CN106701903A - 一种用于检测线粒体异质性的试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于检测线粒体异质性的试剂盒及检测方法。根据发明，能够在一个PCR反应中将涵盖线粒体基因组全长的17个片段均高品质地扩增出来，使得能够以扩增产物为对象构建高品质的测序用DNA文库，从而能够快速、准确地检测人线粒体异质性。

Description

一种用于检测线粒体异质性的试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及一种用于检测线粒体异质性的试剂盒及检测方法，属于分子诊断技术领域。
背景技术
线粒体是真核细胞内的重要细胞器，是能量产生与转换的场所，还参与脂肪酸的合成以及少量蛋白质的合成。正常的线粒体功能依赖于核基因和线粒体基因的共同作用，任一基因组中的突变都可能引起线粒体疾病的发生。1988年，Wallen等报道了首例由线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)突变引起的人类疾病，明确了mtDNA突变可引起人类疾病。mtDNA不是通过核遗传给后代，后代的mtDNA仅仅来源于母亲的卵细胞。许多线粒体疾病并不遗传的原因是因为这些疾病是人类常规基因组上的基因突变造成的。线粒体DNA只占人类核基因组的0.0005％，有37个基因占人类基因的0.15％，但在线粒体DNA的突变是有害的。
人类线粒体基因组是长度为16,569bp的双链环状DNA分子，由编码区和非编码区构成。其中，编码区包括37个基因。非编码区，又叫控制区或D环区(Displacement-loop region，D-Loop)，由1,122bp组成。mtDNA序列多态性多数存在于D-Loop区，在该区域存在有2个长度各为400bp的高度可变区域，即HVI区(hypervariable region I，16,024–16,569)和HVII区(hypervariable region II，1–576)，并且非编码区的序列已广泛用于法医学上的身份鉴定[1,2]。法医学上身份识别分析中使用的最小的区域为非编码区HVI区16,024–16,365和HV II区73–340。
线粒体复制与细胞核复制是独立的，线粒体DNA并不像核DNA那样稳定，因此不同物种以及物种内的差异是非常大的。这种变异经常用于进化以及个人识别研究中。最新研究发现，通过测序手段对编码区域和高可变区的进行序列分析可以提高mtDNA数据的可靠性[3]。但是，通过对线粒体高变区进行测序只能识别和区分不同个体的线粒体，不能对同一个体内的线粒体进行识别和区分，比如疾病状态下，同一个体不同类型细胞中线粒体的拷贝数或者识别同一个体中含有不同的线粒体。
对于同一个体内线粒体异质性的检测，大部分研究者采用Q-PCR的方法来检测。例如程祖建等人利用Q-PCR的方法检测了mtDNA A1555G点突变片段的拷贝数，目的是研究细胞中含突变基因的线粒体拷贝数是多少，为线粒体耳聋的发病机制研究奠定基础[4]。但是采用Q-PCR的方法来检测线粒体异质性，只能针对特定的位点来检测特定的片段，不适合于检测所有的突变类型。
如上述，目前检测线粒体异质性的方法主要有两种：1)扩增线粒体DNA，采用一代测序的方法进行测序进行检测；2)利用Q-PCR的方法检测某种突变位点线粒体的拷贝数。前者只适合于检测不同个体来源的线粒体的异质性，不能检测同一个体的；而后者只能检测某种特定位点的线粒体异质性，不具有广泛的适用性。
因此，迫切希望开发能够在整个线粒体基因组的范围内、对线粒体异质性进行检测的检测方法及试剂盒。
在整个线粒体基因组的范围内检测线粒体异质性的前提是将整个线粒体基因组高品质地扩增出来，但这绝非易事。原因是：正如前述，人类线粒体基因组全长16,569bp，其整体高品质扩增十分困难；而如采用不同PCR反应条件分段扩增的方式，则会增加成本；另一方面，可以考虑采用在同一PCR反应条件下的分段扩增方式，但这种情况下，如何保证每一个片段都能被高品质地扩增出来成为难题。
参考文献
1.Kiesler,K.M.,etal.,Comparison of base composition analysis and Sangersequencing of mitochondrial DNA for four U.S.population groups.Forensic SciInt Genet,2014.8(1):226-232.
2.Yamada,Y.,et al.,Sequencing mitochondrial DNA from a tooth andapplication to forensic odontology.J Forensic Odontostomatol,1997.15(1):13-16.
3.Adachi,N.,K.Umetsu,and H.Shojo,Forensic strategy to ensure thequality of sequencing data of mitochondrial DNA in highly degraded samples.Leg Med(Tokyo),2014.16(1):52-55.
4.程祖建,杨滨,刘奇才,江陵等.RT-ARMS-qPCR测定线粒体耳聋患者mtDNA A1555G点突变片段的研究[J].浙江检验医学,2008年01期.
发明内容
鉴于上述现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种能够在整个线粒体基因组的范围内、进行线粒体异质性检测的检测方法及试剂盒。
此外，本发明的另一个目的在于提供一种能够在同一PCR反应条件下高品质地扩增出涵盖线粒体基因组全长的多个片段的扩增方法及扩增试剂盒。
本发明人为解决上述问题进行了深入研究，结果发现：通过采用特定的17对引物、在特定条件下PCR扩增整个人线粒体基因组，能够高品质地将涵盖线粒体基因组全长的17个片段均高品质地扩增出来，然后，对扩增出的人线粒体基因组片段进行二代测序，并根据二代测序结果进行线粒体异质性分析，能够快速、准确地检测线粒体异质性。
即，本发明包括：
1.一种用于检测人线粒体异质性的试剂盒，其包括下述引物对1～17、用于PCR扩增的试剂、以及用于二代测序的试剂；
引物对1：核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的下游引物；
引物对2：核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的下游引物；
引物对3：核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的下游引物；
引物对4：核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示的下游引物；
引物对5：核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示的下游引物；
引物对6：核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示的下游引物；
引物对7：核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示的下游引物；
引物对8：核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示的下游引物；
引物对9：核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示的下游引物；
引物对10：核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示的下游引物；
引物对11：核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：22所示的下游引物；
引物对12：核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：24所示的下游引物；
引物对13：核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：26所示的下游引物；
引物对14：核苷酸序列如SEQ ID NO：27所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：28所示的下游引物；
引物对15：核苷酸序列如SEQ ID NO：29所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：30所示的下游引物；
引物对16：核苷酸序列如SEQ ID NO：31所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：32所示的下游引物；以及
引物对17：核苷酸序列如SEQ ID NO：33所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：34所示的下游引物。
2.根据项1所述的试剂盒，其中，所述用于PCR扩增的试剂选自：dNTP、MgC12、Taq酶、PCR反应缓冲液、以及双蒸水。
3.根据项1或2所述的试剂盒，其中，所述用于二代测序的试剂包括用于构建二代测序用DNA文库的试剂、以及用于对所构建的二代测序用DNA文库进行上机测序的试剂；
所述用于构建二代测序用DNA文库的试剂选自T4DNA聚合酶、Klenow片段、Klenow缓冲液、DNA连接酶缓冲液、DNA连接酶、Adapter、DNA聚合酶、dNTPs、T4多核苷酸激酶、T4多核苷酸激酶缓冲液。
所述用于对所构建的二代测序用DNA文库进行上机测序的试剂选自再合成试剂、线性化P7接头、线性化P5接头、DNA聚合酶、dNTP、冲洗杂交液/缓冲液、100％甲酰胺(质量/体积)、用于测序的Read 2引物、Index i7测序引物、用于测序的Read 1引物、水、以及增强光感度/照相用试剂。
4.一种用于扩增人线粒体基因组的试剂盒，其包括下述引物对1～17、以及用于PCR扩增的试剂；
引物对1：核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的下游引物；
引物对2：核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的下游引物；
引物对3：核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的下游引物；
引物对4：核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示的下游引物；
引物对5：核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示的下游引物；
引物对6：核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示的下游引物；
引物对7：核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示的下游引物；
引物对8：核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示的下游引物；
引物对9：核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示的下游引物；
引物对10：核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示的下游引物；
引物对11：核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：22所示的下游引物；
引物对12：核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：24所示的下游引物；
引物对13：核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：26所示的下游引物；
引物对14：核苷酸序列如SEQ ID NO：27所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：28所示的下游引物；
引物对15：核苷酸序列如SEQ ID NO：29所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：30所示的下游引物；
引物对16：核苷酸序列如SEQ ID NO：31所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：32所示的下游引物；以及
引物对17：核苷酸序列如SEQ ID NO：33所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：34所示的下游引物。
5.根据项4所述的试剂盒，其中，所述用于PCR扩增的试剂选自：dNTPs、MgC12、Taq酶、PCR反应缓冲液、以及双蒸水。
6.一种检测人线粒体异质性的方法，其使用项1～5中任一项所述的试剂盒进行，该方法包括：
步骤A：使用所述引物对1～17作为扩增引物，对包含不同线粒体的样本中的线粒体基因组进行PCR扩增，得到扩增产物；
步骤B：对扩增产物进行二代测序；
步骤C：根据二代测序结果，对所述样本中的线粒体的异质性进行分析。
7.根据项6所述的方法，其中，在所述步骤C中，对于线粒体基因组的某一位点，根据二代测序结果，分别确定读取到A、T、C或G碱基的reads数，然后与参照序列的该位点上的碱基进行比对，用读取到的碱基与参照序列的该位点上的碱基不同的reads数除以reads总数，得到样本中发生突变的线粒体所占的比例。
但是，若全部reads中该位点上读取到的碱基均相同但与参照序列的该位点上的碱基不同，则该位点不作为样本线粒体异质性分析的对象。
8.根据项7所述的方法，其中，所述参照序列是NC_012920.1。
发明效果
根据发明，能够在一个PCR反应中将涵盖线粒体基因组全长的17个片段均高品质地扩增出来，使得能够以扩增产物为对象构建高品质的测序用DNA文库，从而能够快速、准确地检测人线粒体异质性。
附图说明
图1.使用实施例的17对引物在同一PCR反应条件下扩增覆盖人线粒体基因组全长的17个片段的结果，最左侧泳道为分子量标准DL2000。
图2.使用对比例的11对引物在同一PCR反应条件下扩增覆盖人线粒体基因组全长的11个片段的结果，最左侧泳道为分子量标准DL2000。
图3.显示了实施例中构建测序用DNA文库的结果。
图4.对于同一样本，分别采用本发明的方法以及传统的Q-PCR方法检测线粒体异质性，图4显示了两种方法的检测结果的相关性。
发明的具体实施方式
本发明在一个方面中提供一种用于检测人线粒体异质性的试剂盒(本发明的检测试剂盒)，其包括下述引物对1～17(简称本发明的引物对)、用于PCR扩增的试剂、以及用于二代测序的试剂；
引物对1：核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的下游引物；
引物对2：核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的下游引物；
引物对3：核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的下游引物；
引物对4：核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示的下游引物；
引物对5：核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示的下游引物；
引物对6：核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示的下游引物；
引物对7：核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示的下游引物；
引物对8：核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示的下游引物；
引物对9：核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示的下游引物；
引物对10：核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示的下游引物；
引物对11：核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：22所示的下游引物；
引物对12：核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：24所示的下游引物；
引物对13：核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：26所示的下游引物；
引物对14：核苷酸序列如SEQ ID NO：27所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：28所示的下游引物；
引物对15：核苷酸序列如SEQ ID NO：29所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：30所示的下游引物；
引物对16：核苷酸序列如SEQ ID NO：31所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：32所示的下游引物；以及
引物对17：核苷酸序列如SEQ ID NO：33所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：34所示的下游引物。
本发明的检测试剂盒可以用于高品质地扩增出涵盖人线粒体基因组全长序列的17个片段，并对这些片段进行二代测序，从而检测人线粒体异质性。
本发明的检测试剂盒中，可组分优选独立包装，但在不影响使用的情况下，一些组分也可以混合包装，例如，所述上游引物和下游引物可以分别装在不同容器内，也可以装在同一容器内。除了包含上述引物组以外，本发明的检测试剂盒还可以包含例如用于PCR扩增的其他试剂，这可以使用本领域技术人员通常使用的那些试剂，包括但不限于选自dNTP、MgC12、Taq酶、PCR反应缓冲液、双蒸水(ddH2O)等中的至少一种，本领域技术人员可根据需要适当选择。此外，本发明的检测试剂盒还可以包含用于二代测序的试剂，包括用于以所述17个片段作为希望测序的DNA片段构建二代测序用DNA文库的试剂、以及用于对所构建的二代测序用DNA文库进行上机测序的试剂。作为所述用于构建二代测序用DNA文库的试剂可以选自T4DNA聚合酶、Klenow片段、Klenow缓冲液、DNA连接酶缓冲液、DNA连接酶、Adapter、DNA聚合酶、dNTP、T4多核苷酸激酶、T4多核苷酸激酶缓冲液。作为所述用于对所构建的二代测序用DNA文库进行上机测序的试剂，可以选自再合成试剂、线性化P7接头、线性化P5接头、DNA聚合酶、dNTPs、冲洗杂交液/缓冲液(杂交作用)、100％甲酰胺(质量/体积)、用于测序的Read 2引物、用于Index i7测序引物、用于测序的Read 1引物、水、以及增强光感度/照相用试剂。作为上述试剂，可以使用本领域技术人员通常使用的那些试剂。
在另一方面中，本发明还提供一种用于扩增人线粒体基因组的试剂盒(本发明的扩增试剂盒)，其包括上述的引物对1～17、以及用于PCR扩增的试剂。本发明的扩增试剂盒可以用于高品质地扩增出涵盖人线粒体基因组全长序列的17个片段，该扩增优选在同一PCR反应条件下进行。
在本说明书中，“高品质地扩增”是指：对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检查时，条带特异单一。
PCR(聚合酶链反应)扩增是本领域技术人员熟知的，其一般通过一定的PCR反应程序(温度循环)来实现。所述PCR反应程序一般包括变性、退火、延伸等步骤。在使用本发明的检测试剂盒或本发明的扩增试剂盒对人线粒体基因组进行扩增的情况下，优选采用如实施例所述的PCR反应程序。
在另一个方面中，本发明提供一种检测人线粒体异质性的方法(本发明的检测方法)，其使用本发明的检测试剂盒进行，该方法包括：
步骤A：使用所述引物对1～17作为扩增引物，对包含不同线粒体的样本中的线粒体基因组进行PCR扩增，得到扩增产物；
步骤B：对扩增产物进行二代测序；
步骤C：根据二代测序结果，对样本中的线粒体基因组的SNP位点进行分析，确定样本中不同线粒体的比例。
在本说明书中，术语“线粒体”是指人线粒体。术语“线粒体异质性”是指：同一人类个体的不同组织、同一组织的不同细胞、同一细胞中甚至同一线粒体内存在不同线粒体DNA拷贝的现象。需要说明的是，同一个体在不同发育时期也会产生不同的线粒体DNA。所述线粒体异质性可以用样本中发生突变的线粒体所占的比例来表示。这里，突变是指样本中的一些线粒体DNA的某一位点上的碱基与参照序列NC_012920.1(GenBank登录号)相比，在该位点上的碱基不同，但是不包括样本中的所有线粒体DNA的某一位点上的碱基均相同且与参照序列的该位点上的碱基不同的情况。
在本说明书中，“不同的线粒体DNA”是指：线粒体DNA(也称线粒体基因组)的核苷酸序列不同。所述不同线粒体可以是来源于同一人类个体的不同组织、同一组织的不同细胞、同一细胞甚至同一线粒体，优选来源于同一人类个体的同一组织。
对于对扩增产物进行二代测序的方法没有特殊限制，可以例如采用基于二代测序原理的测序方法来进行。基于二代测序原理的测序方法是本领域技术人员已知的，其通常包括基因组片段化、测序用DNA文库构建、测序及数据分析等步骤。在本发明的检测方法中，优选将17个扩增产物以等比例混合，作为希望测序的DNA片段来进行二代测序。
在步骤C中，根据二代测序结果，对样本的线粒体异质性进行分析。这里，所述线粒体异质性分析是指确定样本中发生突变的线粒体所占的比例。例如，可以采用如下方法确定样本中发生突变的线粒体所占的比例：对于线粒体DNA的某一位点，根据二代测序结果，分别确定读取到A、T、C或G碱基的reads数(例如有a个reads读取到A、t个reads读取到T、c个reads读取到C、g个reads读取到G)，然后与参照序列的该位点上的碱基(例如为A)进行比对，用读取到的碱基与参照序列的该位点上的碱基不同的reads数(t+c+g)除以reads总数(a+t+c+g)，即得到样本中发生突变的线粒体所占的比例。需要说明的是，若全部reads中该位点上读取到的碱基均相同，但与参照序列的该位点上的碱基不同，则该位点不用来进行样本的线粒体异质性分析。优选地，对于线粒体DNA上的多个位点，分别确定发生突变的线粒体所占的比例，然后取其平均值作为评价线粒体异质性的指标。这里使用的参照序列可以是NC_012920.1。
通常可以将线粒体从包含它的样本中提取出来并进行纯化，使之成为更适于进行扩增的状态。从动植物组织、动植物细胞或微生物中提取线粒体的方法是本领域技术人员已知的(例如可以参考“王文、施立明，一种改进的动物线粒体DNA提取方法，动物学研究，1993(2)”)。此外，从线粒体中提取线粒体DNA的方法是本领域技术人员已知的(例如可以参考“臧莹安、丁发源等，从动物组织中提取线粒体的方法。中国兽医杂志，2006年(42)(2:61-65”；或者参考碧云天公司细胞线粒体分离试剂盒(货号：C3601)的产品说明书)。当然，也可以不提取线粒体DNA、而直接使用所述样本本身或来自样本的线粒体进行PCR扩增。
实施例
以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例是用于解释本发明，并非对本发明的限定。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1采用本发明的检测试剂盒检测癌组织中的线粒体异质性
1.1取一个人的肺癌组织样本，提取基因组DNA(包含线粒体DNA)，该样本命名为Mito1。
1.2设计引物扩增线粒体的全长序列，引物序列及相关信息如下：
引物名称 序列 引物编号
Hmt-F1 CCCTATGTCGCAGTATCTGTC SEQ ID NO：1
Hmt-R1 GCCCATTTCTTGCCACCTC SEQ ID NO：2
Hmt-F2 GAGCCTGTTCTGTAATCG SEQ ID NO：3
Hmt-R2 GTAAGATTTGCCGAGTTCC SEQ ID NO：4
Hmt-F3 CGCATAAGCCTGCGTCAG SEQ ID NO：5
Hmt-R3 TTATGGCGTCAGCGAAGGG SEQ ID NO：6
Hmt-F4 TAAGATGGCAGAGCCCGG SEQ ID NO：7
Hmt-R4 TTGCGTGAGGAAATACTTGATG SEQ ID NO：8
Hmt-F5 CAACCCGTCATCTACTCTA SEQ ID NO：9
Hmt-R5 GAAGTAGATTGAAGCCAGTTG SEQ ID NO：10
Hmt-F6 AAGCCCTCAGTAAGTTGC SEQ ID NO：11
Hmt-R6 GATTATGGTAGCGGAGGTG SEQ ID NO：12
Hmt-F7 CCTACCAGGCTTCGGAATAAT SEQ ID NO：13
Hmt-R7 AGGGATCGTTGACCTCGTC SEQ ID NO：14
Hmt-F8 ATCTCAGACGCTCAGGAAAT SEQ ID NO：15
Hmt-R8 TGGGTGGTTGGTGTAAATG SEQ ID NO：16
Hmt-F9 CATACACAACACTAAAGGACG SEQ ID NO：17
Hmt-R9 GAGTAAGACCCTCATCAATAG SEQ ID NO：18
Hmt-F10 CCATTTCCGACGGCATCT SEQ ID NO：19
Hmt-R10 GGTAGTTAGTATTAGGAGGGG SEQ ID NO：20
Hmt-F11 GCTAAAACTAATCGTCCCAAC SEQ ID NO：21
Hmt-R11 GGGTGAGTGAGCCCCATTG SEQ ID NO：22
Hmt-F12 TAGTAACCACGTTCTCCTGATC SEQ ID NO：23
Hmt-R12 TGGAAGCGGATGAGTAAGAAG SEQ ID NO：24
Hmt-F13 TCATCCTCGCCTTAGCATGATTTA SEQ ID NO：25
Hmt-R13： GGGCAGGTTTTGGCTCGTAAG SEQ ID NO：26
Hmt-F14： CCCTCTACCTAAAACTCACAGCC SEQ ID NO：27
Hmt-R14： GGTTGTAGTCCGTGCGAGAATAA SEQ ID NO：28
Hmt-F15： TAATAACACACCCGACCACACCG SEQ ID NO：29
Hmt-R15： ATAAAGTGATTGGCTTAGTGGGCG SEQ ID NO：30
Hmt-F16： GAAACATCGGCATTATCCTCCTG SEQ ID NO：31
Hmt-R16： GAGGGTTGATTGCTGTACTTGCT SEQ ID NO：32
Hmt-F17： CATTAGCACCCAAAGCTAAGATTCT SEQ ID NO：33
Hmt-R17 TTTCAGTGTATTGCTTTGAGGAGGT SEQ ID NO：34
1.3 PCR扩增：以1.1中提取的线粒体DNA作为模板，以1.2中所述的17个引物对作为引物，在同一PCR反应条件下扩增涵盖线粒体DNA全长的17个片段。
1.4 PCR反应体系如下：
1.5 PCR反应程序：95℃分钟；(95℃1分钟，55℃45秒，72℃2分钟)30cycles；72℃10分钟。
1.6将17对扩增产物进行等摩尔数混合，混合后取50ng扩增产物进行小片段文库构建。
1.7打断条件：(15秒+30秒)×20cycles；
构建小片段文库；
上机测序，利用Hiseq2500进行上机测序，测序策略为PE100，0.5G Rawdata/样本。
图1显示了该样本17对引物的PCR扩增结果：从电泳结果上可以看到，所有的样本都高品质地扩增得到了目的条带。
图3显示了该样本小片段文库的构建结果，从结果上可以看到，文库质量良好。
1.8线粒体异质性检测
通过对Mito1这个样本进行扩增及线粒体基因组全长二代测序，通过序列比对和生物信息学算法分析，从全长序列中确定4个SNP位点可以检测线粒体异质性，通过这4个SNP位点来计算该样本中发生突变的线粒体所占比例，SNP位点信息和计算比例的结果如下表1所示。参照序列为NC_012920.1。计算比例的方法如下式所示：
X＝A/A+B
X为样本中发生突变的线粒体所占的比例。
A为样本发生突变的线粒体中该位点测序得到的reads数
B为样本未发生突变的线粒体中该位点测序得到的reads数
表1
实施例2采用Q-PCR方法进行验证
为了验证高通量测序计算出线粒体异质性比例的准确性，我们采用Taqman Q-PCR的方法对这些位点进行验证。
2.1引物和探针设计
引物名称 序列
chrM 16519-FS tcagataggggtcccttgac
chrM 16519-RS catcgtgatggtttattta
chrM 16519-Probe cttcagggtcataaagccta
chrM 16519-Probe cttcagggccataaagccta
chrM 16534-FS tcagataggggtcccttgac
chrM 16534-RS caatgctatcgcgtgcatac
chrM 16534-Probe agcctaaatagcccacacgt
chrM 16534-Probe agcctaaagagcccacacgt
chrM 46-FS ctggttcctacttcagggtc
chrM 46-RS gaatcaaagacagatactgc
chrM 46-Probe gagctctccatgcatttg
chrM 46-Probe gagctctccaggcatttg
chrM 49-FS ggttcctacttcagggtcat
chrM 49-RS atcaaagacagatactgcga
chrM 49-Probe ctccatgcatttggtatttt
chrM 49-Probe ctccatgcctttggtatttt
2.2 Taqman Q-PCR反应
反应体系如下：
反应程序：
95℃10分钟；(95℃15秒,60℃30秒,72℃30秒)45cycles。
2.3线粒体异质性检测(计算突变的线粒体占总线粒体的比例)
根据Taqman Q-PCR计算出的突变和未突变目的片段的拷贝数，针对4个位点计算出的突变线粒体占总线粒体的比例如下：
上述两种检测方法的一致性分析如图4所示。由图3可知，采用本发明的检测方法得出的线粒体异质性比例与Q-PCR方法得出的线粒体异质性比例有良好的一致性。这表明本发明的线粒体异质性检测方法的准确性良好。
对比例1
对于实施例1中使用的Mito1样本，使用下表所示的11对引物在同一PCR反应条件下扩增覆盖人线粒体基因组全长的11个片段，电泳结果如图2所示。
引物名称 引物序列
Mt-FS1 catttaccgtacatagcacatta
Mt-RS1 atgtcctttgaagtatacttgagg
Mt-FS2 acgttaggtcaaggtgtagc
Mt-RS2 ccggtctgaactcagatcac
Mt-FS3 attctagagtccatatcaac
Mt-RS3 gctatgatggataagattgaga
Mt-FS4 ctagcccccatctcaatcat
Mt-RS4 gatttacgccgatgaatatgatag
Mt-FS5 cttccactatgtcctatcaatag
Mt-RS5 tggggcgacagcgatttctagg
Mt-FS6 ctaacattactgcaggccacc
Mt-RS6 ggataagtgtggtttcgaag
Mt-FS7 cctcacaatcatggcaagcc
Mt-RS7 tacaagaggaaaacccggta
Mt-FS8 tcactcacccaccacattaac
Mt-RS8 gctacaactatagtgcttga
Mt-FS9 cactactaggcctcctcctag
Mt-RS9 gggttaggatgagtggaaga
Mt-FS10 tcctagacctaacctgactag
Mt-RS10 ggaatgggaggtgattcctag
Mt-FS11 tcagtagacagtcccaccctc
Mt-RS11 caagtgttatgggcccggagc
由图2可知，有些条带出现了非特异性扩增。
还需要说明的是，在可实施且不明显违背本发明的主旨的前提下，在本说明书中作为某一技术方案的构成部分所描述的任一技术特征或技术特征的组合同样也可以适用于其它技术方案；并且，在可实施且不明显违背本发明的主旨的前提下，作为不同技术方案的构成部分所描述的技术特征之间也可以以任意方式进行组合，来构成其它技术方案。本发明也包含在上述情况下通过组合而得到的技术方案，并且这些技术方案相当于记载在本说明书中。
上述说明示出并描述了本发明的优选实施例，如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域技术人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
工业实用性
根据本发明，提供一种能够在整个线粒体基因组的范围内、对线粒体异质性进行检测的检测方法及试剂盒。

Claims (8)

1.一种用于检测人线粒体异质性的试剂盒，其包括下述引物对1～17、用于PCR扩增的试剂、以及用于二代测序的试剂；
引物对1：核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的下游引物；
引物对2：核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的下游引物；
引物对3：核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的下游引物；
引物对4：核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示的下游引物；
引物对5：核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示的下游引物；
引物对6：核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示的下游引物；
引物对7：核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示的下游引物；
引物对8：核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示的下游引物；
引物对9：核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示的下游引物；
引物对10：核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示的下游引物；
引物对11：核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：22所示的下游引物；
引物对12：核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：24所示的下游引物；
引物对13：核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：26所示的下游引物；
引物对14：核苷酸序列如SEQ ID NO：27所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：28所示的下游引物；
引物对15：核苷酸序列如SEQ ID NO：29所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：30所示的下游引物；
引物对16：核苷酸序列如SEQ ID NO：31所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：32所示的下游引物；以及
引物对17：核苷酸序列如SEQ ID NO：33所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：34所示的下游引物。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述用于PCR扩增的试剂选自：dNTP、MgC12、Taq酶、PCR反应缓冲液、以及双蒸水。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述用于二代测序的试剂包括用于构建二代测序用DNA文库的试剂、以及用于对所构建的二代测序用DNA文库进行上机测序的试剂；
所述用于构建二代测序用DNA文库的试剂选自T4DNA聚合酶、Klenow片段、Klenow缓冲液、DNA连接酶缓冲液、DNA连接酶、Adapter、DNA聚合酶、dNTPs、T4多核苷酸激酶、T4多核苷酸激酶缓冲液；
所述用于对所构建的二代测序用DNA文库进行上机测序的试剂选自再合成试剂、线性化P7接头、线性化P5接头、DNA聚合酶、dNTP、冲洗杂交液/缓冲液、100％甲酰胺(质量/体积)、用于测序的Read 2引物、Index i7测序引物、用于测序的Read 1引物、水、以及增强光感度/照相用试剂。
4.一种用于扩增人线粒体基因组的试剂盒，其包括下述引物对1～17、以及用于PCR扩增的试剂；
引物对1：核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的下游引物；
引物对2：核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的下游引物；
引物对3：核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的下游引物；
引物对4：核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示的下游引物；
引物对5：核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示的下游引物；
引物对6：核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示的下游引物；
引物对7：核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示的下游引物；
引物对8：核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示的下游引物；
引物对9：核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示的下游引物；
引物对10：核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示的下游引物；
引物对11：核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：22所示的下游引物；
引物对12：核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：24所示的下游引物；
引物对13：核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：26所示的下游引物；
引物对14：核苷酸序列如SEQ ID NO：27所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：28所示的下游引物；
引物对15：核苷酸序列如SEQ ID NO：29所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：30所示的下游引物；
引物对16：核苷酸序列如SEQ ID NO：31所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：32所示的下游引物；以及
引物对17：核苷酸序列如SEQ ID NO：33所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：34所示的下游引物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中，所述用于PCR扩增的试剂选自：dNTPs、MgC12、Taq酶、PCR反应缓冲液、以及双蒸水。
6.一种检测人线粒体异质性的方法，其使用权利要求6或7所述的试剂盒进行，该方法包括：
步骤A：使用所述引物对1～17作为扩增引物，对包含不同线粒体的样本中的线粒体基因组进行PCR扩增，得到扩增产物；
步骤B：对扩增产物进行二代测序；
步骤C：根据二代测序结果，对所述样本中的线粒体的异质性进行分析。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，在所述步骤C中，对于线粒体基因组的某一位点，根据二代测序结果，分别确定读取到A、T、C或G碱基的reads数，然后与参照序列的该位点上的碱基进行比对，用读取到的碱基与参照序列的该位点上的碱基不同的reads数除以reads总数，得到样本中发生突变的线粒体所占的比例；
但是，若全部reads中该位点上读取到的碱基均相同但与参照序列的该位点上的碱基不同，则该位点不作为样本线粒体异质性分析的对象。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述参照序列是NC_012920.1。
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