CN106520945A - 一种基于二代测序平台的无创的靶向线粒体测序方法 - Google Patents

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赵晓芳
吴卫卫
曹红
朱天媛
侯正强
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

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Abstract

本发明公开一种基于二代测序平台的无创的靶向线粒体测序方法，包括以下步骤：制备样本切片并染色；激光显微切割捕获线粒体；通过激光显微切割捕获的线粒体组织为1‑200个；DNA提取；PCR扩增及产物检测；文库构建及质检；上机测序及结果分析。本发明通过特异性染色技术，将线粒体组织着色，利用激光显微切割技术，靶向获取线粒体基因组，通过微量DNA提取、扩增技术，得到线粒体基因组用于下游的文库构建及检测；实验设计严谨、实验流程简单，检测结果精准、可靠，能够不同程度满足科研及临床检测的需求，适用于科研和临床针对线粒体相关的突变快速检测，有助于临床疾病的正确诊断和分类。

Description

一种基于二代测序平台的无创的靶向线粒体测序方法
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种基于二代测序平台的无创的靶向线粒体测序方法。
背景技术
线粒体基因组(mitochondrial DNA，mtDNA)呈闭合双链环状结构，长度为16569bp，分为编码区和非编码区。编码区共37个基因，这37个基因中有22个编码转移核糖核酸(tRNA)、2个编码核糖体核糖核酸(12S和16SrRNA)、13个编码多肽。mtDNA基因排列紧密，序列间没有内含子。
mtDNA有独特的母系遗传特性，一般认为mtDNA随母本的卵细胞传递给后代；mtDNA在细胞中的拷贝数很高，一个细胞中往往含有高达数千个mtDNA拷贝，mtDNA具有较高的突变率，大量研究显示mtDNA突变频率较核基因组高10倍以上，突变的mtDNA与野生型的mtDNA可以同时存在一个细胞内发挥不同的生物学功能能，多数mtDNA突变都为有害突变，mtDNA突变导致的临床表型极为广泛，几乎涉及到所有的组织和器官，mtDNA突变带来的危害存在剂量效应，轻微的突变并不出现典型的临床症状，给临床诊断带来了极大的困难，很多线粒体疾病无法得到确诊，故线粒体基因组的准确检测具有重要的临床指导意义。
传统的线粒体基因检测方法主要包括：PCR-RFLP、AS-PCR和DNA一代测序、芯片方法等，这些方法在基因突变检测中起了重要作用，但普遍存在着明显的不足，临床上常针对mtDNA的检测，还仅集中在对少数常见的线粒体基因位点进行突变和缺失筛查，如对线粒体相关性糖尿病常见突变A3243G的筛查，阳性检出率低，大多数患者难以获得准确的病因诊断；另外线粒体病具有量效现象，即小量的线粒体DNA突变可能不出现临床症状，随着突变线粒体比例增高，出现临床表现，且临床严重程度可能和突变比例成正相关，目前常用的检测方法对于低剂量的线粒体突变都不能很好的检测，如果用传统的方法检测会出现很多漏检的现象；另外传统的检测方法检测基因位点有限、耗时长、操作繁琐等，不适用于大批量、系统检测；线粒体疾病检测中，最难以攻克的问题就是检测结果假阳性高，其主要原因就是基因组的干扰，导致结果不能自动化分析，给线粒体疾病的临床诊断带来困难。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供一种精准、无创、快速、检测流程简单的基于二代测序平台的无创的靶向线粒体测序方法。
本发明的技术方案如下：
一种基于二代测序平台的无创的靶向线粒体测序方法，包括以下步骤：
步骤a、制备样本切片并染色；所述样本包括血液、组织；所述染色包括HE染色、健那绿染色；
步骤b、激光显微切割捕获线粒体；通过激光显微切割捕获的线粒体组织为1-200个；
步骤c、DNA提取；
步骤d、PCR扩增及产物检测；
步骤e、文库构建及质检；所述文库构建包括DNA超声波打断；末端修复和纯化DNA；连接接头和纯化连接的DNA；文库扩增、纯化及质控；
步骤f、上机测序及结果分析；将构建好的文库在二代测序平台上进行测序，读长250bp，要求测序深度达到3000×，每个样本产生约90M的数据量；测序数据经过信息分析得到线粒体全基因组序列资料，与线粒体参考序列比对，即可获得样本线粒体序列变异信息，包括点突变、缺失、插入等变异情况。
优选地，所述二代测序平台包括Ion Torrent测序平台、Illumina平台的Hiseq/Miseq/Nextseq、ABI SOLiD、Roche454和单分子测序平台。
优选地，所述步骤a中的样本为无创采样获得的口腔上皮组织；所述步骤a中的染色为健那绿染色。
优选地，所述步骤b中通过激光显微切割捕获的线粒体组织为20-50个
本发明的有益效果是通过特异性染色技术，将线粒体组织着色，利用激光显微切割技术，靶向获取线粒体基因组，通过微量DNA提取、扩增技术，得到线粒体基因组用于下游的文库构建及检测；本发明所述方法实现了无创样本(口腔黏膜细胞样品)的检测；该方法实验设计严谨、实验流程简单，检测结果精准、可靠，能够不同程度满足科研及临床检测的需求，适用于科研和临床针对线粒体相关的突变快速检测，有助于临床疾病的正确诊断和分类，早发现病人，早预防，早治疗。
附图说明
图1是本发明所述基于二代测序平台的无创的靶向线粒体测序方法的流程图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
如图所示，本发明公开一种基于二代测序平台的无创的靶向线粒体测序方法，包括以下步骤：
步骤a、制备样本切片并染色；所述样本包括血液、组织；所述染色包括HE染色、健那绿染色；
步骤b、激光显微切割捕获线粒体；通过激光显微切割捕获的线粒体组织为1-200个；
步骤c、DNA提取；
步骤d、PCR扩增及产物检测；
步骤e、文库构建及质检；所述文库构建包括DNA超声波打断；末端修复和纯化DNA；连接接头和纯化连接的DNA；文库扩增、纯化及质控；
步骤f、上机测序及结果分析；将构建好的文库在二代测序平台上进行测序，读长250bp，要求测序深度达到3000×，每个样本产生约90M的数据量；测序数据经过信息分析得到线粒体全基因组序列资料，与线粒体参考序列比对，即可获得样本线粒体序列变异信息，包括点突变、缺失、插入等变异情况。
优选地，所述二代测序平台包括Ion Torrent测序平台、Illumina平台的Hiseq/Miseq/Nextseq、ABI SOLiD、Roche454和单分子测序平台。
优选地，所述步骤a中的样本为无创采样获得的口腔上皮组织；所述步骤a中的染色为健那绿染色。
优选地，所述步骤b中通过激光显微切割捕获的线粒体组织为20-50个
实施例一：口腔上皮组织样本的线粒体测序方法
步骤a、制备样本切片并染色；准备：将口腔拭子置于0.5ml的TES溶液中，晃动棉签使口腔拭子上的细胞脱落，取出棉签，涡旋混匀；涂片：吸取样本准备液10μl，涂于膜片上，室温晾干；利用1％健那绿染液，将口腔上皮细胞切片染色；
步骤b、激光显微切割捕获线粒体；将玻片置于显微切割仪的载物台上相应位置，10倍镜下寻找细胞汇集区，将该区域设置为切割目标范围，在高倍镜下，精准切割蓝绿色的线粒体；切割完毕后，下降玻片上方的epp管盖至膜片切割部位表面，吸附切割目标，完成一次切割，重复操作5-50次，完成线粒体的收集；切割完毕后，盖上epp管，4℃保存；
步骤c、DNA提取；利用磁珠，提取切割的线粒体样本DNA基因组；
步骤d、PCR扩增及产物检测；利用微量样本DNA扩增试剂盒(QIAGEN)，将扩增步骤提取的DNA基因组产物扩增；PCR产物纯化，利用磁珠，行PCR产物纯化；PCR产物质检，利用Qubit检测纯化产物浓度；PCR产物片段化及浓缩，利用超声打断仪，将线粒体基因组DNA随机打断，条带小于800bp，主带集中在300bp；利用磁珠法，将片段纯化；
步骤e、文库构建及质检；利用“DNA Seq Library Preparation Kit”，完成线粒体DNA文库的构建，具体流程包括：末端修复及纯化；两端加街头及纯化；文库扩增及纯化；利用Qubit检测线粒体DNA基因组文库的浓度；
步骤f、上机测序及结果分析；将线粒体DNA文库，通过IonTorrent测序平台进行测序；数据量等于传统测序的3000次克隆测序的覆盖，测序的深度保证结果的准确性，可以测出比例非常低的突变位点，为筛查线粒体DNA突变相关性疾病提供一种非常先进的方法，测序数据经过信息分析得到线粒体全基因组序列资料，与线粒体参考序列(序列号NC_012920)比对，即可获得样本线粒体序列变异信息，包括点突变、缺失、插入等变异情况。
本发明通过特异性染色技术，将线粒体组织着色，利用激光显微切割技术，靶向获取线粒体基因组，通过微量DNA提取、扩增技术，得到线粒体基因组用于下游的文库构建及检测；本发明所述方法实现了无创样本(口腔黏膜细胞样品)的检测；该方法实验设计严谨、实验流程简单，检测结果精准、可靠，能够不同程度满足科研及临床检测的需求，适用于科研和临床针对线粒体相关的突变快速检测，有助于临床疾病的正确诊断和分类，早发现病人，早预防，早治疗。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (4)

1.一种基于二代测序平台的无创的靶向线粒体测序方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤a、制备样本切片并染色；所述样本包括血液、组织；所述染色包括HE染色、健那绿染色；
步骤b、激光显微切割捕获线粒体；通过激光显微切割捕获的线粒体组织为1-200个；
步骤c、DNA提取；
步骤d、PCR扩增及产物检测；
步骤e、文库构建及质检；所述文库构建包括DNA超声波打断；末端修复和纯化DNA；连接接头和纯化连接的DNA；文库扩增、纯化及质控；
步骤f、上机测序及结果分析；将构建好的文库在二代测序平台上进行测序，读长250bp，要求测序深度达到3000×，每个样本产生约90M的数据量；测序数据经过信息分析得到线粒体全基因组序列资料，与线粒体参考序列比对，即可获得样本线粒体序列变异信息，包括点突变、缺失、插入等变异情况。
2.根据权利要求书1所述的基于二代测序平台的无创的靶向线粒体测序方法，其特征在于：所述二代测序平台包括Ion Torrent测序平台、Illumina平台的Hiseq/Miseq/Nextseq、ABI SOLiD、Roche454和单分子测序平台。
3.根据权利要求书1所述的基于二代测序平台的无创的靶向线粒体测序方法，其特征在于：所述步骤a中的样本为无创采样获得的口腔上皮组织；所述步骤a中的染色为健那绿染色。
4.根据权利要求书1所述的基于二代测序平台的无创的靶向线粒体测序方法，其特征在于：所述步骤b中通过激光显微切割捕获的线粒体组织为20-50个。
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