL待测样本总RNA/线性mRNA标准品和余量的Nuclease-Free Water；所述实时荧光定量PCR试剂的体系以10μL计，优选包括：5μL 2×SYBR Green Mix，2μL RTase Mix，0.2μL上游引物，0.2μL下游引物，1μL反转录产物和余量的Nuclease-Free Water。

在本发明中，线性mRNA标准品的特异性引物在配制实时荧光定量PCR试剂的体系时，其上游引物和下游引物分别使用Nuclease-Free Water溶解至浓度为5nM储备液，再按10倍稀释后使用。

本发明还提供了上述试剂盒在制备定量检测机体中mRNA含量的工具中的应用。本发明利用所述工具检测机体中mRNA含量的方法优选包括实时荧光定量PCR，且所述实时荧光定量PCR的体系和程序优选与上述相同，在此不再赘述。

本发明还提供了一种定量检测机体中mRNA含量的实时荧光定量PCR方法，包括以下步骤：利用Nuclease-Free Water稀释线性mRNA标准品，呈梯度浓度，得系列线性工作液；以所述系列线性工作液为模板，利用上述试剂盒中的反转录试剂进行反转录，得系列mRNA标准品cDNA；

分别以所述系列mRNA标准品cDNA和机体样本提取的RNA为模板为模板，利用上所述试剂盒中的实时荧光定量PCR试剂进行实时荧光定量PCR，利用所述系列mRNA标准品cDNA的数据建立标准曲线，利用所述标准曲线定量检测机体中mRNA含量；

所述标准曲线以Cp值为纵坐标，以所述系列线性工作液的浓度的对数为横坐标。

本发明利用Nuclease-Free Water稀释线性mRNA标准品，呈梯度浓度，得系列线性工作液。本发明所述梯度浓度优选包括在0.01pg/μL～10000pg/μL的浓度范围内设置梯度，如在本发明实施例中，其设置梯度分别为0.01pg/μL、0.1pg/μL、1pg/μL、10pg/μL、100pg/μL、1000pg/μL和10000pg/μL。本发明以核苷酸序列为SEQ ID NO.1的线性mRNA为标准品为例进行说明，但是不能仅将其认定为本发明的保护范围。本发明还针对所述线性mRNA标准品设计特异性引物，包括mRNA-F1和mRNA-R1，所述mRNA-F1的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2所示(GCAACAGTGTGCGGACCTAA)，所述mRNA-R1的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.3所示(CGTCCGTCGTGTCAGCTATG)。

得系列线性工作液后，本发明以所述系列线性工作液为模板，利用上述试剂盒中的反转录试剂进行反转录，得系列mRNA标准品cDNA。本发明利用上述反转录体系进行反转录时，所述反转录体系优选为10μL，包括：1μL10×RT Mix，1μL Superpure dNTPs(2.5mMeach)，1μL Oligo-(dT)15，0.5μL Quant Reverse Transcriptase；检测未知样本时加入1μL待测样本总RNA，用Nuclease-Free Water补足至10μL，标曲构建时则加入1μL mRNA标准品，1μL空白食蟹猴全血RNA基质，用Nuclease-Free Water补足至10μL。本发明所述反转录优选为在37℃反应60min。本发明优选以Oligo-dT为反转录引物对稀释好的系列线性工作液、待测样品总RNA反转录，得到的cDNA使用Light Cycler480型实时荧光定量PCR仪进行qPCR检测。

得系列mRNA标准品cDNA后，本发明以所述系列mRNA标准品cDNA为模板，利用上述试剂盒中的实时荧光定量PCR试剂进行实时荧光定量PCR，以Cp值为纵坐标，以所述系列线性工作液的浓度的对数为横坐标，建立标准曲线。本发明所述实时荧光定量PCR的反应体系优选为10μL体系，包括5μL2×SYBR Green Mix，2μL RTase Mix，0.2μL上游引物，0.2μL下游引物，1μL反转录产物，用Nuclease-Free Water补足至10μL。本发明所述实时荧光定量PCR的程序优选包括：预变性：95℃10min；

变性及退火延伸：95℃15sec，60℃20sec，70℃10sec，40个循环；

溶解曲线：95℃15sec，70℃30sec，95℃保持。

在本发明中，优选用移液器移取适量mRNA标准品用Nuclease-Free Water配制系列浓度为0.01、0.1、1、10、100、1000、10000pg/μL的线性工作液，以Cp值为纵坐标，浓度的对数为横坐标，建立标准曲线，要求相关系数(R²)不小于0.99，PCR整体扩增效率在90％～110％之间，PCR整体扩增效率＝10^-1/k-1，k为斜率。

得标准曲线后，本发明以机体样本提取的RNA为模板，依次进行步骤(2)所述反转录和步骤(3)所述实时荧光定量PCR，利用所述标准曲线定量检测机体中mRNA含量。

本发明所述反转录的体系和程序以及实时荧光定量PCR的体系和程序优选与上述相同，在此不再赘述。本发明所述机体样本优选包括脾脏、肾脏、脑、睾丸、小肠、骨髓、腹股沟淋巴结、注射局部肌肉或全血。

本发明还提供了上述试剂盒在制备以下(a)、(b)和(c)至少一种工具中的应用：

(a)mRNA类药物临床前药物生物分布研究的工具；

(b)临床研究生物样品检测的工具；

(c)临床治疗患者的药物分布监测的工具。

本发明所述试剂盒在所述应用中的方法优选与上述相同，在此不再赘述。

下面结合实施例对本发明提供的一种定量检测机体中mRNA含量的实时荧光定量PCR试剂盒及检测方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1)本发明所需要试剂包括mRNA标准品(SEQ ID NO.1)、qPCR上下游引物(SEQ IDNO.2～SEQ ID NO.3)、TRIzol Universal RNA Reagent、Quantscript RT Kit Quant cDNA第一链合成试剂盒、氯仿、异丙醇、Nuclease-Free Water。

2)本发明的检测仪器为Light Cycler 480型实时荧光定量PCR仪，型号为LightCycler 480；基因扩增仪，型号为Life-Eco。

3)主要试剂配制：引物(5nM)使用Nuclease-Free Water溶解引物粉末至浓度为5nM储备液，再按10倍稀释后使用。

4)线性工作液及质控工作液配制：分别用移液器移取适量mRNA标准品用Nuclease-Free Water配制系列浓度为0.01、0.1、1、10、100、1000、10000pg/μL的线性工作液；用移液器移取适量mRNA标准品用Nuclease-Free Water配制QCH、QCM、QCL、LLOQ浓度为7500、75、0.3、0.1pg/μL的质控工作液。

5)建立反转录体系：反应体系为10μL，包括1μL 10×RT Mix，1μL SuperpuredNTPs(2.5mM each)，1μL Oligo-(dT)15，0.5μL Quant Reverse Transcriptase；检测未知样本时加入1μL待测样本总RNA，用Nuclease-Free Water补足至10μL，标曲构建时则加入1μL mRNA标准品，1μL空白食蟹猴全血RNA基质，用Nuclease-Free Water补足至10μL。

6)建立qPCR反应体系：反应体系为10μL，包括5μL2×SYBR Green Mix，2μL RTaseMix，0.2μL上游引物，0.2μL下游引物，1μL反转录产物，用Nuclease-Free Water补足至10μL。

7)方法学验证：标准曲线：用移液器移取适量mRNA标准品用Nuclease-Free Water配制系列浓度为0.01、0.1、1、10、100、1000、10000pg/μL的线性工作液，以Cp值为纵坐标，浓度的对数为横坐标，建立标准曲线，要求相关系数(R²)不小于0.99，PCR整体扩增效率在90％～110％之间，PCR整体扩增效率＝10^-1/k-1，k为斜率。

精密度与准确度：用移液器移取适量mRNA标准品用Nuclease-Free Water配制QCH、QCM、QCL、LLOQ浓度为7500、75、0.3、0.1pg/μL的质控工作液，在6个分析批中运行质控样本，每批4个浓度水平(QCH，QCM，QCL和LLOQ)，每浓度水平各5个质控样本。6个分析批由至少2人于多日内完成。要求低、中、高浓度质控样本批内及批间的变异系数(CV％)小于10％，定量下限样本CV％小于15％，计算各样本准确度(实测值的平均值/理论值×100％)，准确度在50～200％合格。

耐用性：提取空白食蟹猴肝脏总RNA，稀释为50ng/μL作为空白肝脏RNA基质。另使用Nuclease-Free Water作为0μg/μL基质。分别将阳性对照样本(QCH、QCL)、阴性对照样本(Nuclease-Free Water)与不同基质混合进行反转录，然后进行荧光定量PCR检测，样本准确度在50～200％内，阴性对照Cp值大于LLOQ或无Cp值，视为基质浓度对检测方法无影响。

特异性：①：空白食蟹猴全血RNA与75pg/μL的标准品；②：空白食蟹猴全血RNA中加入与标准品等体积Nuclease-FreeWater。对①②进行反转录，然后进行qPCR检测。考察该方法对质粒标准品的特异性。要求反应①的Cp值小于定量检测下限(LLOQ)的Cp值，反应②的Cp值大于标准曲线的LLOQ的Cp值或无Cp值。

稳定性：提取空白食蟹猴全血、肝脏RNA并稀释为50ng/μL，将空白食蟹猴全血、肝脏RNA与低、高浓度mRNA标准品(QCH、QCL)混合进行反转录，得到的cDNA作为稳定性样本1、2、3、4，每个样本3个平行，保存于-60℃以下，并按每次使用量进行分装，样本回收率在50～200％视为稳定。

由表1及图1可知，标准曲线PCR整体扩增效率在99.81～106.28％之间，各检测批次的标准曲线相关系数(R²)均不小于0.9961，符合接受标准。

表1标准曲线验证结果

注：NA表示无结果

精密度与准确度结果见表2，在6个分析批中运行质控样本QCH、QCM、QCL、LLOQ，对于批内变异系数(CV％)，6个批次样本CV％均不大于3.72％，各质控样品批内精密度符合接受标准。对于批间变异系数(CV％)，4个浓度CV％均不大于9.49％，各质控样品批间精密度符合接收标准。

对于准确度，6个批次样本准确度在69.59％～183.79％之间，各质控样品符合接受标准。

表2精密度与准确度验证结果

耐用性结果见表3，以Nuclease-Free Water(0μg/μL)作为基质的耐用性样本QCH-1、QCL-1、NTC-1，阴性对照NTC-1无Cp值，提示Nuclease-Free Water对检测方法无影响，QCH-1、QCL-1准确度在89.83％～123.06％之间，符合接受标准。以空白食蟹猴肝脏RNA作为基质耐用性样本QCH-2、QCL-2、NTC-2，阴性对照NTC-2无Cp值，提示空白食蟹猴肝脏RNA对检测方法无影响，QCH-2、QCL-2准确度在112.43％～130.60％之间，符合接受标准。

表3耐用性验证结果

注：NA表示无结果。

特异性结果见表4，样本1、2分别为空白食蟹猴全血RNA与75pg/μL的标准品混合、空白食蟹猴全血RNA与Nuclease-Free Water混合，结果显示样本1反应Cp值小于特异性标准曲线定量检测下限STD1 Cp值，样本2反应Cp值高于STD1 Cp值，提示本试验方法对质粒标准品具有特异性。

表4特异性验证结果

稳定性样本验证结果见表5，稳定性样本1、2、3、4分别为空白食蟹猴全血、肝脏的RNA与低、高浓度标准品(QCH、QCL)混合进行反转录得到的cDNA，样本于配制后立即进行qPCR检测，回收率在99.09％～157.03％之间，符合接受标准；于2～8℃下放置4小时后进行qPCR检测，回收率在85.17％～162.63之间，符合接受标准；于-60℃下放置一周后进行qPCR检测，回收率在56.99％～129.62％之间，符合接受标准。提示样本于2～8℃下放置4小时；-60℃及以下放置一周稳定性良好。

表5稳定性验证结果

方法学验证结果显示，方法标准曲线、精密度和准确度、耐用性、特异性、稳定性均符合接受标准。经验证后，由本方法能成功检测组织中如脾脏、肾脏、脑、睾丸、小肠、骨髓、腹股沟淋巴结、注射局部肌肉及全血中mRNA疫苗浓度，在腹股沟淋巴结中检测到mRNA疫苗浓度最高为1.49pg/μL。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 广东莱恩医药研究院有限公司

<120> 一种定量检测机体中mRNA含量的实时荧光定量PCR试剂盒及检测方法和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1521

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

aagcacaagg accacgacga cggggaccac ucgucgguca cgcacuugga cuggugggcc 60

ugggucgacg gggggcggau gugguugucg aagugggccc cgcacaugau ggggcuguuc 120

cacaaggccu cgucgcacga cgugucgugg guccuggaca aggacgggaa gaagucguug 180

cacuggacca aggugcggua ggugcacucg ccgugguugc cgugguucgc caagcuguug 240

gggcacgacg ggaaguugcu gccgcacaug aagcggucgu ggcucuucuc guuguaguag 300

gccccgaccu agaagccgug gugggaccug ucguucuggg ucucggacga cuagcacuug 360

uugcgguggu ugcaccacua guuccacacg cucaagguca agacguugcu ggggaaggac 420

ccgcacauga ugguguucuu guuguucucg accuaccucu cgcucaaggc ccacaugucg 480

ucgcgguugu ugacguggaa gcucaugcac ucggucggga aggacuaccu ggaccucccg 540

uucgucccgu ugaaguucuu ggacgcccuc aagcacaagu ucuuguagcu gccgaugaag 600

uucuagaugu cguucgugug gggguaguug gaccacgccc uggacggggu cccgaagucg 660

cgggaccucg gggaccaccu ggacggguag ccguaguugu agugggccaa ggucugggac 720

gaccgggacg uggccucgau ggacuggggg ccgcugucgu cgucgccgac cuggcggccg 780

cggcggcgga ugaugcaccc gauggacguc ggggccugga aggacgacuu cauguugcuc 840

uugccguggu aguggcugcg gcaccugacg cgggaccugg gggacucgcu cugguucacg 900

ugggacuucu cgaaguggca ccucuucccg uagauggucu ggucguugaa ggcccacguc 960

ggguggcucu cguagcacgc caagggguug uagugguugg acacggggaa gccgcuccac 1020

aaguugcggu gggccaagcg gucgcacaug cggaccuugg ccuucgccua gucguugacg 1080

caccggcuga ugucgcacga cauguugucg cggucgaagu cguggaaguu cacgaugccg 1140

cacucggggu gguucgacuu gcuggacacg aagugguugc acaugcggcu gucgaagcac 1200

uaggccccgc ugcuccacgc cgucuagcgg gggccggucu ggccguucua gcggcugaug 1260

uugauguucg acgggcugcu gaaguggccg acgcacuagc ggaccuuguc guuguuggac 1320

cugucguucc acccgccguu gauguugaug gacauggccg acaaggccuu cucguuggac 1380

uucgggaagc ucgcccugua gucguggcuc uagauggucc ggccgucgug ggggacguug 1440

ccgcaccucc cgaaguugac gaugaagggg gacgucucga ugccgaaggu cgggugguug 1500

ccgcacccga uggucgggau g 1521

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

gcaacagtgt gcggacctaa 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

cgtccgtcgt gtcagctatg 20

Claims (4)

1.一种定量检测机体中mRNA疫苗含量的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：利用Nuclease-Free Water稀释线性mRNA标准品，呈梯度浓度，得系列线性工作液；以所述系列线性工作液为模板，利用试剂盒中的反转录试剂进行反转录，得系列mRNA标准品cDNA；所述试剂盒包括：线性mRNA标准品、样本RNA提取试剂、线性mRNA标准品的特异性引物、反转录试剂和实时荧光定量PCR试剂；

分别以所述系列mRNA标准品cDNA和机体样本提取的RNA为模板，利用试剂盒中的实时荧光定量PCR试剂进行实时荧光定量PCR，利用所述系列mRNA标准品cDNA的数据建立标准曲线，利用所述标准曲线定量检测机体中mRNA疫苗的含量；

所述标准曲线以Cp值为纵坐标，以所述系列线性工作液的浓度的对数为横坐标；

所述线性mRNA标准品的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述线性mRNA标准品的特异性引物包括mRNA-F1和mRNA-R1，所述mRNA-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述mRNA-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度浓度包括在0.01pg/μL~10000pg/μL范围内设置梯度。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的程序包括：预变性：95℃ 10min；

变性及退火延伸：95℃ 15sec，60℃ 20sec，70℃ 10sec，40个循环；

溶解曲线：95℃ 15sec；70℃ 30 sec；95℃ 保持。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述机体样本包括脾脏、肾脏、脑、睾丸、小肠、骨髓、腹股沟淋巴结、注射局部肌肉或全血。

Images