CN106754903A - 一种用于人类线粒体的全基因组扩增的引物对及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于人类线粒体的全基因组扩增的引物，所述引物对如下：mtDNA‑F：ACTTTTAACCAGTGAAATTGACCTGCC；mtDNA‑R：AAGAGACAGCTGAACCCTCGTGG。采用本发明的引物进行全环扩增的方法相较于分段扩增，采用全环扩增的方法，优势是检测点突变的同时，可以发现线粒体DNA的大片段重复和缺失。
Description
技术领域
本发明涉及基因扩增技术，尤其涉及一种人类线粒体的全基因组扩增方法。
背景技术
线粒体DNA(mtDNA)是细胞的第二套遗传物质。人类的mtDNA共16569个核苷酸，呈双链环状，其中有37个基因，编码13种蛋白质。
mtDNA突变率高于核DNA，并且缺乏修复能力。mtDNA突变会引起一系列遗传病，例如Leber遗传性视神经病(LHON)、肌阵挛性癫痫伴碎红肌纤维病(MERRF)等。通过选择合适的引物，对线粒体基因组全环进行扩增和测序，以寻找可能的致病性mtDNA突变。
选用多对引物对线粒体基因组全环进行扩增的技术存在以下缺陷：首先，核基因组中存在线粒体假基因，若引物扩增区域较短，引物极易与核基因组DNA结合，造成非特异扩增，实验结果无法排除假基因的干扰；其次，部分遗传病是由mtDNA大片段重复或缺失造成的，若选用多对引物扩增，得到的数个DNA片段无法进行重复或缺失的分析，无法准确辅助诊断病因。
发明内容
针对现有技术存在的问题，为了覆盖mtDNA全长，准确读取变异信息，并有效排除假基因的干扰，本发明提供一种人类线粒体的全基因组扩增方法，使用一对引物代替多对引物对mtDNA全环进行扩增。
本发明的目的是通过以下方案实现：
一种用于人类线粒体的全基因组扩增的引物对，所述引物对如下：
mtDNA-F：ACTTTTAACCAGTGAAATTGACCTGCC；
mtDNA-R：AAGAGACAGCTGAACCCTCGTGG。
本发明的另一方面为一种人类线粒体的全基因组扩增方法，采用上述引物对，以人全基因DNA为模板，进行PCR扩增,产物用琼脂糖凝胶电泳检测。
优选地，所述PCR扩增时，PCR反应体系为：
优选地，所述PCR扩增时，退火温度为68-69℃。
优选地，所述PCR扩增时，PCR反应条件为94℃预变性1分钟；98℃变性10秒，68℃退火延伸16分钟，45个循环；72℃再延伸10分钟。
优选地，所述琼脂糖凝胶为1.2％琼脂糖凝胶。
优选地，所述人全基因DNA采用如下步骤提取：
(1)分装400μL红细胞裂解液到1.5mL离心管，加入200μL全血，混匀；56℃孵育10min；
(2)13000g离心1min，弃上清液，加入200μL红细胞裂解液，混匀后加入10μLProtease K，混匀；
(3)13000g离心1min，将上清液转移至干净的1.5mL离心管中，加入400μL异丙醇，混匀，混匀后可看到DNA沉淀析出；
(4)13000g离心1min，弃上清，加入400μL 70％乙醇漂洗沉淀；重复操作一次；
(5)开盖使乙醇完全挥发，加入100μL DNase/RNase-Free去离子水使沉淀完全溶解。
(6)使用分光光度计检测DNA浓度和纯度。
优选地，所述人全基因DNA提取的步骤(6)中DNA浓度和纯度如下表所示：
有益效果：
mtDNA中存在保守序列，根据保守序列设计引物，即可得到人mtDNA全序列的通用扩增引物。由于mtDNA是环状的，根据mtDNA中的保守序列设计一对引物，进行长片段PCR扩增，即可得到mtDNA全序列。
将使用此引物扩增的PCR产物进行纯化后构建文库，使用illumina测序平台进行测序，得到的序列拼接后与GeneBank中一致，证实为人线粒体环基因组全序列。
本发明的人类线粒体的全基因组扩增方法相较于分段扩增，采用全环扩增的方法，优势是检测点突变的同时，可以发现线粒体DNA的大片段重复和缺失。线粒体DNA全基因组的扩增很大程度上依赖引物设计的优良与否，本发明提供了一种特定引物对，减少了人类线粒体DNA序列测序时大量消耗的引物设计和优化时间，提高了扩增的准确性及扩增效率。
附图说明
图1是不同样本使用琼脂糖凝胶电泳检测的结果图示；
A1-B4为八例不同的血液样本，其中A3和A4样本患者具有Kearns-Sayre综合征临床表现。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明进行详细的解释。
提取人全基因DNA采用如下步骤：
(1)分装400μL红细胞裂解液(天根生化科技有限公司血液基因组DNA提取试剂盒组分)到1.5mL离心管，加入200μL全血，混匀；56℃孵育10min；
(2)13000g离心1min，弃上清液，加入200μL红细胞裂解液，混匀后加入10μLProtease K(天根生化科技有限公司)，混匀；
(3)13000g离心1min，将上清液转移至干净的1.5mL离心管中，加入400μL异丙醇，混匀，混匀后可看到DNA沉淀析出；
(4)13000g离心1min，弃上清，加入400μL 70％乙醇漂洗沉淀；重复操作一次；
(5))开盖使乙醇完全挥发，加入100μL DNase/RNase-Free去离子水(天根生化科技有限公司)使沉淀完全溶解。
(6)使用分光光度计检测DNA浓度和纯度，其记录结果如下表所示：
一种人类线粒体的全基因组扩增方法，采用的引物对如下：
mtDNA-F：ACTTTTAACCAGTGAAATTGACCTGCC；
mtDNA-R：AAGAGACAGCTGAACCCTCGTGG
以上述方法提取的人全基因DNA为模板，进行PCR扩增,产物用琼脂糖凝胶电泳检测；所述琼脂糖凝胶为1.2％琼脂糖凝胶。
所述PCR扩增时，PCR反应体系为：
所述PCR扩增时，PCR反应条件为：
| 步骤 | 循环数 | 温度(℃) | 时间 |
| 1 | 1 | 94 | 1minute |
| 2 | 45 | 98 | 10seconds |
| 68 | 16minutes | ||
| 3 | 1 | 72 | 10minutes |
| 4 | 1 | 4 | Hold |
即，所述PCR扩增时，PCR反应条件为94℃预变性1分钟；98℃变性10秒，68℃退火延伸16分钟，45个循环；72℃再延伸10分钟。
如图1所示，mtDNA全长16569bp，图1中A1左侧为mtDNA标准Maker,A1，A2，B1-4共6例样本扩增产物均约为16kb，与mtDNA理论片段大小相符。A3和A4样本扩增产物片段明显小于16kb，经PCR产物纯化，构建文库并使用illumina平台测序，将测序结果与GeneBank比对后证实这两例样本分别存在9131bp和9546bp缺失，与临床初步诊断两位患者患有Kearns-Sayre综合征相符。约90％的Kearns-Sayre综合征患者由线粒体DNA缺失突变引起，缺失范围为1.1-10kb。
反应时间为16分钟这是片段长度(16569bp)决定的，改变延伸时间，会导致得到的片段不是正确的结果。申请人尝试过改变退火温度，只有当退火温度为68℃，扩增成功率最高，约为90％；当退火温度为69℃时，扩增成功率约为80％，其他温度均远远低于70％(此处比例不合适，请发明人根据实际情况进行修改)，不利于本申请目的的实现。
本申请的方法在试验过程中，根据不同的保守序列，共设计3对引物。除本发明所述引物外，另两对引物序列如下：
hmtF:AACCAAACCCCAAAGACACC；
hmtR:TTTATGGGGTGATGTGAGCC。
1-mtF:CCTACAAGCCTCAGAGTACTTCGAGTCT；
1-mtR:AGATGCCGTCGGAAATGGTGAAGGG。
选取多例人基因组DNA样本，使用设计的3对引物进行扩增，扩增使用的PCR反应体系和反应条件与本发明一致。扩增产物使用1.2％琼脂糖凝胶电泳进行检测。电泳检测16000bp左右有明显条带，无其他的非特异性扩增片段视为扩增成功。使用hmtF/hmtR引物对扩增成功率约为60％-70％，使用1-mtF/1-mtR引物对扩增成功率低于50％，使用mtDNA-F/mtDNA-R引物对扩增成功率约为90％。因此，申请人选定了mtDNA-F/mtDNA-R引物对作为本申请所述技术方案的引物对。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
<110> 北京信诺佰世医学检验所有限公司
<120> 一种人类线粒体的全基因组扩增方法
<130> 101577
<160> 6
<170> Premier primer 5.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acttttaaccagtgaaattgacctgcc
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
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<212> DNA
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tttatggggtgatgtgagcc
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cctacaagcctcagagtacttcgagtct
<210> 6
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
agatgccgtcggaaatggtgaaggg
Claims (8)
1.一种用于人类线粒体的全基因组扩增的引物对，其特征在于，所述引物对如下：
mtDNA-F：ACTTTTAACCAGTGAAATTGACCTGCC；
mtDNA-R：AAGAGACAGCTGAACCCTCGTGG。
2.一种人类线粒体的全基因组扩增方法，其特征在于，采用权利要求1所述的引物对，以人全基因DNA为模板，进行PCR扩增,产物用琼脂糖凝胶电泳检测。
3.根据权利要求2所述的人类线粒体的全基因组扩增方法，其特征在于，所述PCR扩增时，PCR反应体系为：
4.根据权利要求2所述的人类线粒体的全基因组扩增方法，其特征在于，所述PCR扩增时，退火温度为68-69℃。
5.根据权利要求2所述的人类线粒体的全基因组扩增方法，其特征在于，所述PCR扩增时，PCR反应条件为94℃预变性1分钟；98℃变性10秒，68℃退火延伸16分钟，45个循环；72℃再延伸10分钟。
6.根据权利要求2所述的人类线粒体的全基因组扩增方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶为1.2％琼脂糖凝胶。
7.根据权利要求2所述的人类线粒体的全基因组扩增方法，其特征在于，所述人全基因DNA采用如下步骤提取：
(1)分装400μL红细胞裂解液到1.5mL离心管，加入200μL全血，混匀；56℃孵育10min；
(2)13000g离心1min，弃上清液，加入200μL红细胞裂解液，混匀后加入10μL ProteaseK，混匀；
(3)13000g离心1min，将上清液转移至干净的1.5mL离心管中，加入400μL异丙醇，混匀，混匀后可看到DNA沉淀析出；
(4)13000g离心1min，弃上清，加入400μL 70％乙醇漂洗沉淀；重复操作一次；
(5)开盖使乙醇完全挥发，加入100μL DNase/RNase-Free去离子水使沉淀完全溶解；
(6)使用分光光度计检测DNA浓度和纯度。
8.根据权利要求7所述的人类线粒体的全基因组扩增方法，其特征在于，所述人全基因DNA提取的步骤(6)中DNA浓度和纯度如下表：
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|---|---|---|---|
| CN201611181782.9A CN106754903A (zh) | 2016-12-20 | 2016-12-20 | 一种用于人类线粒体的全基因组扩增的引物对及方法 |
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| CN201611181782.9A CN106754903A (zh) | 2016-12-20 | 2016-12-20 | 一种用于人类线粒体的全基因组扩增的引物对及方法 |
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|---|---|
| CN (1) | CN106754903A (zh) |
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| CN112301098A (zh) * | 2020-10-22 | 2021-02-02 | 深圳市卫生健康发展研究中心 | 人线粒体dna全序列扩增的方法以及用于人线粒体dna全序列扩增的试剂盒 |
| WO2023108865A1 (zh) * | 2021-12-14 | 2023-06-22 | 迈基诺（重庆）基因科技有限责任公司 | 用于检测线粒体环基因突变的引物对、试剂盒及检测方法 |
-
2016
- 2016-12-20 CN CN201611181782.9A patent/CN106754903A/zh active Pending
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| WO2023108865A1 (zh) * | 2021-12-14 | 2023-06-22 | 迈基诺（重庆）基因科技有限责任公司 | 用于检测线粒体环基因突变的引物对、试剂盒及检测方法 |
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