CN103614482A - 基于高通量基因测序无创检测线粒体dna的方法 - Google Patents

基于高通量基因测序无创检测线粒体dna的方法 Download PDF

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CN103614482A CN201310662758.7A CN201310662758A CN103614482A CN 103614482 A CN103614482 A CN 103614482A CN 201310662758 A CN201310662758 A CN 201310662758A CN 103614482 A CN103614482 A CN 103614482A
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Abstract

本发明提供了一种基于高通量基因测序无创检测线粒体DNA的方法，该方法步骤如下：（1）提取口腔细胞总基因组DNA；（2）设计PCR引物及体外富积扩增线粒体DNA：（3）高通量测序检测。本发明的方法实验设计严谨、实验流程简单，检测结果准确、快速、自动化程度高，可以不同程度满足科研及临床检测的需求，适用于科研和临床针对线粒体相关的突变快速检测。

Description

基于高通量基因测序无创检测线粒体DNA的方法
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种无创检测线粒体DNA序列的方法。
背景技术
人类的线粒体DNA全基因组（mitochondrial DNA,mtDNA）为全长16569bp的闭合双链环状分子，线粒体DNA基因组的NCBI登陆号为NC_012920，全基因组编码区共37个基因，这37个基因中有22个编码转移核糖核酸（tRNA）、2个编码核糖体核糖核酸（12S和16SrRNA)，13个编码多肽。mtDNA基因排列紧密，序列间没有发现内含子。mtDNA有独特的母系遗传特性，一般认为mtDNA随母本的卵细胞传递给后代；mtDNA在细胞中的拷贝数很高，一个细胞中往往含有高达数千个mtDNA拷贝，mtDNA具有较高的突变率，大量研究显示mtDNA突变频率较核基因组高10倍以上，突变的mtDNA与野生型的mtDNA可以同时存在一个细胞内发挥不同的生物学功能能，多数mtDNA突变都为有害突变，mtDNA突变导致的临床表型极为广泛，几乎涉及到所有的组织和器官，mtDNA突变带来的危害存在剂量效应，轻微的突变并不出现典型的临床症状，给临床诊断带来了极大的困难，很多线粒体疾病无法得到确诊，故线粒体基因组的准确检测具有重要的临床指导意义。
传统的线粒体基因检测方法主要包括：PCR-RFLP、AS-PCR和DNA一代测序、芯片方法等，这些方法在基因突变检测中起了重要作用，但普遍存在着明显的不足，临床上常针对mtDNA的检测，还仅集中在对少数常见的线粒体基因位点进行突变和缺失筛查，如对线粒体相关性糖尿病常见突变A3243G的筛查，阳性检出率低，大多数患者难以获得准确的病因诊断；另外线粒体病具有量效现象，即小量的线粒体DNA突变可能不出现临床症状，随着突变线粒体比例增高，出现临床表现，且临床严重程度可能和突变比例成正相关，目前常用的检测方法对于低剂量的线粒体突变都不能很好的检测，如果用传统的方法检测会出现很多漏检的现象；另外传统的检测方法检测基因位点有限、耗时长、操作繁琐等，不适用于大批量、系统检测，结果假阳性高，结果不能自动化分析，给线粒体疾病的临床诊断带来困难。
发明内容
本发明目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种准确、快速、检测流程简单的检测线粒体DNA序列的方法。
为此，本发明公开了一种基于高通量基因测序无创检测线粒体DNA的方法，该方法步骤如下：
（1）提取口腔细胞总基因组DNA；
（2）设计PCR引物及体外富积扩增线粒体DNA：设计两对PCR扩增引物，对抽提出来的总基因组DNA进行完整的线粒体DNA体外富积扩增；扩增产物的长度分别为9391bps和7287bps，此时扩增产物能够覆盖整条完整的mtDNA序列；第一对PCR引物序列为：
F70655'-GCCATCATAGGAGGCTTCATTCAC-3'，
R164555'-CGGAGCGAGGAGAGTAGCACTCTT-3'，
扩增线粒体DNA的位点7065/16455区域，扩增产物长度为9391bps；
第二对PCR引物序列为：
F163945'-CCTTGACCACCATCCTCCGTGAA-3'，
R71115'-TAGCCTGAGAATAGGGGAAATCAGT-3'
扩增线粒体DNA的位点16394/7111，扩增产物长度为7287bps。
（3）使用Ion Torrent个人化操作基因组测序仪进行高通量测序检测。
根据本发明的方法，所述步骤（2）中，用上述引物配合如下反应体系：PCR为50μl总体系，具体是5×Phusion HF Buffer10μl，2.5mM dNTPmix5μl，10mM的上下游引物各2μl，2U/μl的Phusion DNA聚合酶0.8μl，1-10ng的总基因组DNA模板1μl，用灭菌水补足50μl体系，反应条件为“降落PCR”：95℃5min预变性，循环内98℃10s变性，从68℃每个循环降1℃退火，72℃延伸5min,10个循环；在62℃退火，进行25个循环；PCR反应循环后72℃继续延伸7min，然后16℃保存。
根据本发明的方法，所述步骤（3）的具体操作步骤如下：
3.1割胶回收纯化线粒体DNA片段及回收效果检测：纯化产物，回收片段，分别取出1ul线粒体扩增片段PCR后产物，利用QB2.0HS DNA荧光检测试剂进行浓度检测；根据样品检测出的浓度，决定用于下步实验的DNA起始总量；根据PCR1和PCR2的长度，确定取PCR1的量,保证PCR产物的分子个数接近同比例，然后混匀，补水，建库；
3.2DNA超声波打断：将线粒体基因组打断15个cycles，打断结果为150-400bp范围内；
3.3末端修复和纯化DNA：按起始量加入无核酸酶水到打断后DNA中，在1.5ml LoBindTube中混匀，室温下孵育20min；
3.4连接接头、缺口补平和纯化连接的DNA：用the
Figure BDA0000432696610000021
XP Kit纯化末端修复产物；
3.5片段选择：取10ul连接纯化后的线粒体DNA样品，进行1.8%琼脂糖凝胶电泳，120v，90min；电泳结果：线粒体连接后非扩增文库大小在200-600bp范围内有连续条带，根据接头、barcode和目的片段文库大小，进行切胶300-350bp处条带利用Thermo Scientific GeneJETGel Extraction Kit进行回收；
3.6扩增及纯化DNA；
3.7文库质控：检测文库片段大小、文库浓度，并确定文库稀释因子；
3.8上机测序及测序结果分析：将制备好的文库在Life technologies公司的Ion PGMsequencer高通量测序仪上进行测序，读长250BP，要求测序深度达到3000×，每个样本产生约90M的数据量；测序数据经过信息分析得到线粒体全基因组序列资料，与线粒体参考序列比对，即可获得样本线粒体序列变异信息，包括点突变、缺失、插入等变异情况。。
本发明提供的基于高通量基因测序无创检测线粒体DNA的方法，涉及分子生物学和生物信息学，本方法只设计两对灵敏的引物，配合优化的PCR反应条件无需单独分离细胞线粒体DNA，只需要细胞总DNA为模板就可以实现体外线粒体DNA的富积扩增，可以做到无创标本（口腔黏膜细胞样品）的检测。技术中的扩增引物配合优化的PCR反应体系和条件，完全可以应用于线粒体DNA全基因组的检测。该方法实验设计严谨、实验流程简单，检测结果准确、快速、自动化程度高，可以不同程度满足科研及临床检测的需求，适用于科研和临床针对线粒体相关的突变快速检测，有助于临床疾病的正确诊断和分类，早发现病人，早预防，早治疗。
此外，本方法配合使用Life technologies公司的Ion Torrent个人化操作基因组测序仪(PGMTM)，它是市场上相较其他测序技术，更简单，经济和具有强大的可扩展性的测序平台。PGMTM台式系统的设计配合革新性的半导体芯片技术，使整个平台具有极高的扩展性和快速完成测序的性能。Ion Torrent技术通过专有的大规模并行半导体感应器，对于DNA复制时产生的离子流，实现直接和实时的检测。当试剂通过集成的流体通路进入Ion Torrent半导体芯片中，密布于芯片上的反应孔立即成为上百万个微反应体系。这种独特的流体体系，微体系机械设计和半导体的技术组合，使我们得以快速直接的将遗传信息翻译成数码的DNA测序结果，得到大量高质量的测序数据，测序的深度保证结果的准确性，可以测出比例非常低的突变位点，为筛查线粒体DNA突变相关性疾病提供一种非常先进的方法，可以很好地解决传统基因检测中出现的假阳性高、漏检、规模化、自动化问题。
附图说明
图1是线粒体DNA扩增模式图。
图2是线粒体体外富积扩增琼脂糖电泳图。
图3是线粒体DNA文库制备检测琼脂糖电泳图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的详述。但本发明并不限于以下实施例。
本发明的实验流程具体步骤如下。
1.提取口腔细胞总基因组DNA
严格按照Genomic DNA Purification Kit（Fermentas公司K0512）试剂盒操作说明书提取口腔细胞总基因组DNA。
2.设计PCR引物及体外富积扩增线粒体DNA
设计两对PCR扩增引物，对抽提出来的总基因组DNA进行完整的线粒体DNA体外富积扩增。扩增产物的长度分别为9391bps和7287bps，此时扩增产物能够覆盖整条完整的mtDNA序列。
第一对PCR引物序列为：
F70655'-GCCATCATAGGAGGCTTCATTCAC-3'，
R164555'-CGGAGCGAGGAGAGTAGCACTCTT-3'，
扩增线粒体DNA的位点7065/16455区域，扩增产物长度为9391bps；
第二对PCR引物序列为：
F163945'-CCTTGACCACCATCCTCCGTGAA-3'，
R71115'-TAGCCTGAGAATAGGGGAAATCAGT-3'
扩增线粒体DNA的位点16394/7111，扩增产物长度为7287bps。
引物扩增线粒体DNA扩增模式图参考图1。
用上述引物配合如下反应体系：PCR为50μl总体系，具体是5×Phusion HF Buffer10μl，2.5mM dNTPmix5μl，上下游引物（10mM）各2μl，Phusion DNA聚合酶（2U/μl）0.8μl，总基因组DNA模板1μl（1-10ng），用灭菌水补足50μl体系。反应条件为（降落PCR）：95℃5min预变性，循环内98℃10s变性，从68℃每个循环降1℃退火，72℃延伸5min,10个循环；在62℃退火，进行25个循环；PCR反应循环后72℃继续延伸7min，然后16℃保存。
PCR反应完取3μl PCR产物进行1%琼脂糖电泳分析，线粒体体外富积扩增琼脂糖电泳图如图2所示，图中，1：第一段扩增大小9391bps;2:第一段扩增大小7287bps;M;Marker
3高通量测序检测
3.1割胶回收纯化线粒体DNA片段及回收效果检测
3.1.1按照GeneJETTM Gel Extraction Kit凝胶纯化试剂盒说明书（Fermentas公司K0691）进行纯化产物，回收片段。
3.1.2回收效果检测
方法：分别取出1ul线粒体扩增片段PCR后产物，利用QB2.0HS DNA荧光检测试剂进行浓度检测。检测结果：PCR-1为630ng/ul，PCR-2为570ng/ul；根据样品检测出的浓度，决定用于下步实验的DNA起始总量为：1ug；根据PCR1和PCR2的长度，确定取PCR1的量为530ng,PCR2的量为470ng,保证PCR产物的分子个数接近同比例，然后混匀，补水至80ul为打断体系，按1ug总起始量进行建库。
3.2DNA超声波打断
1)水浴槽需预先降温30min。加入一定量的冰水混合物到水浴槽中。
2)准备样品，选用0.5ml的打断管，取出约1ug的线粒体DNA，用NF水稀释到80ul体系。
3)打断之前检查各设备之间的线路是否已正确连接，确保正确连接后，插上电源插头。
4)将功率调到最大“H”。
5)时间间隔控制旋钮上绿色为“OFF”，即停顿时间，调至0.5min，红色为“ON”，即超声波时间，调至0.5min。
6)加冰水混合物到最高水位线处。
7)将准备好的样品装到转头上。
8)盖上仪器外部的隔音罩。
9)开始打断，每打断3-4个cycles，需吸走一部分的水，然后用碎冰补齐到最高水位线处。
10)将线粒体基因组打断15个cycles，打断结果为150-400bp范围内。
3.3末端修复和纯化DNA
3.3.1按起始量加入以下体积的Nuclease-free Water到打断后DNA中。
3.3.2在1.5ml LoBind Tube中混匀。
Figure BDA0000432696610000051
Figure BDA0000432696610000061
3.3.3室温下孵育20min。
3.4连接接头、缺口补平和纯化连接的DNA
3.4.1用the
Figure BDA0000432696610000062
XP Kit纯化末端修复产物
a.加入1.8倍样品体积的
Figure BDA0000432696610000063
XP Reagent beads到样品中，吹打混匀5次使得DNA尽量重悬，然后瞬甩并在室温下放置5分钟。
1μg input 360μL
b.瞬甩并将样品管放置在DynaMagTM‐2磁力架上3分钟直到溶液澄清，移除和弃掉上清液。
c.加入500ul70%的酒精到样品中，静置30秒。上下颠倒管子两次。等溶液澄清后，移除和弃掉上清液。
d.重复上述步骤进行第二次洗涤。
e.为了移除多余的酒精，瞬甩管子，将管子放回磁力架上，并且小心的将多余的上清液用20ul的枪头弃掉。
f.将管子保持在磁力架上，室温下干燥磁珠，不超过5分钟。
g.从磁力架上移除管子，加入25ul的TE到样品中，吹打混匀，然后用涡旋震荡仪混匀10秒钟使其充分混匀。
h.瞬甩并且将管子放在磁力架上至少1分钟，等溶液澄清后，将含有DNA的的上清转移到一个新的1.5ml
Figure BDA0000432696610000064
LoBind Tube中。
3.4.2在一新的0.2ml的PCR管中，加入以下的试剂，并充分混匀
Reaction setup for barcoded libraries
Figure BDA0000432696610000065
将PCR管放在PCR仪上运行以下的程序：
Stage 温度 时间
Hold 25 15min
Hold 72 5min
Hold 4 ∞*
将所有的反应混合液转移到一个新的1.5ml Lobind tube中。
3.4.3纯化连接接头的DNA
a.加入预期体积的
Figure BDA0000432696610000072
XP Reagent beads到样品中，吹打混匀5次使得DNA尽量重悬，然后瞬甩并在室温下放置5分钟。
200bp文库：140ul（1.4倍样品体积）
b.瞬甩并将样品管放置在DynaMagTM‐2磁力架上3分钟直到溶液澄清，移除和弃掉上清液。
c.加入500ul70%的酒精到样品中，静置30秒。上下颠倒管子两次。等溶液澄清后，移除和弃掉上清液。
d.重复上述步骤进行第二次洗涤。
e.为了移除多余的酒精，瞬甩管子，将管子放回磁力架上，并且小心的将多余的上清液用20ul的枪头弃掉。
f.将管子保持在磁力架上，室温下干燥磁珠，不超过5分钟。
g.从磁力架上移除管子，加入20ul的TE到样品中，吹打混匀，然后用涡旋震荡仪混匀10秒钟使其充分混匀。
h.瞬甩并且将管子放在磁力架上至少1分钟，等溶液澄清后，将含有DNA的的上清转移到一个新的1.5ml
Figure BDA0000432696610000073
LoBind Tube中。
3.5片段选择
取10ul连接纯化后的线粒体DNA样品，进行1.8%琼脂糖凝胶电泳，120v，90min。电泳结果：线粒体连接后非扩增文库大小在200-600bp范围内有连续条带，根据接头、barcode和目的片段文库大小，进行切胶300-350bp处条带利用Thermo Scientific GeneJET GelExtraction Kit进行回收。
回收的操作步骤如下：
（1）在长波紫外灯下，用干净刀片将所需回收的DNA条带切下，尽量切除不含DNA的凝胶，得到凝胶体积越小越好。
（2）将切下的含有DNA条带凝胶放入1.5ml离心管，称重。
先称一个空1.5ml离心管重量，然后放入凝胶块后再称一次，两次重量相减，得到凝胶的重量。
（3）按胶与Binding Buffer与胶块1:2加入Binding Buffer。
如果凝胶重为100mg，其体积可视为100μl，则加入200μl Binding Buffer溶液。
（4）56℃水浴放置10分钟（或直至胶完全溶解）。每2-3分钟涡旋震荡一次帮助加速溶解。
（5）每100mg最初的凝胶重量加入100μl的异丙醇，震荡混匀。
（6）将上一步所得溶液加入GeneJET吸附柱中，室温放置1分钟，10,000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液。
（7）加入100ul Binding Buffer溶液到GeneJET吸附柱中，10,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。
（8）加入700μl漂洗液WB，12,000rpm离心30秒，弃掉废液。
（9）将GeneJET吸附柱放回空收集管中，12,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
（10）取出GeneJET吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加30ul洗脱缓冲液Elution Buffer，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟。
（11）弃掉GeneJET吸附柱，-20℃保存。
3.6扩增及纯化DNA
3.6.1在一合适大小的管子上混合以下的试剂，并吹吸混匀。
Figure BDA0000432696610000081
Figure BDA0000432696610000091
3.6.2将260ul的混合液分装到三个0.2ml的PCR管中，每个包含86ul。
3.6.3将PCR管放置到PCR仪上，运行以下的PCR程序。
Figure BDA0000432696610000092
程序结束后，将之前分装的两份PCR反应液混合到一个新的1.5ml Lobind管中。
3.6.4纯化DNA
重要：用新鲜配制的70%乙醇
（1）加入1.5倍样品体积的
Figure BDA0000432696610000093
XP Reagent到每个样品中。吹吸混匀5次使得磁珠和DNA重悬，瞬甩，在室温下静置5分钟。
1ug:390ul
（2）瞬甩，将管子放置在磁力架上3分钟，等待溶液澄清，小心移除弃掉上清。
（3）保持管子在架子上，加入500ul的70%乙醇，静置30秒，上下颠倒管子两次使磁珠不断移动，等溶液澄清后，移除和弃掉上清。
（4）重复步骤C进行第二次洗涤。
（5）为了弃掉多余的乙醇，瞬甩管子，将管子放回到磁力架上，用20ul枪头小心地弃掉多余的上清。
（6）在室温下空气干燥磁珠不超过5分钟。
（7）将管子移开磁力架，加入20ul的TE到磁珠上，吹吸混匀5次，涡旋震荡样品10秒钟，充分混匀。
（8）瞬甩，将管子放回到磁力架上至少1分钟等待溶液澄清，将含有洗脱DNA的上清转移到新的1.5ml的Lobind管中。
重要：此时上清液中含有洗涤的DNA。
（9）为了移除多余的磁珠，可以将管子放回到磁力架上至少一分钟，将上清转移到又一个新的1.5mlLobind管子中。
此时DNA小片段的文库构建完成，接下来将进行文库的质控。
3.7文库质控
3.7.1文库片度大小检测
取扩增纯化后文库5ul，进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，120v，45min。
电泳结果：文库在300-350bp处有单一条带下图3所示，与预期结果一致，表明建库成功。
线粒体DNA文库制备检测琼脂糖电泳图见图3，图中：M1：Maker50bp;M2：Maker100bp;S:样品文库扩增条带。
3.7.2检测文库浓度
方法：取出1ul线粒体文库样品，利用QB2.0HS DNA荧光检测试剂进行浓度检测。（文库建库后理想浓度为0.5-15ng/ul）。
检测结果：11.3ng/ul，符合文库浓度质量要求。
3.7.3文库稀释因子确定
从上述可确定线粒体文库片度平均大小为310bp，浓度为11.3ng/ul。
将DNA文库摩尔浓度nM转化为pM：
线粒体摩尔浓度（pM）=11.3（ng/ul）*1.515*1000/0.315(kb)=54348pM
稀释因子=3953.4pM/26pM=2700
即1ul文库混合稀释2699ul NF-H2O中（1:2700稀释）至最终为26pM。
3.8上机测序及测序结果分析
将制备好的文库在Life technologies公司的Ion PGM sequencer高通量测序仪上进行测序，读长250BP，要求测序深度达到3000×，每个样本产生约90M的数据量。数据量等于传统测序的3000次克隆测序的覆盖，测序的深度保证结果的准确性，可以测出比例非常低的突变位点，为筛查线粒体DNA突变相关性疾病提供一种非常先进的方法。测序数据经过信息分析得到线粒体全基因组序列资料，与线粒体参考序列（序列号NC_012920）比对，即可获得样本线粒体序列变异信息，包括点突变、缺失、插入等变异情况。测序得到的序列与参考序列比对，覆盖度达到100%全长，本次检测共检测到12处序列的变异，其中有10处单碱基的突变，2处单碱基的缺失。结果见表1。
Figure BDA0000432696610000111

Claims (3)

1.一种基于高通量基因测序无创检测线粒体DNA的方法，该方法步骤如下： 
（1）提取口腔细胞总基因组DNA； 
（2）设计PCR引物及体外富积扩增线粒体DNA：设计两对PCR扩增引物，对抽提出来的总基因组DNA进行完整的线粒体DNA体外富积扩增；扩增产物的长度分别为9391bps和7287bps，此时扩增产物能够覆盖整条完整的mtDNA序列； 
第一对PCR引物序列为： 
F70655'-GCCATCATAGGAGGCTTCATTCAC-3'， 
R164555'-CGGAGCGAGGAGAGTAGCACTCTT-3'， 
扩增线粒体DNA的位点7065/16455区域，扩增产物长度为9391bps； 
第二对PCR引物序列为： 
F163945'-CCTTGACCACCATCCTCCGTGAA-3'， 
R71115'-TAGCCTGAGAATAGGGGAAATCAGT-3' 
扩增线粒体DNA的位点16394/7111，扩增产物长度为7287bps； 
（3）使用Ion Torrent个人化操作基因组测序仪进行高通量测序检测。 
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中，用上述引物配合如下反应体系：PCR为50μl总体系，具体是5×Phusion HF Buffer10μl，2.5mM dNTPmix5μl，10mM的上下游引物各2μl，2U/μl的Phusion DNA聚合酶0.8μl，1-10ng的总基因组DNA模板1μl，用灭菌水补足50μl体系，反应条件为“降落PCR”：95℃5min预变性，循环内98℃10s变性，从68℃每个循环降1℃退火，72℃延伸5min,10个循环；在62℃退火，进行25个循环；PCR反应循环后72℃继续延伸7min，然后16℃保存。 
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（3）的具体操作步骤如下： 
3.1割胶回收纯化线粒体DNA片段及回收效果检测：纯化产物，回收片段，分别取出1ul线粒体扩增片段PCR后产物，利用QB2.0HS DNA荧光检测试剂进行浓度检测；根据样品检测出的浓度，决定用于下步实验的DNA起始总量；根据PCR1和PCR2的长度，确定取PCR1的量,保证PCR产物的分子个数接近同比例，然后混匀，补水，建库； 
3.2DNA超声波打断：将线粒体基因组打断15个cycles，打断结果为150-400bp范围内； 
3.3末端修复和纯化DNA：按起始量加入无核酸酶水到打断后DNA中，在1.5ml LoBind Tube中混匀，室温下孵育20min； 
3.4连接接头、缺口补平和纯化连接的DNA：用the
Figure FDA0000432696600000011
XP Kit纯化末端修复产物； 
3.5片段选择：取10ul连接纯化后的线粒体DNA样品，进行1.8%琼脂糖凝胶电泳，120v， 90min；电泳结果：线粒体连接后非扩增文库大小在200-600bp范围内有连续条带，根据接头、barcode和目的片段文库大小，进行切胶300-350bp处条带利用Thermo Scientific GeneJET Gel Extraction Kit进行回收； 
3.6扩增及纯化DNA； 
3.7文库质控：检测文库片段大小、文库浓度，并确定文库稀释因子； 
3.8上机测序及测序结果分析：将制备好的文库在Life technologies公司的Ion PGM sequencer高通量测序仪上进行测序，读长250BP，要求测序深度达到3000×，每个样本产生约90M的数据量；测序数据经过信息分析得到线粒体全基因组序列资料，与线粒体参考序列比对，即可获得样本线粒体序列变异信息，包括点突变、缺失、插入等变异情况。 
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