CN101892317A - Hla高分辨基因测序试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人类白细胞抗原基因的分型方法，包括以下步骤：(1)按照常规技术提取待测基因组DNA，使用PCR扩增引物扩增所要分析的目的基因片段：HLA-A的2，3，4外显子，HLA-B的2，3，4外显子和HLA-DRB1位点2外显子；(2)使用测序引物对步骤(1)所得PCR产物进行扩增，扩增各外显子，然后对扩增出的各外显子进行测序，并将测序结果与数据库中的标准序列进行比较，从而确定基因分型结果；由于本发明HLA基因测序试剂盒以及测试条件的优化组合，有效地扩增HLA-A，B位点的2，3，4外显子和HLA-DRB1位点2外显子，并对相应外显子进行测序，因此在进一步进行分型时，能够避免当某几个等位基因核苷酸位于扩增区域之外时无法进行有效分型的问题，提高了对HLA基因分型的分辨率和精确性。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及用于人类白细胞抗原(Human Leucocyte Antigen，HLA)-A，B，DRB1基因的扩增和分型方法，以及所述方法中使用的特异性引物。
背景技术
HLA是调控人体特异性免疫应答和决定疾病易感性个体差异的主要基因系统，其在抗原识别、抗原递呈、免疫应答与调控、破坏外来抗原靶细胞等方面发挥重要的作用，是引起免疫排斥反应的主要物质基础。移植物细胞表面HLA-I类和HLA-II类抗原都是强移植抗原，体液免疫和细胞免疫都参与了对移植物的排斥反应，无论是异基因造血干细胞移植，还是器官移植，供受体之间HLA相配程度是决定移植成功的关键。
目前国际标准的HLA分型技术有PCR-SSP(序列特异引物聚合酶链式反应)，PCR-SSO(聚合酶链式反应寡核苷酸探针杂交)和PCR-SBT(聚合酶链式反应产物直接测序分型)。
PCR-SSO(sequence specific oligonucleotide)：也称PCR-ASO(allele specific oligonuceotide)，用以同位素或非放射性标记的探针与PCR扩增的目标片断产物杂交，根据阳性斑点判断个体基因型。由于HLA等位基因非常多，就需要很多的探针对每个DNA样品要进行多次杂交(甚至十几次)才能完成定型分析操作也十分繁琐。于是在此基础上又发展起来一种反向杂交法(reverse hybridization)。将各种不同的探针固定于同一张膜上，再将PCR产物标记，以PCR产物(待检测基因DNA)反过来与探针杂交。这样一次杂交即可完成多个等位基因分析。此方法具有灵敏度、特异性强、需样本量少等优点，但不同探针的杂交条件的须严格统一(如温度，离子强度)，易出现误差；不能检测新等位基因，试剂盒需不断升级；对某些杂合子分辨率也不好。很多HLA基因型含有相同的多态性，而仅仅由于排列方式不同，因此分辨率 不及SSP和SBT。此方法适宜大量和高纯度样本，杂交条带将作为书面原始记录长期保存(三种效果比较)。
PCR-SSP：PCR/SSP方法用乃设计出一整套等位基因组特异性引物(sequence specific primer，SSP)，借助PCR技术获得HLA型别特异的扩增产物，可通过电泳直接分析带型决定HLA型别，从而大大简化了实验步骤。优点是简单易行，分辨率可从低到高，成本低。缺点是不易自动化；不能检测新的等位基因，试剂盒需不断升级。此方法适宜零散和纯度低样本，重复实验时要重提DNA和必须使用紫外凝胶成象仪保留原始资料，增加实验成本(三种效果比较)。PCR-SSP和PCR-SSO均需大量试剂(引物)，且不能识别非经典的HLA基因和假基因(绿)。针对HLA外显子和内含子序列精心设计引物可避免这些问题。
PCR-SBT：以PCR扩增所要分析的基因片断，然后对DNA序列进行分析，可以直接得到基因型。分辨率高，可大规模进行，精确度高，能直接发现新的等位基因。因此，应用SBT技术进行HLA高分辨基因分型是目前国际上公认的HLA基因分型金标准。
目前进口的HLA-SBT试剂只对HLA外显子(Exon 2，3)进行测序，当几个等位基因核苷酸区别在这些区域之外时，就无法进行区分，从而造成实验结果中有许多无法明确的组合(模棱两可的结果)。另外，SBT的试剂全部是从国外进口，试剂成本高。因此，需要进一步提高HLA测序的分辨率和精确性，同时降低测序试剂的成本。
发明内容
本发明目的是提供一种人类白细胞抗原(Human Leucocyte Antigen，HLA)基因的分型方法，包括以下步骤：
(1)按照常规技术提取待测基因组DNA，使用PCR扩增引物扩增所要分析的目的基因片段；
(2)使用测序引物对步骤(1)所得PCR产物进行扩增，扩增各外显子，然后对扩增出的各外显子进行测序，并将测序结果与数据库中的标准序列进行比较，从而确定基因分型结果；
其中，步骤(1)中所述目的基因片段包括HLA-A的2，3，4外显子，HLA-B的2，3，4外显子和HLA-DRB1位点2外显子；
相应的PCR扩增引物对包括：HLA-A位点扩增引物，HLA-B位点扩增引物和HLA-DRB1位点扩增引物；
其中，所述HLA-A位点扩增引物包括：
正义引物，SEQ ID No.1：CCATTGGGTGTCGGGTTTC(-105～-87)；
反义引物，SEQ ID No.2：CAGCAATGATGCCCACGATG(1973～1992)；
所述HLA-B位点扩增引物包括：
正义引物1，SEQ ID No.3：CCCTGAGTTTCACTTCTTCTCCCA(-183～-160)；
正义引物2，SEQ ID No.4：CCACGAGTTTCACTTCTTCTCCCA(-183～-160)；
反义引物，SEQ ID No.5：CCAGCAACAATGCCCACGAT(1962～1981)；
上述HLA-B位点扩增引物一起组合使用；
所述HLA-DRB1位点扩增引物包括：
G1，SEQ ID No.6：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTTGTGGCAGCTTAAGTT(8101～8119)；
G2，SEQ ID No.7：TGTAAAACGACGGCCAGTTCCTGTGGCAGCCTAAGAGG(8101～8120)；
G3，SEQ ID No.8：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTTGGAGTACTCTACGT(8101～8118)；
G4，SEQ ID No.9：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTTGGAGCAGGTTAAAC(8101～8118)；
G7，SEQ ID No.10：GTAAAACGACGGCCAGTTCCTGTGGCAGGGTAAGTATA(8101～8121)；
G8，SEQ ID No.11：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTTGGAGTACTCTACGG(8101～8118)；
G9，SEQ ID No.12：TGTAATACGACGGCCAGTTCTTGAAGCAGGATAAGTT(8101～8119)；
G10，SEQ ID No.13：TGTAATACGACGGCCAGTTCTTGGAGGAGGTTAAGTT(8101～8119)；
R，SEQ ID No.14：CAGGAAACAGCTATGACCGCTCACCTCGCCGCTGCAC(8352～8370)；
R＊09，SEQ ID No.15：CAGGAAACAGCTATGACCGCTTACCTCGCCTCTGCAC(8352～8370)；
上述HLA-DRB1位点扩增引物一起组合使用，并且SEQ ID No.6～13为正义引物，SEQ ID No.14～15为反义引物；
步骤(2)中，相应的测序引物包括：HLA-A位点的第2、3、4外显子测序引物，HLA-B位点的第2、3、4外显子测序引物和HLA-DRB1位点的第2外显子测序引物；
所述HLA-A位点的第2外显子测序引物包括：
A2F，SEQ ID No.16：CGGGGAGAAGCAASGG(107～122)；
A2R，SEQ ID No.17：CGGACCCGGAGACTGTG(539～555)；
所述HLA-A位点的第3外显子测序引物包括：
A3F，SEQ ID No.18：GGTTTCATTTTCAGTTTAGGC(622～642)；
A3R，SEQ ID No.19：TTGTCTCCCCTCCTTGTGG(1048～1066)；
所述HLA-A位点的第4外显子测序引物包括：
A4F，SEQ ID No.20：GGTGTCCTGTCCATTCTCAAG(1475～1495)；
A4R，SEQ ID No.21：CAGAGAGGCTCCTGCT(1884～1899)；
所述HLA-B位点的第2外显子测序引物包括：
B2F，SEQ ID No.22：CCCAGGCTCCCACTCCAT(197～214)；
B2R，SEQ ID No.23：GGGGAGTCGTGACCTGC(494～510)；
所述HLA-B位点的第3外显子测序引物包括：
B3F，SEQ ID No.24：GGCCAGGGTCTCACAC(711～726)；
B3R，SEQ ID No.25：GGCGACATTCTAGCGC(1078～1093)；
所述HLA-B位点的第4外显子测序引物包括：
B4F，SEQ ID No.26：AGATGCAAAGCGCCTGAA(1528～1545)；
B4R，SEQ ID No.27：GGCTCCTGCTTTCCCTGA(1875～1892)；
所述HLA-DRB1位点的第2外显子测序引物包括：
M13F，SEQ ID No.28：TGTAAAACGACGGCCAGT；
M13R，SEQ ID No.29：CAGGAAACAGCTATGACC
Codon 86，SEQ ID No.30：CTGCACTGTGAAGCTCTCCA。
上述技术方案中，所述引物方向均从5’到3’；HLA-A设计模板为A＊01010101，HLA-B设计模板为B＊070201，HLA-DRB1设计模板为DRB1＊03010101，所有等位基因序列均参照欧洲IMGT/HLA专业网站数据库：http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/index.html。
同时，本发明还提供了一种HLA高分辨基因测序试剂盒，含有上述PCR扩增引物和测序引物，所述PCR扩增引物分别具有SEQ ID No.1至SEQ ID No.15所述的碱基序列，所述测序引物分别具有SEQ ID No.16至SEQ ID No.30所述的碱基序列。
上述技术方案中，所述HLA高分辨基因测序试剂盒还包括：缓冲液(buffer)，镁离子(Mg2+)，dNTP和Taq酶；所述Taq酶优选为QIAGENHotStarTaq热启动酶。
优选的技术方案中，步骤(1)中所述PCR扩增反应条件为：
1.95℃，15min；
2.94℃，0.5min→64℃，0.5min→72℃，2.5min(重复15个循环)；
3.94℃，0.5min→60℃，0.5min→72℃，2.5min(重复15个循环)；
4.94℃，0.5min→58℃，0.5min→72℃，2.5min(重复6个循环)；
5.72℃，7min；
6.4℃保持。
本发明的基本原理是：HLA的多态性复杂，HLA-A等位基因965个，HLA-B等位基因1543个，HLA-DRB1等位基因762个，因此，要在有限的保守区的设计能扩增HLA-A，B位点的2，3，4外显子和HLA-DRB1位点2外显子的PCR引物，并分别针对不同的HLA-A，B，DRB1位点的外显子再设计测序引物。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
1.由于本发明HLA基因测序试剂盒以及测试条件的优化组合，有效地扩增HLA-A，B位点的2，3，4外显子和HLA-DRB1位点2外显子，并对相应 外显子进行测序，因此在进一步进行分型时，能够避免当某几个等位基因核苷酸位于扩增区域之外时无法进行有效分型的问题，提高了对HLA基因分型的分辨率和精确性。
2.由于本发明HLA基因测序试剂盒中主要试剂自行配置并优化，大大降低的试剂成本。
3.现有的国外进口试剂只对HLA第2、3外显子进行检测，分型结果组合多；本发明对HLA第2、3、4外显子进行测序，分型结果组合少。
4.现有国外进口试剂是针对美国高加索和美国黑人的常见HLA等位基因设计的引物序列，可能会造成中国人群的HLA等位基因发生漏检，而本发明在测试过程中检测对象均为我国人群，经过验证证明使用本发明所述试剂盒进行检验的结果可靠，能更好地弥补上述不足，得到正确结果。
附图说明
图1是实施例一中HLA-A，B结构图上PCR扩增引物，测序引物位置示意图；
图2是实施例一中HLA-DRB1结构图上PCR扩增引物，测序引物位置示意图；
图3是实施例一中HLA-A基因第2外显子测序图；
图4是实施例一中HLA-A基因第3外显子测序图；
图5是实施例一中HLA-A基因第4外显子测序图；
图6是实施例一中HLA-B基因第2外显子测序图；
图7是实施例一中HLA-B基因第3外显子测序图；
图8是实施例一中HLA-B基因第4外显子测序图；
图9是实施例一中HLA-DRB1基因第2外显子测序图；
图10是实施例二试验组中HLA-A基因第2外显子测序图；
图11是实施例二试验组中HLA-A基因第3外显子测序图；
图12是实施例二试验组中HLA-A基因第4外显子测序图；
图13是实施例二试验组中HLA-B基因第2外显子测序图；
图14是实施例二试验组中HLA-B基因第3外显子测序图；
图15是实施例二试验组中HLA-B基因第4外显子测序图；
图16是实施例二试验组中HLA-DRB1基因第2外显子测序图；
图17是实施例二对照组中HLA-A基因第2外显子测序图；
图18是实施例二对照组中HLA-A基因第3外显子测序图；
图19是实施例二对照组中HLA-A基因第4外显子测序图；
图20是实施例二对照组中HLA-B基因第2外显子测序图；
图21是实施例二对照组中HLA-B基因第3外显子测序图；
图22是实施例二对照组中HLA-B基因第4外显子测序图；
图23是实施例二对照组中HLA-DRB1基因第2外显子测序图；
图24是实施例一所得HLA-A PCR产物电泳图；
图25是实施例一所得HLA-B PCR产物电泳图；
图26是实施例一所得HLA-DRB1 PCR产物电泳图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
实施例一：
采用核苷酸序列表所述PCR扩增引物和测序引物(所述引物的位置如图1、2所示)，对人血样进行HLA-A，B，DRB1位点的高分辨率基因分型，具体步骤如下：
(1)提取基因组DNA
按照Promaga公司基因组DNA抽提试剂盒操作说明书进行抽提。
(2)PCR扩增
分别使用不同的引物对步骤(1)中提取的基因组DNA。使用HLA-A位点扩增引物(SEQ ID No.1和SEQ ID No.2)进行HLA-A分型的扩增；使用HLA-B位点扩增引物(SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5)进行HLA-B分型的扩增；使用HLA-DRB1位点扩增引物(SEQ ID No.6～SEQ ID No.15)进行HLA-DRB1分型的扩增；上述扩增过程和扩增反应体系均如下：
所述PCR扩增反应条件为：
1.95℃，15min；
2.94℃，0.5min→64℃，0.5min→72℃，2.5min(重复15个循环)；
3.94℃，0.5min→60℃，0.5min→72℃，2.5min(重复15个循环)；
4.94℃，0.5min→58℃，0.5min→72℃，2.5min(重复6个循环)；
5.72℃，7min；
6.4℃保持；
所述PCR反应体系为50μl，其组成如下表所示，
其中，10×扩增缓冲液、5×Q buffer、Mg2+(25mM)、Taq DNA聚合酶购自Qiagen公司，dNTPs(10mM)、引物购自上海生工。
扩增所得PCR产物的电泳图如图24、25、26所示，结果表明得到目的基因片段。
按照常规技术对PCR扩增产物进行纯化。
(3)使用测序引物进行测序扩增。
分别使用不同的引物对步骤(2)中纯化的PCR产物进行测序扩增，使用HLA-A位点(第2、3、4外显子)测序引物(SEQ ID No.16～SEQ ID No.21)分别扩增HLA-A的第2、3、4外显子；使用HLA-B位点(第2、3、4外显子)测序引物(SEQ ID No.22～SEQ ID No.27)分别扩增HLA-B的第2、3、4外显子；使用HLA-DRB1位点(第2外显子)测序引物(SEQ ID No.28～SEQ ID No.30)扩增HLA-DRB1的第2外显子；上述测序扩增过程和测序扩增反应体系均如下：
所述测序扩增反应条件为：94℃，0.5min→50℃，0.5min→60℃，2.5min (重复25个循环)
所述测序扩增反应体系为10μl，其组成如下表所示，
| BigdyeV3.1 | 4μl |
| ddH2O | 3μl |
| Sequencing引物(10μM) | 1μl |
| PCR产物 | 2μl |
其中，BigdyeV3.1购自ABI公司。
按照常规方法纯化测序扩增产物。
(4)进行外显子测序。
使用ABI公司3730测序仪对经过纯化的测序扩增产物进行测序，测序结果如图3至图9。
实施例二
分别采用美国Abbott公司的HLA测序试剂盒，实施例一中的HLA测序试剂盒及方法对同一血样进行HLA-A，B，DRB1位点的高分辨率基因分型。
分别得到HLA-A(第2、3、4外显子)测序图，HLA-B(第2、3、4外显子)测序图，HLA-DRB1第2外显子测序图。
采用实施例一中的HLA测序试剂盒及方法得到的测序图(试验组)为图10到图16；采用美国Abbott公司的HLA测序试剂盒得到的测序图(对照组)为图17到图23。
对比HLA-A基因第2、3、4外显子测序图可知：
对照组HLA-A Exon2正反向测序峰图的信号强度：A2F A(232)G(227)C(279)T(345)；A2R A(155)G(361)C(276)T(217)；
实验组HLA-A Exon2正反向测序峰图的信号强度：A2F A(461)G(705)C(545)T(275)；A2R A(51)G(133)C(105)T(91)；
对照组HLA-A Exon3正反向测序峰图的信号强度：A3F A(758)G(1336)C(1058)T(827；A3R A(440)G(903)C(696)T(502)；
实验组HLA-A Exon3正反向测序峰图的信号强度：A3F A(495)G (918)C(663)T(514)；A3R A(195)G(430)C(358)T(258)；
对照组HLA-A Exon4正反向测序峰图的信号强度：A4F A(774)G(1142)C(674)T(583)；A4R A(712)G(1233)C(870)T(962)；
实验组HLA-A Exon4正反向测序峰图的信号强度：A4F A(506)G(716)C(469)T(421)；A4R A(325)G(551)C(390)T(405)；
从以上测序图分析可以得出，实验组HLA-A位点信号质量与对照组基本一致，实验组的信号强度整体比对照组稍弱，但两组数据通过软件分析所得基因分型结果一致。
对比HLA-B基因第2、3、4外显子测序图可知：
对照组HLA-B Exon2正反向测序峰图的信号强度：B2F A(725)G(1210)C(955)T(795)；B2R A(451)G(1100)C(957)T(1001)；
实验组HLA-B Exon2正反向测序峰图的信号强度：B2F A(699)G(1056)C(1002)T(839)；B2R A(343)G(839)C(787)T(923)；
对照组HLA-B Exon3正反向测序峰图的信号强度：B3F A(410)G(715)C(568)T(419)；B3R A(166)G(331)C(247)T(222)；
实验组HLA-B Exon3正反向测序峰图的信号强度：B3F A(726)G(1076)C(896)T(717)；B3R A(319)G(608)C(527)T(437)；
对照组HLA-B Exon4正反向测序峰图的信号强度：B4F A(720)G(1086)C(848)T(870)；B4R A(208)G(380)C(243)T(323)；
实验组HLA-B Exon4正反向测序峰图的信号强度：B4F A(310)G(433)C(364)T(417)；B4R A(203)G(364)C(236)T(340)；
从以上测序图分析可以得出，实验组HLA-B3R信号强度比对照组强一倍，其余实验组HLA-B位点信号质量和对照组基本相近，并且两组数据通过软件分析所得基因分型结果完全一致。
对比HLA-DRB1基因第2外显子测序图可知：
对照组HLA-DRB1Exon2正反向测序峰图的信号强度：DRB2F A(403)G(574)C(478)T(627)；DRB2R A(353)G(539)C(534)T(723)；
实验组HLA-DRB1 Exon2正反向测序峰图的信号强度：DRB2F A(271)G(575)C(258)T(302)；DRB2R A(286)G(463)C(338)T(337)；
从以上测序图分析可以得出，实验组HLA-DRB1位点信号质量与对照组基本一致，实验组的信号强度整体比对照组稍弱，但两组数据通过软件分析所得基因分型结果一致。
实施例三，美国UCLA大学的国际质控和中华骨髓库质控的实验结果
中华骨髓库HLA质控样本基本上是选择中国人常见的等位基因组合，而用本发明试剂也未发现漏检现象，与对照试剂结果完全一致。美国UCLA大学的HLA质控样本包括了世界范围内各人种的HLA等位基因组合，特别是中国人群十分罕见的等位基因比如A＊0260，B＊1535等，其结果也与对照试剂相符合。
Claims (2)
1.一种人类白细胞抗原基因的分型方法，包括以下步骤：
(1)按照常规技术提取待测基因组DNA，使用PCR扩增引物扩增所要分析的目的基因片段；
(2)使用测序引物对步骤(1)所得PCR产物进行扩增，扩增各外显子，然后对扩增出的各外显子进行测序，并将测序结果与数据库中的标准序列进行比较，从而确定基因分型结果；
其特征在于，其中，步骤(1)中所述目的基因片段包括HLA-A的2，3，4外显子，HLA-B的2，3，4外显子和HLA-DRB1位点2外显子；
相应的PCR扩增引物对包括：HLA-A位点扩增引物，HLA-B位点扩增引物和HLA-DRB1位点扩增引物；
其中，所述HLA-A位点扩增引物包括：
正义引物，SEQ ID No.1：CCATTGGGTGTCGGGTTTC；
反义引物，SEQ ID No.2：CAGCAATGATGCCCACGATG；
所述HLA-B位点扩增引物包括：
正义引物1，SEQ ID No.3：CCCTGAGTTTCACTTCTTCTCCCA；
正义引物2，SEQ ID No.4：CCACGAGTTTCACTTCTTCTCCCA；
反义引物，SEQ ID No.5：CCAGCAACAATGCCCACGAT；
所述HLA-DRB1位点扩增引物包括：
G1，SEQ ID No.6：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTTGTGGCAGCTTAAGTT；
G2，SEQ ID No.7：TGTAAAACGACGGCCAGTTCCTGTGGCAGCCTAAGAGG；
G3，SEQ ID No.8：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTTGGAGTACTCTACGT；
G4，SEQ ID No.9：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTTGGAGCAGGTTAAAC；
G7，SEQ ID No.10：GTAAAACGACGGCCAGTTCCTGTGGCAGGGTAAGTATA；
G8，SEQ ID No.11：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTTGGAGTACTCTACGG；
G9，SEQ ID No.12：TGTAATACGACGGCCAGTTCTTGAAGCAGGATAAGTT；
G10，SEQ ID No.13：TGTAATACGACGGCCAGTTCTTGGAGGAGGTTAAGTT；
R，SEQ ID No.14：CAGGAAACAGCTATGACCGCTCACCTCGCCGCTGCAC；
R＊09，SEQ ID No.15：CAGGAAACAGCTATGACCGCTTACCTCGCCTCTGCAC；
步骤(2)中，相应的测序引物包括：HLA-A位点的第2、3、4外显子测序引物，HLA-B位点的第2、3、4外显子测序引物和HLA-DRB1位点的第2外显子测序引物；
所述HLA-A位点的第2外显子测序引物包括：
A2F，SEQ ID No.16：CGGGGAGAAGCAASGG；
A2R，SEQ ID No.17：CGGACCCGGAGACTGTG；
所述HLA-A位点的第3外显子测序引物包括：
A3F，SEQ ID No.18：GGTTTCATTTTCAGTTTAGGC；
A3R，SEQ ID No.19：TTGTCTCCCCTCCTTGTGG；
所述HLA-A位点的第4外显子测序引物包括：
A4F，SEQ ID No.20：GGTGTCCTGTCCATTCTCAAG；
A4R，SEQ ID No.21：CAGAGAGGCTCCTGCT；
所述HLA-B位点的第2外显子测序引物包括：
B2F，SEQ ID No.22：CCCAGGCTCCCACTCCAT；
B2R，SEQ ID No.23：GGGGAGTCGTGACCTGC；
所述HLA-B位点的第3外显子测序引物包括：
B3F，SEQ ID No.24：GGCCAGGGTCTCACAC；
B3R，SEQ ID No.25：GGCGACATTCTAGCGC；
所述HLA-B位点的第4外显子测序引物包括：
B4F，SEQ ID No.26：AGATGCAAAGCGCCTGAA；
B4R，SEQ ID No.27：GGCTCCTGCTTTCCCTGA；
所述HLA-DRB1位点的第2外显子测序引物包括：
M13F，SEQ ID No.28：TGTAAAACGACGGCCAGT；
M13R，SEQ ID No.29：CAGGAAACAGCTATGACC；
Codon 86，SEQ ID No.30：CTGCACTGTGAAGCTCTCCA。
2.一种HLA高分辨基因测序试剂盒，含有PCR扩增引物和测序引物，其特征在于，所述PCR扩增引物分别具有SEQ ID No.1至SEQ ID No.15所述的碱基序列，所述测序引物分别具有SEQ ID No.16至SEQ ID No.30所述的碱基序列。
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