发明内容
本发明目的是针对以上要解决的技术问题,提供一种准确、快速、检测流程简单的检测线粒体DNA序列的方法。
为此,本发明公开了一种基于高通量基因测序无创检测线粒体DNA的方法,该方法步骤如下:
(1)提取口腔细胞总基因组DNA;
(2)设计PCR引物及体外富积扩增线粒体DNA:设计两对PCR扩增引物,对抽提出来的总基因组DNA进行完整的线粒体DNA体外富积扩增;扩增产物的长度分别为9391bps和7287bps,此时扩增产物能够覆盖整条完整的mtDNA序列;第一对PCR引物序列为:
F70655'-GCCATCATAGGAGGCTTCATTCAC-3',
R164555'-CGGAGCGAGGAGAGTAGCACTCTT-3',
扩增线粒体DNA的位点7065/16455区域,扩增产物长度为9391bps;
第二对PCR引物序列为:
F163945'-CCTTGACCACCATCCTCCGTGAA-3',
R71115'-TAGCCTGAGAATAGGGGAAATCAGT-3'
扩增线粒体DNA的位点16394/7111,扩增产物长度为7287bps。
(3)使用Ion Torrent个人化操作基因组测序仪进行高通量测序检测。
根据本发明的方法,所述步骤(2)中,用上述引物配合如下反应体系:PCR为50μl总体系,具体是5×Phusion HF Buffer10μl,2.5mM dNTPmix5μl,10mM的上下游引物各2μl,2U/μl的Phusion DNA聚合酶0.8μl,1-10ng的总基因组DNA模板1μl,用灭菌水补足50μl体系,反应条件为“降落PCR”:95℃5min预变性,循环内98℃10s变性,从68℃每个循环降1℃退火,72℃延伸5min,10个循环;在62℃退火,进行25个循环;PCR反应循环后72℃继续延伸7min,然后16℃保存。
根据本发明的方法,所述步骤(3)的具体操作步骤如下:
3.1割胶回收纯化线粒体DNA片段及回收效果检测:纯化产物,回收片段,分别取出1ul线粒体扩增片段PCR后产物,利用QB2.0HS DNA荧光检测试剂进行浓度检测;根据样品检测出的浓度,决定用于下步实验的DNA起始总量;根据PCR1和PCR2的长度,确定取PCR1的量,保证PCR产物的分子个数接近同比例,然后混匀,补水,建库;
3.2DNA超声波打断:将线粒体基因组打断15个cycles,打断结果为150-400bp范围内;
3.3末端修复和纯化DNA:按起始量加入无核酸酶水到打断后DNA中,在1.5ml LoBindTube中混匀,室温下孵育20min;
3.4连接接头、缺口补平和纯化连接的DNA:用the
XP Kit纯化末端修复产物;
3.5片段选择:取10ul连接纯化后的线粒体DNA样品,进行1.8%琼脂糖凝胶电泳,120v,90min;电泳结果:线粒体连接后非扩增文库大小在200-600bp范围内有连续条带,根据接头、barcode和目的片段文库大小,进行切胶300-350bp处条带利用Thermo Scientific GeneJETGel Extraction Kit进行回收;
3.6扩增及纯化DNA;
3.7文库质控:检测文库片段大小、文库浓度,并确定文库稀释因子;
3.8上机测序及测序结果分析:将制备好的文库在Life technologies公司的Ion PGMsequencer高通量测序仪上进行测序,读长250BP,要求测序深度达到3000×,每个样本产生约90M的数据量;测序数据经过信息分析得到线粒体全基因组序列资料,与线粒体参考序列比对,即可获得样本线粒体序列变异信息,包括点突变、缺失、插入等变异情况。。
本发明提供的基于高通量基因测序无创检测线粒体DNA的方法,涉及分子生物学和生物信息学,本方法只设计两对灵敏的引物,配合优化的PCR反应条件无需单独分离细胞线粒体DNA,只需要细胞总DNA为模板就可以实现体外线粒体DNA的富积扩增,可以做到无创标本(口腔黏膜细胞样品)的检测。技术中的扩增引物配合优化的PCR反应体系和条件,完全可以应用于线粒体DNA全基因组的检测。该方法实验设计严谨、实验流程简单,检测结果准确、快速、自动化程度高,可以不同程度满足科研及临床检测的需求,适用于科研和临床针对线粒体相关的突变快速检测,有助于临床疾病的正确诊断和分类,早发现病人,早预防,早治疗。
此外,本方法配合使用Life technologies公司的Ion Torrent个人化操作基因组测序仪(PGMTM),它是市场上相较其他测序技术,更简单,经济和具有强大的可扩展性的测序平台。PGMTM台式系统的设计配合革新性的半导体芯片技术,使整个平台具有极高的扩展性和快速完成测序的性能。Ion Torrent技术通过专有的大规模并行半导体感应器,对于DNA复制时产生的离子流,实现直接和实时的检测。当试剂通过集成的流体通路进入Ion Torrent半导体芯片中,密布于芯片上的反应孔立即成为上百万个微反应体系。这种独特的流体体系,微体系机械设计和半导体的技术组合,使我们得以快速直接的将遗传信息翻译成数码的DNA测序结果,得到大量高质量的测序数据,测序的深度保证结果的准确性,可以测出比例非常低的突变位点,为筛查线粒体DNA突变相关性疾病提供一种非常先进的方法,可以很好地解决传统基因检测中出现的假阳性高、漏检、规模化、自动化问题。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例,对本发明的技术方案作进一步的详述。但本发明并不限于以下实施例。
本发明的实验流程具体步骤如下。
1.提取口腔细胞总基因组DNA
严格按照Genomic DNA Purification Kit(Fermentas公司K0512)试剂盒操作说明书提取口腔细胞总基因组DNA。
2.设计PCR引物及体外富积扩增线粒体DNA
设计两对PCR扩增引物,对抽提出来的总基因组DNA进行完整的线粒体DNA体外富积扩增。扩增产物的长度分别为9391bps和7287bps,此时扩增产物能够覆盖整条完整的mtDNA序列。
第一对PCR引物序列为:
F70655'-GCCATCATAGGAGGCTTCATTCAC-3',
R164555'-CGGAGCGAGGAGAGTAGCACTCTT-3',
扩增线粒体DNA的位点7065/16455区域,扩增产物长度为9391bps;
第二对PCR引物序列为:
F163945'-CCTTGACCACCATCCTCCGTGAA-3',
R71115'-TAGCCTGAGAATAGGGGAAATCAGT-3'
扩增线粒体DNA的位点16394/7111,扩增产物长度为7287bps。
引物扩增线粒体DNA扩增模式图参考图1。
用上述引物配合如下反应体系:PCR为50μl总体系,具体是5×Phusion HF Buffer10μl,2.5mM dNTPmix5μl,上下游引物(10mM)各2μl,Phusion DNA聚合酶(2U/μl)0.8μl,总基因组DNA模板1μl(1-10ng),用灭菌水补足50μl体系。反应条件为(降落PCR):95℃5min预变性,循环内98℃10s变性,从68℃每个循环降1℃退火,72℃延伸5min,10个循环;在62℃退火,进行25个循环;PCR反应循环后72℃继续延伸7min,然后16℃保存。
PCR反应完取3μl PCR产物进行1%琼脂糖电泳分析,线粒体体外富积扩增琼脂糖电泳图如图2所示,图中,1:第一段扩增大小9391bps;2:第一段扩增大小7287bps;M;Marker
3高通量测序检测
3.1割胶回收纯化线粒体DNA片段及回收效果检测
3.1.1按照GeneJETTM Gel Extraction Kit凝胶纯化试剂盒说明书(Fermentas公司K0691)进行纯化产物,回收片段。
3.1.2回收效果检测
方法:分别取出1ul线粒体扩增片段PCR后产物,利用QB2.0HS DNA荧光检测试剂进行浓度检测。检测结果:PCR-1为630ng/ul,PCR-2为570ng/ul;根据样品检测出的浓度,决定用于下步实验的DNA起始总量为:1ug;根据PCR1和PCR2的长度,确定取PCR1的量为530ng,PCR2的量为470ng,保证PCR产物的分子个数接近同比例,然后混匀,补水至80ul为打断体系,按1ug总起始量进行建库。
3.2DNA超声波打断
1)水浴槽需预先降温30min。加入一定量的冰水混合物到水浴槽中。
2)准备样品,选用0.5ml的打断管,取出约1ug的线粒体DNA,用NF水稀释到80ul体系。
3)打断之前检查各设备之间的线路是否已正确连接,确保正确连接后,插上电源插头。
4)将功率调到最大“H”。
5)时间间隔控制旋钮上绿色为“OFF”,即停顿时间,调至0.5min,红色为“ON”,即超声波时间,调至0.5min。
6)加冰水混合物到最高水位线处。
7)将准备好的样品装到转头上。
8)盖上仪器外部的隔音罩。
9)开始打断,每打断3-4个cycles,需吸走一部分的水,然后用碎冰补齐到最高水位线处。
10)将线粒体基因组打断15个cycles,打断结果为150-400bp范围内。
3.3末端修复和纯化DNA
3.3.1按起始量加入以下体积的Nuclease-free Water到打断后DNA中。
3.3.2在1.5ml LoBind Tube中混匀。
3.3.3室温下孵育20min。
3.4连接接头、缺口补平和纯化连接的DNA
a.加入1.8倍样品体积的
XP Reagent beads到样品中,吹打混匀5次使得DNA尽量重悬,然后瞬甩并在室温下放置5分钟。
b.瞬甩并将样品管放置在DynaMagTM‐2磁力架上3分钟直到溶液澄清,移除和弃掉上清液。
c.加入500ul70%的酒精到样品中,静置30秒。上下颠倒管子两次。等溶液澄清后,移除和弃掉上清液。
d.重复上述步骤进行第二次洗涤。
e.为了移除多余的酒精,瞬甩管子,将管子放回磁力架上,并且小心的将多余的上清液用20ul的枪头弃掉。
f.将管子保持在磁力架上,室温下干燥磁珠,不超过5分钟。
g.从磁力架上移除管子,加入25ul的TE到样品中,吹打混匀,然后用涡旋震荡仪混匀10秒钟使其充分混匀。
h.瞬甩并且将管子放在磁力架上至少1分钟,等溶液澄清后,将含有DNA的的上清转移到一个新的1.5ml
LoBind Tube中。
3.4.2在一新的0.2ml的PCR管中,加入以下的试剂,并充分混匀
Reaction setup for barcoded libraries
将PCR管放在PCR仪上运行以下的程序:
Stage |
温度 |
时间 |
Hold |
25 |
15min |
Hold |
72 |
5min |
Hold |
4 |
∞* |
将所有的反应混合液转移到一个新的1.5ml Lobind tube中。
3.4.3纯化连接接头的DNA
a.加入预期体积的
XP Reagent beads到样品中,吹打混匀5次使得DNA尽量重悬,然后瞬甩并在室温下放置5分钟。
200bp文库:140ul(1.4倍样品体积)
b.瞬甩并将样品管放置在DynaMagTM‐2磁力架上3分钟直到溶液澄清,移除和弃掉上清液。
c.加入500ul70%的酒精到样品中,静置30秒。上下颠倒管子两次。等溶液澄清后,移除和弃掉上清液。
d.重复上述步骤进行第二次洗涤。
e.为了移除多余的酒精,瞬甩管子,将管子放回磁力架上,并且小心的将多余的上清液用20ul的枪头弃掉。
f.将管子保持在磁力架上,室温下干燥磁珠,不超过5分钟。
g.从磁力架上移除管子,加入20ul的TE到样品中,吹打混匀,然后用涡旋震荡仪混匀10秒钟使其充分混匀。
h.瞬甩并且将管子放在磁力架上至少1分钟,等溶液澄清后,将含有DNA的的上清转移到一个新的1.5ml
LoBind Tube中。
3.5片段选择
取10ul连接纯化后的线粒体DNA样品,进行1.8%琼脂糖凝胶电泳,120v,90min。电泳结果:线粒体连接后非扩增文库大小在200-600bp范围内有连续条带,根据接头、barcode和目的片段文库大小,进行切胶300-350bp处条带利用Thermo Scientific GeneJET GelExtraction Kit进行回收。
回收的操作步骤如下:
(1)在长波紫外灯下,用干净刀片将所需回收的DNA条带切下,尽量切除不含DNA的凝胶,得到凝胶体积越小越好。
(2)将切下的含有DNA条带凝胶放入1.5ml离心管,称重。
先称一个空1.5ml离心管重量,然后放入凝胶块后再称一次,两次重量相减,得到凝胶的重量。
(3)按胶与Binding Buffer与胶块1:2加入Binding Buffer。
如果凝胶重为100mg,其体积可视为100μl,则加入200μl Binding Buffer溶液。
(4)56℃水浴放置10分钟(或直至胶完全溶解)。每2-3分钟涡旋震荡一次帮助加速溶解。
(5)每100mg最初的凝胶重量加入100μl的异丙醇,震荡混匀。
(6)将上一步所得溶液加入GeneJET吸附柱中,室温放置1分钟,10,000rpm离心30-60秒,倒掉收集管中的废液。
(7)加入100ul Binding Buffer溶液到GeneJET吸附柱中,10,000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液。
(8)加入700μl漂洗液WB,12,000rpm离心30秒,弃掉废液。
(9)将GeneJET吸附柱放回空收集管中,12,000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
(10)取出GeneJET吸附柱,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加30ul洗脱缓冲液Elution Buffer,室温放置2分钟,12,000rpm离心1分钟。
(11)弃掉GeneJET吸附柱,-20℃保存。
3.6扩增及纯化DNA
3.6.1在一合适大小的管子上混合以下的试剂,并吹吸混匀。
3.6.2将260ul的混合液分装到三个0.2ml的PCR管中,每个包含86ul。
3.6.3将PCR管放置到PCR仪上,运行以下的PCR程序。
程序结束后,将之前分装的两份PCR反应液混合到一个新的1.5ml Lobind管中。
3.6.4纯化DNA
重要:用新鲜配制的70%乙醇
(1)加入1.5倍样品体积的
XP Reagent到每个样品中。吹吸混匀5次使得磁珠和DNA重悬,瞬甩,在室温下静置5分钟。
1ug:390ul
(2)瞬甩,将管子放置在磁力架上3分钟,等待溶液澄清,小心移除弃掉上清。
(3)保持管子在架子上,加入500ul的70%乙醇,静置30秒,上下颠倒管子两次使磁珠不断移动,等溶液澄清后,移除和弃掉上清。
(4)重复步骤C进行第二次洗涤。
(5)为了弃掉多余的乙醇,瞬甩管子,将管子放回到磁力架上,用20ul枪头小心地弃掉多余的上清。
(6)在室温下空气干燥磁珠不超过5分钟。
(7)将管子移开磁力架,加入20ul的TE到磁珠上,吹吸混匀5次,涡旋震荡样品10秒钟,充分混匀。
(8)瞬甩,将管子放回到磁力架上至少1分钟等待溶液澄清,将含有洗脱DNA的上清转移到新的1.5ml的Lobind管中。
重要:此时上清液中含有洗涤的DNA。
(9)为了移除多余的磁珠,可以将管子放回到磁力架上至少一分钟,将上清转移到又一个新的1.5mlLobind管子中。
此时DNA小片段的文库构建完成,接下来将进行文库的质控。
3.7文库质控
3.7.1文库片度大小检测
取扩增纯化后文库5ul,进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,120v,45min。
电泳结果:文库在300-350bp处有单一条带下图3所示,与预期结果一致,表明建库成功。
线粒体DNA文库制备检测琼脂糖电泳图见图3,图中:M1:Maker50bp;M2:Maker100bp;S:样品文库扩增条带。
3.7.2检测文库浓度
方法:取出1ul线粒体文库样品,利用QB2.0HS DNA荧光检测试剂进行浓度检测。(文库建库后理想浓度为0.5-15ng/ul)。
检测结果:11.3ng/ul,符合文库浓度质量要求。
3.7.3文库稀释因子确定
从上述可确定线粒体文库片度平均大小为310bp,浓度为11.3ng/ul。
将DNA文库摩尔浓度nM转化为pM:
线粒体摩尔浓度(pM)=11.3(ng/ul)*1.515*1000/0.315(kb)=54348pM
稀释因子=3953.4pM/26pM=2700
即1ul文库混合稀释2699ul NF-H2O中(1:2700稀释)至最终为26pM。
3.8上机测序及测序结果分析
将制备好的文库在Life technologies公司的Ion PGM sequencer高通量测序仪上进行测序,读长250BP,要求测序深度达到3000×,每个样本产生约90M的数据量。数据量等于传统测序的3000次克隆测序的覆盖,测序的深度保证结果的准确性,可以测出比例非常低的突变位点,为筛查线粒体DNA突变相关性疾病提供一种非常先进的方法。测序数据经过信息分析得到线粒体全基因组序列资料,与线粒体参考序列(序列号NC_012920)比对,即可获得样本线粒体序列变异信息,包括点突变、缺失、插入等变异情况。测序得到的序列与参考序列比对,覆盖度达到100%全长,本次检测共检测到12处序列的变异,其中有10处单碱基的突变,2处单碱基的缺失。结果见表1。