CN105283557A - 使用下一代系统深度测序hla 基因扩增子定量分析混合物来非侵入性早期检测实体器官移植物排斥反应 - Google Patents

Abstract

本发明是一种检测或评估实体器官移植物(graft)(移植物(transplant))排斥反应的方法，所述方法通过检测移植物(graft)(移植物(transplant))受体的血液样品中的供体特异的HLA等位基因来进行。本发明还包括检测子代血液样品中母体细胞的存在的方法。

Description

使用下一代系统深度测序HLA 基因扩增子定量分析混合物来非侵入性早期检测实体器官移植物排斥反应

发明背景

早期检测实体器官移植物排斥反应或移植物损伤是显著未满足的临床需求。基于活检的方法具有差的灵敏度和高的严重并发症的风险。因此，特别吸引人的是非侵入性检测，其不需要活检移植的器官。目前，检测血清肌酸酐是移植物排斥反应或损伤的非侵入性检测。然而，该检测不是非常特异的。此外，可检测的该标志物的上升在移植物排斥反应过程较晚出现，此时其对于拯救器官常常太晚了。

已经有一些尝试去开发基于核酸的非侵入性方法，用于检测移植物排斥反应。一些方法依赖于移植物排斥反应信号，如某些排斥反应-相关基因的表达。参见，例如，Hartono等人，(2011)Non-invasiveDiagnosisofAcuteRejectionofRenalAllografts.CurrOpinOrganTransplant15:35。也已经有尝试去审视受体(recipient)血液中的供体特异的核酸。这些最初限制于在男性捐献的器官的女性受体中检测的Y-染色体基因。Morelra等人,(2009)Cell-freeDNAasnon-invasiveacuterejectionmarkerinrenaltransplantation.Clin.Chem.55:11；Snyder等人，(2011)Universalnoninvasivedetectionofsolidorgantransplantrejection.PNAS108:6229。还有早期尝试以检测受体的血浆中供体特异的HLA序列。Gadi等人，(2006)SolubledonorDNAconcentionsinrecipient’sserumcorrelatewithpancreas-kidneyrejction.Clin.Chem.52:3。然而，这些尝试广泛地被批评为不成功的：检测的预测价值低，因为在各组患者中存在信号的巨大变化。(在Baxter-Lowe，L.，和Busch，M.，(2006)TrackingMicrochimericDNAinPlasmatoDiagnoseandManageOrganTransplantRejectionClinChem52:4中综述)。至今，移植物排斥反应的早期检测，没有可信的非侵入性检测。

发明概述

在一个实施方案中，本发明是一种通过确定受体的血液样品中供体核酸的分数来确定实体器官移植物排斥反应或损伤的方法，所述方法包括：提供来自受体的血液样品；对样品探测在至少一个基因座处至少一个供体HLA等位基因的存在；并且如果检测到供体HLA等位基因，则诊断移植物排斥反应或损伤。在该实施方案的变化形式中，所述方法还包括确定供体HLA等位基因的分数(fraction)，并且如果该分数超过预定的阈值，则诊断移植物排斥反应或损伤。在该实施方案的进一步变化形式中，所述确定步骤包括计算在样品中检测的同一基因座处至少一个供体HLA等位基因的量与所有HLA等位基因的量的总和的比率。在该实施方案的更进一步变化形式中，在至少两个基因座处检测所述供体和受体HLA等位基因，所述至少两个基因座彼此连锁不平衡(linkagedisequilibrium)。在该实施方案的更进一步变化形式中，在至少两个基因座处检测所述供体和受体HLA等位基因，所述至少两个基因座彼此不是连锁不平衡。在该实施方案的更进一步变化形式中，所述至少一个基因座选自HLA-A，HLA-B，HLA-C，DRB1，DRB3，DRB4，DRB5，DQA1，DQB1，DPA1，和DPB1。在该实施方案的更进一步变化形式中，所述至少一种供体和受体HLA等位基因包括选自DQA1，外显子2；DQB1，外显子2和3；DPA1，外显子2；DBP1，外显子2；DRB1，外显子2；DRB3，外显子2；DRB4，外显子2；和DRB5，外显子2的序列或来自所述HLA基因的内含子序列或来自所述基因的外显子和内含子序列的组合。在该实施方案的更进一步变化形式中，对于HLA等位基因的探测步骤包括测序，尤其是克隆测序。在该实施方案的更进一步变化形式中，探测包括利用表1中公开的寡核苷酸扩增或检测。在该实施方案的更进一步变化形式中，所述方法还包括在测序之前的靶富集步骤。所述靶富集步骤可以包括至少一轮的基因组DNA扩增或靶捕获。所述克隆测序可以包括以正向引物和反向引物进行的克隆扩增步骤，各个引物包括接头序列和HLA-杂交序列。在该实施方案的更进一步变化形式中，对于HLA等位基因的探测包括以下步骤：利用正向引物和反向引物扩增以获得HLA扩增子；进行克隆测序以确定HLA扩增子的序列；在以上确定的序列中，鉴定在同一基因座处的至少一种受体HLA等位基因和至少一个供体HLA等位基因；比较以上鉴定的受体和供体HLA序列的数量从而确定样品中供体核酸的分数。上述方法中的至少一种引物可以选自表1。在该实施方案的更进一步变化形式中，所述鉴定步骤包括以下计算步骤：将HLA基因座处的序列与HLA序列数据库比较；将所述序列分选到多个与已知HLA等位基因对应的箱(bin)中；鉴定一种或两种多数序列为受体等位基因；鉴定一种或两种最有代表性的少数序列为供体等位基因。在该实施方案的更进一步变化形式中，在两个、三个或更多个基因座处检测在同一基因座处的供体HLA等位基因和受体HLA等位基因。所述三个或更多个基因座可以包含来自基因DPB1，DQB1和DRB1的序列。在该实施方案的更进一步变化形式中，两个、三个或更多个基因座处的供体和受体HLA等位基因通过多重PCR在相同反应体积中同时扩增。在该实施方案的更进一步变化形式中，通过这样的方法定量检测所述HLA等位基因，所述方法包括：将样品分为多个反应体积，各自包含零至约五个拷贝的靶HLA等位基因；对各个反应体积测定靶HLA等位基因的存在；比较同一基因座处含有供体HLA等位基因的反应体积的数量和含有受体HLA等位基因的反应体积的数量，从而确定样品中供体核酸的分数。在该实施方案的变化形式中，所述测定包括用寡核苷酸PCR扩增，所述寡核苷酸中至少一种选自表1。在该实施方案的进一步变化形式中，所述方法还包括独立获得在至少一个HLA基因座处的供体和受体的基因型信息。

在另一个实施方案中，本发明是通过确定受体的血液中的供体DNA的浓度是否超过阈值水平来确定移植物受体是否具有或可能发展出移植物排斥反应的方法，其中供体DNA的浓度通过这样的方法确定，所述方法包括提供一个体积的来自受体的血液样品；定量检测在所述体积的样品中的至少一个供体HLA等位基因，确定供体DNA的浓度并将其与阈值比较，其中如果达到或超过所述阈值，则受体具有或可能发展出移植物排斥反应。在该实施方案的变化形式中，所述至少一个供体HLA等位基因选自HLA-A，HLA-B，HLA-C，DRB1，DRB3，DRB4，DRB5，DQA1，DQB1，DPA1，和DPB1等位基因。在该实施方案的进一步变化形式中，所述至少一个供体HLA等位基因选自DQA1，外显子2；DQB1，外显子2和3；DPA1，外显子2；DBP1，外显子2；DRB1，外显子2；DRB3，外显子2；DRB4，外显子2；和DRB5，外显子2或来自所述基因的外显子和内含子序列的组合。在该实施方案的更进一步变化形式中，在两个、三个或更多个基因座处检测在同一基因座处的供体HLA等位基因和受体HLA等位基因。所述三个或更多个基因座可以包括来自基因DPB1，DQB1和DRB1的序列。

在另一个实施方案中，本发明是一种通过定期确定受体的血液中供体HLA等位基因的分数来监视移植物受体发展移植物排斥反应的方法，并且如果检测到供体DNA的分数增加，则诊断所述患者具有或可能发展出移植物排斥反应。

在另一个实施方案中，本发明是一种定量检测SCID儿童的血液中母体细胞的方法，所述方法包括：从所述儿童获得血液样品；对样品探测在至少一个基因座处至少一种非传播的母体HLA等位基因的存在；定量在探测步骤中检测的母体等位基因，从而定量检测母体细胞。

发明详述

定义

术语“等位基因”是指基因的序列变体。一种以上遗传差异可以构成等位基因。对于HLA等位基因，通常，多种遗传差异构成等位基因(即，多数等位基因彼此差异多于一个碱基)。如本文使用的，受体等位基因是受体中存在的两个等位基因中的一个(或纯合个体中存在的单个等位基因)。提供信息的供体等位基因是存在于供体中但不存在于受体中的等位基因。

在“克隆分析”的情况下的术语“克隆”是指分开分析全都源自单个分子的分子的聚集体或群体。例如，“克隆测序”是指分别测序源自相同分子的各个扩增子。

术语“深度测序”是指一种测序方法，其中在单个测试中多次读取靶序列。单次深度测序运行由在相同靶序列上运行的大量测序反应组成，并且所述测序反应产生独立的序列读出。

“数字分析”或“数字稀释”的情况下的术语“数字”是指分析样品中存在的多种个体分子中的每个。数字稀释是指将样品分配成多个反应体积，在那里，平均每个反应体积中存在一个或更少的分子。在一些情况下，数字稀释使得能够数字读出，例如从各个个体分子获得是/或否的结果并且将通过计数克隆序列数从分子群体获得的数字结果制表。在大量的个体反应体积的情况下，大于一个分子/反应体积的数字稀释可以实际上获得最大的定量准确性和精确度。

术语“供体HLA”序列和“供体HLA序列”可以相互替代使用，表示器官供体中存在的HLA序列。在本发明的情况下，使用存在于器官供体中但不存在于器官受体中的供体序列。

术语“受体HLA”序列和“受体的HLA序列”相互替代使用，表示存在于器官受体中的HLA序列。在本发明的情况中，使用存在于器官受体中但不存在于器官供体中的受体序列。

术语“多态性”是指这样的情况，其中可以在群体中发现基因组序列，或编码的氨基酸序列的两个以上变体。“单核苷酸多态性”(SNP)是这样的多态性，其中序列中的变化形式由基因组序列中的单个多态核苷酸位置组成。

术语“基因型”是指包含在个体中或源自个体的样品中的一种以上基因的一种以上等位基因的组合。

术语“单倍型”是指存在于个体的相同染色体上的一种以上基因的一种以上等位基因的组合。

术语“确定HLA基因的基因型”是指在受试者中确定选择的HLA等位基因的组合。例如，在本发明中，“确定HLA-A基因的基因型”是指鉴定存在于HLA-A基因的一个以上外显子，例如，外显子2，3和4中的至少一个多态的残基(等位基因决定物)。以类似的方式，可以确定基因HLA-B，HLA-C，DRB1，DRB3，DRB4，DRB5，DPB1，DPA1，DQA1和DQB1的基因型。

术语“数字小滴PCR”或“ddPCR”是指在由数字稀释样品得到的多个反应体积(“小滴”)中进行的PCR。

术语“靶区域”是指要分析的核酸序列区域。

术语“核酸”是指核苷酸(例如，核糖核苷酸或脱氧核糖-核苷酸)的聚合物，既是天然的也是非天然的。术语不受聚合物的长度(例如，单体数量)限制。核酸可以是单链的或双链的并且将通常含有5’-3’磷酸二酯键，尽管在一些情况下，核苷酸类似物可以具有其它连接。核酸可以包括天然存在的碱基(腺苷，胍，胞嘧啶，尿嘧啶和胸腺嘧啶)以及非天然碱基。术语“非天然核苷酸”或“修饰的核苷酸”是指包含修饰的含氮碱基、糖或磷酸根基团的核苷酸，或在其结构中并入非天然部分的核苷酸。非天然核苷酸的实例包括二脱氧核苷酸，生物素化的，胺化的，脱胺化的，烷基化的，苄化的和荧光标记的核苷酸。

术语“引物”是指通过核酸聚合酶在适当条件下用作起始DNA合成的点的短核酸(寡核苷酸)，所述适当条件通常包括适当的缓冲液、存在核酸前体和一种以上任选的辅因子和适当的温度。引物通常包括至少一个与靶杂交的区域，所述区域至少基本上与靶序列互补。该区域通常长度是约15至约40个核苷酸。

术语引物的“接头区域”或“接头”是指引物的通常位于靶-杂交区域的5'的区域。通常所述接头在之后的分析步骤起作用。例如，所述接头可以与缀合于微粒或其它固体表面，用于扩增，例如，乳液PCR的寡核苷酸杂交。所述接头还可以用作用于随后步骤的引物，例如，测序引物的结合位点。接头区域通常长度为15至30个核苷酸。

术语“个体鉴定标签”、“鉴定标签”、“多重鉴定标签”或“MID”在本文中相互替代使用，是指用作从特定样品获得的DNA的标志物的引物区域。

术语“扩增条件"是指允许引物的杂交和模板依赖性延伸的核酸扩增反应(例如，PCR扩增)中的条件。术语“扩增子”是指含有靶核酸序列的全部或片段并且通过任意合适的扩增方法形成为体外扩增的产物的核酸分子。各种PCR条件在PCRStrategies(M.A.Innis，D.H.Gelfand，和J.J.Sninsky编辑，1995，AcademicPress，SanDiego，CA)在第14章；PCRProtocols：AGuidetoMethodsandApplications(M.A.Innis，D.H.Gelfand，J.J.Sninsky，和T.J.Whiteeds.，AcademicPress，NY，1990)中描述。

术语“热稳定的核酸聚合酶”或“热稳定的聚合酶”是指与例如来自大肠杆菌的聚合酶相比，在升高的温度较稳定的聚合酶。热稳定的聚合酶适于在典型地聚合酶链式反应(“PCR”)的温度循环条件下使用。示例性的热稳定的聚合酶包括来自嗜热链球菌(Thermusthermophilus)，Thermuscaldophilus，嗜热栖热菌属(Thermussp.)Z05(参见，例如，美国专利号5,674,738)和嗜热栖热菌属(Thermussp.)Z05聚合酶的突变体，栖热水生菌(Thermusaquaticus)，嗜热黄曲霉(Thermusflavus)，Thermusfiliformis，嗜热栖热菌属(Thermussp.)sps17，耐辐射球菌(Deinococcusradiodurans)，温泉家族(HotSpringfamily)B/克隆7，嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)，热坚芽孢杆菌(Bacilluscaldotenax)，海栖热袍菌(Thermotogamaritima)，新阿波罗栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)和非洲栖热腔菌(Thermosiphoafricanus)的那些。

术语“样品”是指含有或被认为含有来自个体的核酸的任意组合物。在本发明的情况下，其中检测供体DNA的样品是受体的血液和源自其的级分，例如血浆。要理解，本文公开的分析在从血液分离的血浆样品上进行，即，术语“在患者的血液中检测”和“在患者的血浆中检测”相互替代地用于表示，血液获自患者并且源自其的血浆用于分析。对于本发明的某些方面，例如对于供体和受体的基因型的确定，可以使用任何其它类型的身体样品，包括但不限于，皮肤、血浆、血清、全血和血液成分、唾液、尿、泪液、精液、阴道液和其它液体和组织，包括石蜡包埋的组织。样品还可以包括从个体获得的体外细胞培养物的构成部分和成分。

术语与核酸测序相关的“有效读取”是指成功分配(有或没有纠错)至特定基因组序列的序列读取。关于HLA等位基因，有效读取是成功分配(有或没有纠错)至预期存在于样品中的一种HLA等位基因的序列读取。不可能分配给预期存在于样品中的任意等位基因的读取是无效读取。

本发明是使用核酸的克隆分析，例如，克隆测序(下一代测序(NGS)或大规模平行测序(MPS))或数字小滴PCR(ddPCR)，或包括数字读出或克隆分析以进行移植物排斥反应或损伤的非侵入性早期检测的可用的或将变得可用的任意其它技术。已经报道了，当移植的实体器官的排斥反应或损伤发生时，可以在受体的血浆中找到来自供体组织的DNA。本发明包括精确定量供体特异的DNA序列在移植物受体的血浆中的量和比例。可信的检测需要数字分析血浆DNA，因为当由于移植物排斥反应供体DNA的水平上升时，预期仅小部分(几个百分数或更少)的总血浆DNA源自移植物。通过提供信息的遗传标志物，即在供体和受体之间多态的标志物的存在，鉴定供体DNA。例如，本发明可以通过靶向多态的基因体系，如HLA来进行。

本发明是一种检测或监视实体器官移植物排斥反应的开始或进展的方法，所述方法包括对移植物受体的血液或血浆探测来自供体的HLA核酸序列，并且如果发现源自供体的序列，则诊断为移植物排斥反应。本发明任选地包括定量受体的血液或血浆中供体HLA核酸序列的量和分数，并且如果所述分数高于通过分析源自成功移植物的受体的样品确定的阈值，则诊断为移植物排斥反应。本发明还包括通过重复对移植物受体的血液或血浆探测源自供体的HLA核酸序列，对患者监视移植物排斥反应的开始或进展，并且如果源自供体的序列的量或分数增加，则诊断为移植物排斥反应。

本发明提供早期检测实体器官移植物排斥反应或损伤的方法，所述方法通过使用人白细胞抗原(HLA)基因座的独特性质进行。HLA基因座的基因(HLA基因)在人基因组中是最多态的。HLA基因座跨染色体6的短臂上的约350万碱基对。主要区域是I型区和II型区。I型基因是HLA-A，HLA-B，和HLA-C并且主要的II型基因是HLA-DP，HLA-DQ和HLA-DR。在蛋白水平表达的多态性反映在HLA抗原的氨基酸序列中并且因此对于移植的组织分型有极大意义。这些多态性对于II型基因主要位于外显子2中并且对于I型基因主要位于外显子2和3中。移植前，在供体和受体之间，当可能时，通常匹配某些HLA基因座(HLA-A，HLA-B和DR)并且因此可能在本发明的情况下没有用。其它HLA基因座，例如，DP基因座通常不包括在匹配中并且因此对于特定供体-受体对提供信息。本发明使得能够使用多个HLA基因座，从而对于多数供体-受体对可以发现至少一个提供信息的基因座。

选择HLA基因座作为要检测的靶供体序列远好于现有文献中描述的靶点。例如，检测Y-染色体序列的方法排除了性别匹配的供体和所有男性受体。相反，HLA基因位于常染色体(染色体6)上并且因此可以在所有性别组合中都检测。此外，基于HLA的方法对于靶向个体单核苷酸差异(SNPs)的那些较好。因为大多数扩增和测序技术是易错的，所以察觉到的单核苷酸改变有时是人为假象并且不是真的SNP。相反，HLA等位基因彼此相差多个核苷酸。因此，包括检测HLA基因座内的等位基因的方法比靶向非HLA基因座的方法更不容易错误。目前可用的使用例如，克隆测序的HLA基因分型方法使得能够将多连锁多态性的相设定在外显子内并且使得可能明确确定各个HLA等位基因的序列。该特征在将供体DNA与受体DNA相区别和准确定量供体DNA的量方面增加了额外的准确程度。

本发明是一种诊断移植物排斥反应或移植物损伤的方法，所述方法通过检测和定量移植物受体的血液或血浆中存在的无细胞DNA中的移植物供体的HLA序列进行。在一些实施方案中，所述方法还包括监视受体的血液或血浆中供体DNA的量或浓度，并且如果检测到增加，则鉴定为移植物受体为具有或可能发展出移植物排斥反应。在一些实施方案中，本发明还包括确定在一种以上HLA基因座处供体和受体的HLA基因型的预备步骤。在本发明的一些实施方案中，例如，克隆测序，该步骤是任选的，因为克隆测序方法将揭示多数HLA序列(受体的)，并且如果存在，对于未在供体和受体之间匹配的多态的HLA基因座的少数HLA序列(供体的)。

为了确保发现提供信息的HLA基因座，在一些实施方案中，所述方法包括探测和检测多于一个，即，多态的HLA基因座的组合。任何多态的HLA基因或基因座或基因座的组合可以利用本发明的方法使用。在一些实施方案中，HLA基因或基因组合选自HLA-A，HLA-B，HLA-C，DRB1，DRB3，DRB4，DRB5，DQA1，DQB1，DPA1，和DPB1。在一些实施方案中，靶向HLA基因的特定外显子或外显子的部分(或其组合)，例如，DQA1：外显子2；DQB1：外显子2和3；DPA1：外显子2；DBP1：外显子2；DRB1：外显子2，DRB3：外显子2；DRB4：外显子2；和DRB5：外显子2。在其它实施方案中，所述多态的HLA基因序列包括内含子序列或外显子和内含子序列的组合。

本发明包括检测存在于移植物受体的血浆中的DNA中的多态的HLA基因座。已经报道，人血浆中存在的大量DNA源自经历了凋亡的细胞并且短于或等于约180碱基对。该大小对应于缠绕单个核小体的DNA的片段，参见，例如，WO2013060762，报道了，从人血浆分离的DNA的大小范围从85至230碱基对并且平均为142碱基对。基于本领域的知识和初步实验，本发明人猜测，排斥移植物的器官移植物受体的血浆中存在的供体DNA可能也是小的。用于本发明的模板DNA的短尺寸存在特定的挑战。因为仅短的扩增子是可能的，所以可以被检测的多态性的数量受限。然而，本发明人通过设计适当的引物如例如，表1中列出的那些，克服了该问题。

在一些实施方案中，以基因板(panel)的形式在同一反应中分析多种HLA基因或基因座。在一个实施方案中，所述板含有不密切关联的和不是连锁不平衡的HLA基因序列。当供体和受体的准确HLA基因型尚未确定时，该方法是特别有利的：使用多个不关联的基因座保证了至少一些基因座将是提供信息的(即，供体和受体之间的在供体中存在，而受体中不存在的多态的等位基因)。例如，在该实施方案的变化形式中，同时分析来自基因DPB1，DQB1和DRB1的序列。在另一个实施方案中，所述板由强烈连锁不平衡的密切关联的基因序列形成。该方法保证了产生对应于不同于受体的等位基因的已知HLA等位基因的序列的实验误差如受体的序列中的测序误差被识别并且作为“噪声”而不是“信号”被去除。例如，如果来自DQA1基因座的序列读取与受体的等位基因相差一个碱基，原则上，这些能够反映未知供体等位基因或者，相反，反映受体的等位基因中的测序误差。如果实际上这些DQA1非受体序列源自供体DNA，那么基于已知的连锁不平衡模式，人们将预期供体会具有某些DQB1或DRB1等位基因。如果非受体的DQA1序列实际上是测序误差，那么极为不可能的是，受体的DQB1或DRB1序列中的独立测序误差将产生预期的DQB1或DRB1等位基因。这使得，如果供体和受体基因型是未知的，则人们可以区分供体等位基因，并且如果误差导致与已知HLA等位基因对应的序列，则人们可以将供体等位基因与受体等位基因中的测序误差相区分。本发明的一个实施方案包括检测包括彼此连锁不平衡的两种以上等位基因的HLA等位基因和与其余的不是连锁不平衡的至少一种等位基因的组合。例如，在该实施方案的变化形式中，同时分析来自基因DPB1，DQB1和DRB1的序列。

同时分析多个基因座可以以平行反应进行或通过组合一个多重反应中的分开的反应，例如，基因组PCR来进行，其中多种扩增引物存在于同一反应体积中。在一些实施方案中，本发明的方法包括测序步骤，其使得能够定量检测样品中受体和供体HLA等位基因。

在该实施方案中，所述方法利用由克隆分析带来的精确性，因为预期受体的血浆或血液中的总DNA的仅小部分(几个百分数)源自供体。一种合适的方法是通过克隆测序的“深度测序”，其也称为大规模平行测序(MPS)或下一代测序(NGS)。下一代测序方法平行克隆增殖数百万个单个DNA分子。然后各个克隆群体分别测序。有时，NGS(MPS)方法也称为克隆测序。该技术的进步允许非常长的序列读取，多至250个并且最近多至700个核苷酸。然而，健康个体的血浆中的无细胞DNA以短片段存在，多数长度不大于约150个碱基对(参见WO2013060762)。对于这种短靶序列，目前存在的测序技术的强的性能得到保证。

在一些实施方案中，本发明的方法的深度测序步骤包括任选的靶富集步骤。在一些实施方案中，所述靶富集步骤包括扩增步骤。在其它实施方案中，使用其它靶富集方法，例如基于文库或基于探针的靶富集方法，其描述在例如，美国专利号7,867,703或8,383,338中。至少一轮扩增例如，第一轮可以通过本领域已知的任意方法进行。在一些实施方案中，进行多于一轮，例如，两轮的扩增。在该实施方案的变化形式中，使用相同的引物进行随后轮次的扩增，例如，通过PCR扩增。在该实施方案的其它变化形式中，引物差别在于进一步以3’-方向延伸入HLA序列(巢氏引物)或在5’-末端具有另外的序列，例如，非HLA序列。

在一些实施方案中，通过本领域中已知的任何合适的方法将富集的靶进行克隆扩增。在一些实施方案中，所述克隆扩增包括乳液PCR，其详细描述在U.S.App.Ser.No.12/245,666中。简言之，在乳液PCR期间，将来自之前轮次扩增的扩增子与缀合有能够与扩增子杂交(例如，通过与之前轮次扩增中使用的引物的接头区域杂交)的寡核苷酸的固相(例如，珠子)接触。结果，所述珠子携带与存在于珠子上的接头区域杂交的退火的扩增子。随后将珠子悬浮在水溶液中并且加入油以产生乳液。各个珠子变为悬浮在油包裹的含有进行所述克隆轮次的扩增所需要的所有试剂的微滴中。各个微滴包裹用于扩增反应的反应室。在该实施方案的变化形式中，使用两种类型的珠子：一种类型是缀合于能够与扩增子的两条链之一杂交的寡核苷酸；并且第二类型是缀合于能够与所述扩增子的另一条链杂交的寡核苷酸。在其它实施方案中，所述克隆扩增包括基于二维表面的(例如，基于载玻片的)扩增，如在例如，美国专利号7,835,871，8,244,479，8,315,817和8,412,467中所述。通常，可用或将变得可用的任何克隆扩增方法在本发明的范围内。

在一些实施方案中，用于确定受体的血浆样品中供体DNA的存在和量的克隆方法是数字小滴PCR。数字小滴PCR(ddPCR)使得能够绝对测量样品中的靶核酸，甚至在非常低的浓度也可以。ddPCR方法包括数字稀释或小滴产生、PCR扩增、检测和(任选地)分析的步骤。小滴产生步骤包括产生多个个体反应体积(小滴)，各自含有进行核酸扩增所需的试剂。PCR扩增步骤包括将小滴(或更大反应体积，其中储存有小滴)置于适于核酸靶扩增的热循环条件以产生扩增子。检测步骤包括鉴定含有或不含有扩增子的小滴(或更大反应体积，其中储存有小滴)。分析步骤包括定量，其获得例如，样品中靶核酸的浓度、绝对量或相对量(与另一个靶比较)。

ddPCR步骤可以手动进行(即，利用通用设备)或利用专门化装置，比如例如，可从Bio-RadLabs.(Hercules，Cal.),或RainDanceTech.(Billerica，Mass.)获得的ddPCR装置或可用或将变得可用的类似装置进行。在一些实施方案中，整个ddPCR步骤利用专门化装置进行。在其它实施方案中，一个以上步骤，例如，数字稀释、热循环、检测和分析以通用装置进行，所述通用装置选自例如，手动或自动的通用移液装置、热循环仪、电泳装置等。

ddPCR产物的检测可以通过检测核酸的任何通用的或序列-特异的方式进行。检测可以在反应体积内或在另外的步骤，如电泳或色谱后发生。检测可以在扩增(实时PCR)期间或扩增(终点PCR)完成后发生。可检测标记可以缀合于PCR试剂，如引物或探针。要使用的标记可通过分光镜、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其他技术检测。为了说明，有用的标记包括；放射性同位素、荧光染料、电子致密试剂、酶(如通常用于ELISA的)、半抗原和蛋白，对于其可获得抗血清或单克隆抗体。作为标记的PCR试剂的备选方案，检测可以在PCR后利用分离的标记的试剂，例如，序列-特异性标记的探针进行。备选地，可以使用检测核酸的非特异方法，如电泳接着染色。

不同于测序，本文中公开的基于ddPCR的方法得益于以下知识：HLA基因座在供体和受体之间是提供信息的(即，多态的)。在一些实施方案中，所述方法包括将供体和受体基因分型以鉴定提供信息的(informative)HLA基因座的第一步骤。如果可获得这样的信息，则单一一组PCR试剂可以用于靶向鉴定为受体的血浆样品中提供信息的HLA基因座。备选地，在没有供体的信息的情况下，可以使用一个以上选自HLA-A，HLA-B，HLA-C，DRB1，DRB3，DRB4，DRB5，DQA1，DQB1，DPA1，和DPB1的基因座将受体的样品进行ddPCR分析，希望至少一个基因座将在供体和受体之间是多态的并且将检测供体DNA。

本发明的方法中的克隆分析包括使用靶向(即，特异杂交于并能够扩增)HLA基因HLA-A，HLA-B，HLA-C，DRB1，DRB3，DRB4，DRB5，DQA1，DQB1，DPA1，和DPB1的序列的部分的引物。在一些实施方案中，所述引物靶向HLA基因的某些外显子或内含子，例如，DQA1：外显子2；DQB1：外显子2和3；DPA1：外显子2；DBP1：外显子2；DRB1：外显子2，DRB3：外显子2；DRB4：外显子2；和DRB5：外显子2。在其它实施方案中，成对的所述引物靶向外显子和内含子序列的组合。在一些实施方案中，使用表1中列出的一种以上引物。如表1中所示，一些引物是基因特异的，即，可以仅从一种HLA基因扩增序列。其它引物是通用的，即，可以从多于一种HLA基因扩增序列。

通常，HLA引物目标在于扩增和检测整个HLA外显子的序列。编码肽结合沟(groove)的HLA外显子的平均大小为约270个碱基对。因此，典型的HLA基因分型测定包括约250个碱基对的扩增子(Bentley，G.，等人，(2009)Highresolution，highthroughputHLAgenotypingbynext-generationsequencing，TissueAntigens，74:393)。相反(由于血液或血浆中发现的DNA的片段化本性)在本发明中的引物目的在于扩增和检测不长于150个碱基对的片段的序列。在本发明中使用的引物独特地将扩增短的无细胞DNA的能力与靶向HLA基因的提供信息的(即最多态的)区域的能力相结合。在一些实施方案中，本发明的方法以引物实行，所述引物包括至少一个具有表1中列出的HLA-杂交区域的引物。

表1

引物的HLA-杂交序列

*S＝C或G。引物样品含有等量的在指定位置含有C或G的寡核苷酸的混合物。

在克隆测序的一些实施方案中，通过碱基并入的方法对扩增子进行序列，例如焦磷酸测序方法(美国专利号6,274,320，6,258,568和6,210,891)；氢离子检测方法(ISFET)(例如，美国专利号8,262,900)，或染料-终止(terminator)检测方法(美国专利号7,835,871，8,244,479，8,315,817和8,412,467)。

通过本发明的方法产生的HLA序列数据包括个体DNA分子的HLA序列。用于本发明的方法的典型的NGS仪器(例如，GS家族，454LifeSciences，Branford，Conn.；ION和PGM^TM，LifeTechnologies，GrandIsland，N.Y.；和Illumina，SanDiego，Cal.)含有数据分析模块，所述模块能够定量检测样品中存在的各个序列，例如，样品中存在的在同一基因座处的各个HLA等位基因序列。随后将与供体和受体等位基因序列对应的读取的数量进行计数，以确定样品中供体等位基因的存在和量，从而检测移植物排斥反应或损伤。

计算步骤通常通过能够执行软件程序的功能的计算机进行。本发明可以利用可获得的或将成为可获得的用于分析通过克隆测序产生的个体核酸序列读取的任意合适的软件进行。所述软件可以具有唯一适于HLA序列的分析和HLA基因型分配的特定特征。例如，软件可以将从样品获得的序列读取与已知HLA等位基因的数据库相比较。这样的数据库的实例是由EuropeanMolecularBiologyLaboratory(EMBL)维护的IMGT/HLA序列数据库，参见Robinson等人(2003)IMGT/HLAandIMGT/MHC：sequencedatabasesforthestudyofthemajorhistocompatibilitycomplex，NucleicAcidsResearch，31:311。用于分析HLA序列读取的典型软件鉴定存在于样品中的读取中的多数组。在典型的人样品中，对于各个测试的HLA序列，存在不多于四组序列读取：对于在同一基因座处的两种HLA等位基因的每一种有正向读取和反向读取。(如果样品源自纯合个体，则将仅存在两种序列)。在本发明的范围内，所述软件(如提前编程的或利用用户的输入，通过用户界面)进行鉴定第三和可能的第四等位基因：存在于样品中的在同一基因座处的供体HLA等位基因的另外的功能。所述软件(如提前编程的或利用用户的输入，通过用户界面)必须允许用户将以低浓度(通常1％至5％)存在的少数供体等位基因与由于例如，PCR错参、测序误差、相关的假基因、样品中少数DNA污染等造成的人工假象(其通常以比供体等位基因更低的浓度，例如＜＜0.5％存在)相区分。

在一些实施方案中，所述软件将序列读取与HLA序列数据库比较并且在某HLA基因座处鉴定两种(或者在纯合受体的情况下为一种)最普遍的序列为受体的等位基因。不限制本发明的范围但仅通过实例的方式，ConexioHLA基因分型软件(ConexioGenomics，Ltd.，Perth，Australia)比较已经与给定扩增子(例如DQB1外显子2)的参考序列比对的合并的序列读取并且将观察到的序列读取与IMGT/HLA序列数据库相比较。将与该扩增子对应的所有读取分选入DQB1外显子2“箱”中，并且所述软件假定对于任意一个样品仅有两种等位基因序列(两种正向读取和两种反向读取)。将这些序列分选入“主要层(MasterLayer)”并且用于基因型分配。对应于人为假象或污染的所有其它序列读取(通常比真正的等位基因丰度低得多)被分选到“失败层(FailedLayer)”并且不用于基因型分配。

本发明的方法需要检测多于一种基因型，即存在于样品中的多于两种等位基因。在一些实施方案中，所述软件(如提前编程的或利用用户的输入，通过用户界面)鉴定并将多数和少数组分分选入多个代表对应于扩增子的不同等位基因组，例如，DQB1基因座的“箱”。例如，替代对于DQB1外显子2仅具有一个“箱”，所述方法包括对于在DQB1基因座(例如，DQB1*01:01，*02:01，*03:01，等)处的多种等位基因形成多个“箱”。在一些实施方案中，形成多于2个，例如，3，4，5，6个这样的箱。将与少数组分的HLA类型对应的序列分选到适当的箱中。通常也将噪声(即PCR和测序误差、假基因等)分选到每个箱的失败层中。该步骤允许快速鉴定多数组分的等位基因(受体的等位基因)，以及鉴定与少数组分(供体的等位基因)对应的读取。尤其是，即使供体和受体基因型未知，该方法也适于鉴定供体等位基因。在一些实施方案中，供体和受体基因型是已知的。在这样的实施方案中，可以改进软件以鉴定和计数特定供体和受体等位基因并且去除与其不同的作为“失败的”读取的所有读取。

在克隆测序的一些实施方案中，所述方法包括最小化由于例如，PCR错参、测序误差、相关假基因、样品中少量DNA污染等导致的人工假象产生的误差的步骤。可能的是，PCR或测序误差可以将等位基因“转化”为另一个已知HLA等位基因。尽管预期这样的事件罕见，即，以远低于供体等位基因的频率出现，但是在一些实施方案中，本发明的方法包括最小化这样的误差的步骤。例如，所述方法可以包括对两种扩增子分析强烈连锁不平衡的基因，例如，DQA1和DQB1。如果误差将多数等位基因转化为与对于DQB1已知的非受体的等位基因对应的序列，则极不可能的是，随机误差也应该将受体的DQA1等位基因转化为与人工假象的DQB1等位基因连锁不平衡的DQA1等位基因对应的序列。

在一个实施方案中，本发明是一种检测移植物排斥反应或损伤的方法，所述方法通过检测和任选地定量受体的血液或血浆样品中的供体HLA核酸来进行。本发明还包括通过定量或定量检测受体的血液或血浆样品中的供体HLA核酸来监视(即，检测移植物排斥反应的改变)移植物排斥反应，并且，如果检测到供体核酸的增加，则诊断移植物排斥反应的发生或进展。所述方法任选地包括定量检测至少一个供体HLA等位基因，在同一基因座处定量检测至少一种受体HLA等位基因；并且使用供体和受体等位基因的量，确定供体DNA在样品中的分数或供体DNA的分数是否到达或超过某阈值，从而检测移植物排斥反应。阈值可以通过测量有和没有移植物排斥反应的移植物受体的统计学显著数量和确定在与成功移植相关的移植物受体的血液或血浆中供体核酸的分数的最大值来确定。在一些实施方案中，至少一种HLA等位基因选自HLA-A，HLA-B，HLA-C，DRB1，DRB3，DRB4，DRB5，DQA1，DQB1，DPA1，和DPB1等位基因，具体地，在一些实施方案中，所述等位基因包括选自DQA1，外显子2；DQB1，外显子2和3；DPA1，外显子2；DBP1，外显子2；DRB1，外显子2；DRB3，外显子2；DRB4，外显子2；和DRB5，外显子2的序列，或内含子序列或来自这些基因的外显子和内含子序列的组合。在一些实施方案中，定量检测包括克隆测序。在一些实施方案中，所述方法包括在测序之前的靶富集步骤。在该实施方案的变化形式中，所述富集通过DNA扩增进行。在该实施方案的其它变化形式中，富集通过靶捕获进行。如果使用ddPCR，则确定步骤包括计算在同一基因座处一个或多个供体HLA等位基因的浓度与受体的一个或多个HLA等位基因的浓度的比率。

不将本发明限于单个技术或仪器但仅通过实例的方式，本方法的一个实施方案可以使用如下文描述的GS家族的测序仪器，包括GSGSGSFLX或GS(454LifeSciences，Branford，Conn.)进行。小滴数字PCR可以使用如下文实施例中描述的QuantaLife仪器(Bio-RadLabs.，Hercules，Cal.)进行。可获得的或将变为可获得的用于核酸的数字或克隆分析的其它仪器和系统也在本文中考虑。

在一个实施方案中，靶富集和测序步骤包括：(a)在第一扩增反应中，使用包含在5’-至3’-引发方向上：接头序列和HLA-杂交序列，列出的以下序列的扩增引物，扩增一种以上包含多态位点的HLA-A，HLA-B，HLA-C，DRB1，DRB3，DRB4，DRB5，DQA1，DQB1，DPA1，和DPB1基因中的外显子或内含子；(b)在第二扩增反应中，进行乳液PCR；(c)使用焦磷酸测序确定步骤(b)中获得的各个扩增子的序列；(d)通过将步骤(c)中确定的HLA扩增子的序列与已知HLA序列相比较来将HLA等位基因分配给受体或供体，从而确定哪种HLA等位基因存在于受体的血液或血浆中；(e)对于一种以上HLA等位基因，定量与步骤(c)中获得的各个等位基因对应的供体和受体的测序读取的数量；并且(f)使用步骤(e)中获得的量，通过计算供体读取与受体读取或与读取的总数减去背景或与读取的总数的比率，确定受体的血液或血浆中存在的供体DNA的分数。

在该实施方案的变化形式中，所述方法包括，在步骤(a)之后，从多个个体汇集扩增子并且基于来自多个个体的扩增子的汇集物(pool)进行随后的步骤(b)–(c)。在该变化形式中，所述扩增引物还包含个体鉴定标签，也称作多重鉴定(MID)标签。

在其它实施方案中，使用任意可获得的深度测序技术和仪器(即，能够数字序列读出的技术和仪器)进行步骤(b)-(e)或其等效形式。不受限制，仪器的实例包括GS家族的仪器(454LifeSciences，Branford，Conn.)；ION和PGM^TM(LifeTechnologies，GrandIsland，N.Y.)；和(Illumina，SanDiego，Cal.)或其任意改善或改进。

在一些实施方案中，检测移植物排斥反应的开始或进程包括定量供体核酸分数。确定所述分数包括将对应于至少一种供体等位基因的读取与在同一基因座处的所有读取的总和或与对应于获自样品的在同一基因座处的至少一种受体的等位基因的读取相比较。为了容易理解，如本文使用的术语“读取”包括测序读取和任何其它克隆方法(例如数字小滴PCR中的小滴)，其中受体的或供体的HLA等位基因被检测。在一些实施方案中，所述比较步骤包括计算2x对应于单个供体等位基因的读取与获自样品的在同一基因座处的全部读取的总和的比率。在其它实施方案中，所述比较步骤是计算对应于单个供体等位基因的读取与对应于获自样品的在同一基因座处的单个受体的等位基因的读取的比率。使用一种或两种供体等位基因和一种或两种受体等位基因或所有等位基因的类似比率对于遗传学领域的技术人员来说是将是直接显而易见的。例如，在一个实施方案中，(假设在同一基因座处杂合的供体和受体具有四个不同等位基因)如果对于受体等位基因中的一个来说，读取的数是R并且供体等位基因中的一个是D，则供体分数(DF)可以根据式1来确定：

DF＝D/(R+D)式1

在另一个实施方案中，对于每个等位基因可以将读取划分为正向测序读取和反向测序读取。那么，供体分数(DF)可以确定为根据式2确定的正向和反向分数的平均：

DF_R＝D_R/(R_R+D_R)DF_F＝D_F/(R_F+D_F)

DF＝(DF_R+DF_F)/2式2

遗传学领域的技术人员可以想出任意数量的使用在同一基因座处(在纯合个体的情况下单个等位基因)的一种或两种供体等位基因D(或D1，D2)和一种或两种受体等位基因R(或R1，R2)的类似公式，并且其在本发明的范围内。

在另一个实施方案中，可以分析多个HLA基因座。来自各个基因座的读取可以用于根据式1或式2或类似的式计算供体DNA的分数，并且可以将得到的各个基因座的供体分数值平均，获得供体分数的估计值。

在另一个实施方案中，本发明是使用HLAI型和II型基因座的高通量基因分型，评估重症联合免疫缺陷(SCID)儿童的血液中母体细胞的比率的方法。在该实施方案的变化形式中，所述方法包括使用大规模平行测序(使用例如，GS家族的测序仪器，包括GSGSGSFLX或GS(454LifeSciences，Branford，Conn.))和合适的软件(例如，Conexio)，用于将HLAI型和II型基因座高分辨率和高通量基因分型。在该实施方案的进一步变化形式中，分析SCID儿童的血液以通过将对应于非传播的母体等位基因的HLA-C等位基因序列读取进行计数来评价母体细胞的比率。

实施例

实施例1：通过下一代测序检测受体的血浆中的供体DNA

样品收集和DNA纯化

从肾移植物的人受体收集样品。如下制备DNA。将全血收集在血浆制备管(PPT)中并且在两个小时内处理。根据具有柠檬酸钠的BDPPT^TM血浆制备管或BDCPT^TM细胞制备管(BectonDickinson，Inc.，FranklinLakes，N.J.)的产品说明书进行血浆的分离并且随后冻存。

通过在8000g离心5分钟解冻后从血浆制备DNA。然后去除上清并且再在16000g旋转另外5分钟。从2mL的血浆中的DNA提取使用Roche高纯度病毒核酸大量试剂盒(RocheAppliedScience，Inc.，Indianapolis，Ind.)进行。用约34μl水洗脱DNA并且通过QuibitHSDNA试剂盒(MolecularProbes，Inc.，Eugene，Ore.)定量。

使用454GS 仪器从血浆深度测序无细胞DNA

在单个25μl反应中以1-10ng的DNA模板和正向和反向引物(表1)各10皮摩，10mMTris-HCl，pH8.3，50mMKCl，1.5mMMgCl，dA，dC，dG和dUTP各150μM，甘油10％w/v，和AmpliTaqDNA聚合酶进行PCR扩增。在ABIPCR系统9700(AppliedBiosystems，Inc.，FosterCity，Cal.)中，热循环条件是：95℃-10min；31个循环的95℃-15秒，60℃-45秒，72℃-15秒；72℃-5分钟。

用于与GS仪器一起使用的引物具有以下5’-3’-方向上的排列：接头–关键标签–MID-HLA-杂交序列。根据制造商的建议设计接头、关键标签和MID序列。

扩增子清除、定量、稀释和汇集如下进行。使用系统(AgencourtBioscienceCorp.，Beverly，Mass.)，按照在454LifeSciencesGSGTypeHLAMR和HR试剂盒(RocheAppliedScience，Indianapolis，Ind.)中描述的清除方案，从扩增子中去除短的非特异的和引物-二聚体人工假象产物。通过在96孔(LifeTechnologies，Carlsbad，Cal.)上电泳进一步评价纯化的扩增子的等分试样。如果观察到引物二聚体，则重复AMPure步骤并且通过再评价产物。然后将纯化的扩增子通过QUANT-IT^TM 测定(LifeTechnologies，Carlsbad，Cal.)在微孔板分光荧光计上定量。八个标准物跨越从0ng/μl至50ng/μl的DNA浓度。将任何不能通过检测的扩增子分配为0.1ng/μl的浓度(为了允许进行稀释度计算)并且通过接着的步骤进行。将扩增子稀释至1x10⁶个分子/μl。制备扩增子的汇集物，从而汇集指定用于在454PicoTiterPlate(PTP)的单个区域上测序的所有扩增子；产生汇集物，使得各个扩增子能够产生大约所需的读取深度(通常，40,000读取/扩增子)。

乳液PCR、珠子回收和焦磷酸测序如下进行。乳液PCR(emPCR)、含DNA的珠子的富集和仪器(454LifeSciences，Branford，Conn.)的焦磷酸测序在4-区域PTP上，按照GSFLXSeries手册：emPCR方法手册-LibAMV(Jan2010)；SequencingMethodManual(2010年5月)进行，有以下例外：1)在emPCR期间，以0.4-0.5拷贝/珠子使用扩增子汇集物，2)以0.5倍指定的浓度使用emPCR引物，3)通过使用MultiProbeHT液体处理器(PerkinElmer，Waltham，Mass.)上的REMe模块(RocheAppliedScience，Indianapolis，Ind.)将珠子富集自动化，和4)对于测序，将60％的建议载量的富集的DNA珠子分配在PTP板上。

使用454软件的共有(consensus)功能合并序列。使用安装在基于Microsoft的计算机上的ASSIGN454软件(v34)(ConexioGenomics，Ltd.，Perth，Australia)分析序列。所述软件将等位基因分配给各个序列读取并且计算对应于各个等位基因的序列读取的数量。结果显示在表2中。

使用 仪器从血浆深度测序无细胞DNA

用于与仪器一起使用的引物在5’-3’-方向上具有以下排列：MiSeq标签–454MID序列–HLA-杂交序列。(表1)。用于仪器(Illumina，Inc.，SanDiego，Cal.)测序的扩增子制备任选地包括PCR扩增之前的预扩增步骤。任选的预扩增如下处理：25μl反应物含有1-10ng的DNA模板和各10皮摩尔的正向和反向引物，10mMTris-HCl，pH8.3，50mMKCl，1.5mMMgCl，各150μM的dA，dC，dG和dUTP，甘油10％w/v，和AmpliTaqDNA聚合酶。热循环条件是：在ABIPCR系统9700中，95℃-10分钟；4个循环的95℃-15秒，60℃-45秒，72℃-15秒；72℃-5分钟。将来自各个得到的预扩增的样品的4μl等分试样作为DNA模板引入PCR扩增反应中。条件与本部分的开始所描述的相同。

按照制造商的建议进行扩增子清除和定量。在有限PCR循环步骤(95℃-30秒；10个循环，95℃-15秒，63℃-30秒，72℃-45秒；72℃-5分钟)之前，用10mMTris-HCl，pH8.3，0.1％Tween20缓冲液将各个扩增子标准化为0.3ng/μl的浓度，使用从5’至3’含有MiSeq接头，MiSeq标志和MiSeq标签的引物加入Miseq标记体和捕获序列。进行第二扩增子清除、定量和标准化(0.3ng/μl)，之后汇集和加载入仪器中。在得到的序列文件中，使用内部开发的生物信息学工具将读取的末端从序列上“消减(trimmed)”掉。来自ConexioGenomics的ASSIGN454软件(v34)用于序列分析。

表2具有急性移植物排斥反应的患者的血浆中检测供体等位基因

¹总序列读取是在同一基因座处所有供体和受体等位基因的总和

²因为仅检测两种等位基因中的一种，％供体是观察值的二倍

³第二供体等位基因不可测定，因为其与受体等位基因之一相同

⁴由于取样变化，第二供体等位基因未检测到

表3在具有慢性移植物排斥反应的患者的血浆中检测供体等位基因

¹总序列读取是在同一基因座处所有供体和受体等位基因的总和

²因为仅检测两种等位基因中的一种，％供体是观察值的二倍

⁴由于取样变化，第二供体等位基因未检测到

表4成功移植的患者的血浆中未检测供体等位基因

¹总序列读取是在同一基因座处所有供体和受体等位基因的总和

³第二供体等位基因不可测定，因为其与受体等位基因之一相同

在各个情况下，对于供体-受体对而言，DPB1基因座是提供信息的。结果表明，在经历急性或慢性移植物排斥反应的受体中的血浆中可检测到供体HLA序列。在成功的移植物受体的血浆中检测不到供体DNA。

实施例2：通过小滴数字PCR在模拟临床样品的细胞系混合中检测“供体”DNA

近似于临床样品的样品是从代表受体DNA与小(1％)量的供体DNA的混合物的两种细胞系分离的核酸的混合物。“受体”细胞系是EDBU并且“供体”细胞系是OLGA。混合物包括1％OLGA/99％EDBU。所述细胞系具有不同的DPB1基因型，其可以由下文描述的两种探针区别。在实验条件下，各个探针与靶细胞系上的两种等位基因特异杂交并且不与其它细胞系上的等位基因杂交。

ddPCR设置根据QX100^TM小滴生成器(BioRadLabs.，Hercules，Cal.)的制造商使用说明进行。使用SEQIDNOs：6和8(表1)扩增DPB1–测试样品中提供信息的HLA基因座。以一式两份反应运行各个样品。将9uL的样品与BioRad小滴PCRSupermix，250nM的各个探针，和900nM的各个引物，和4单位的尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)合并在最终20μLPCR体积中。在平行孔中，将最终反应混合物与70uL的小滴生成器油一起转移入小滴生成器芯片的单个孔中。小滴产生完成后，将40uL得到的油中悬浮的小滴转入96孔板中。随后使用以下热循环参数将小滴循环：50℃5-分钟(UNG步骤)，接着在95℃10-分钟热激活步骤，和94℃(30-秒)至57℃(1-分钟)的40个循环，以及98℃10-分钟保持。对于各个小滴，使用BioRadQX100^TM小滴读数器读取FAM和VIC两个通道的终点荧光。VIC探针检测两种“供体”等位基因，同时FAM探针检测两种“受体”等位基因。

通过将VIC阳性信号除以总信号(VIC阳性+FAM阳性)确定供体DNA的百分数。在受体的样品中检测到任意供体等位基因表示受体的血流中循环的供体DNA。表5中的数据显示在受体的DNA背景下该ddPCR测定检测供体等位基因的能力；以及确定来自移植物受体的临床血浆样品中供体DNA的分数。观察到的“供体”序列的分数是1.04％，与预期的1％的分数密切匹配。

表5：通过ddPCR检测“供体”等位基因

DPB1等位基因来源	浓度
		“受体”EDBU	34.4
“供体”OLGA	0.36

实施例3：通过检测母体HLA等位基因在SCID儿童血液中检测母体细胞

使用454扩增子测序和Conexio软件用于高分辨率和高通量对HLAI型和II型基因座基因分型的方法用于分析SCID儿童的血液，并且通过计数对应于非传播的母体等位基因的HLA-C等位基因序列读取来评估母体细胞的比率。这里，我们报道了允许我们定量血浆中HLA等位基因混合物的系统的开发。

使用靶向HLADPB1或DQB1外显子2的短区域(～150bp以扩增血浆中的小DNA片段)的引物扩增来自血浆或细胞的设计混合物的DNA。将扩增子进一步通过乳液PCR扩增并且在454GSFLX或GSJunior上测序。使用改进的ConexioAssignATF454软件检查序列。该软件允许快速数字分析各个DPB1或DQB1等位基因。我们还使用IlluminaMiSeq分析混合物。

使用改进的Conexio软件，容易鉴定混合物中的少数HLA等位基因并从背景“噪声”，即由PCR或测序误差产生的序列中分离。在两种杂合细胞系的混合物中，以1ng(～140二倍体基因组)DNA投入可以以0.5％检测到少数HLA等位基因。在来自经历急性或慢性排斥反应的肾移植物受体的3/3血浆样品中，平均以供体加上受体等位基因的总数的0.6％检测到供体HLA等位基因。

尽管本发明已经参考具体实施例详述，但是对于本领域技术人员将显而易见的是，在本发明的范围内可以进行各种改进。因此本发明的范围应该不受本文所述的实施例限制，而是受以下提供的权利要求限制。

Claims (18)

1.一种通过确定受体的血液样品中供体核酸的分数来确定实体器官移植物排斥反应或损伤的方法，所述方法包括：

(a)提供来自所述受体的血液样品；

(b)对所述样品探测在至少一个基因座处至少一个供体HLA等位基因的存在；

(c)如果检测到所述供体HLA等位基因，则诊断移植物排斥反应或损伤。

2.权利要求1所述的方法，所述方法还包括确定所述供体HLA等位基因的分数并且如果所述分数超过预定的阈值，则诊断移植物排斥反应或损伤。

3.权利要求2所述的方法，其中所述确定步骤包括计算所述样品中检测到的同一基因座处所述至少一个供体HLA等位基因的量与所有HLA等位基因的量的总和的比率。

4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述至少一个供体和受体HLA等位基因包含选自DQA1，外显子2；DQB1，外显子2和3；DPA1，外显子2；DBP1，外显子2；DRB1，外显子2；DRB3，外显子2；DRB4，外显子2；和DRB5，外显子2的序列或来自所述HLA基因的内含子序列或来自所述基因的外显子和内含子序列的组合。

5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中对HLA等位基因进行探测包括测序，并且其中所述方法还包括在测序之前的靶富集步骤。

6.权利要求5所述的方法，其中测序包括以正向引物和反向引物进行的克隆扩增步骤，各个引物包含接头序列和HLA-杂交序列。

7.权利要求1至6中任一项所述的方法，其中对于HLA等位基因的探测包含以下步骤：

(a)利用正向引物和反向引物扩增，获得HLA扩增子；

(b)进行克隆测序以确定步骤(a)中获得的HLA扩增子的序列；

(c)在步骤(b)中确定的序列中，在同一基因座处鉴定至少一个受体HLA等位基因和至少一个供体HLA等位基因；

(d)比较步骤(c)中鉴定的受体和供体HLA序列的数量，从而确定所述样品中供体核酸的分数。

8.权利要求7所述的方法，其中步骤(a)或(b)中的至少一种引物选自表1。

9.权利要求7或8中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的鉴定包括以下计算步骤：

(a)将HLA基因座处的序列与HLA序列数据库比较；

(b)将所述序列分选到多个对应于已知HLA等位基因的箱中；

(c)鉴定一种或两种多数序列作为受体等位基因；

(d)鉴定一种或两种最具代表性的少数序列作为供体等位基因。

10.权利要求7至9中任一项所述的方法，其中步骤(a)中在两个、三个或更多个基因座处检测在同一基因座处的所述供体HLA等位基因和所述受体HLA等位基因。

11.权利要求10所述的方法，其中在两个、三个或更多个基因座处，所述供体和受体HLA等位基因在相同反应体积中通过多重PCR同时扩增。

12.权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述HLA等位基因通过这样的方法定量检测，所述方法包括：

(a)将所述样品分成多个反应体积，各自包含零至约五个拷贝的靶HLA等位基因；

(b)对各个反应体积测定所述靶HLA等位基因的存在；

(c)比较同一基因座处含有供体HLA等位基因的反应体积的数量与含有受体HLA等位基因的反应体积的数量，从而确定所述样品中供体核酸的分数。

13.权利要求1至12中任一项所述的方法，所述方法还包括独立地获得供体和受体在至少一个HLA基因座处的基因型信息。

14.通过确定受体的血液中供体DNA的浓度是否超过阈值水平来确定移植物受体是否具有移植物排斥反应或可能发展出移植物排斥反应的方法，其中供体DNA的浓度通过这样的方法确定，所述方法包括：

(a)提供一个体积的来自所述受体的血液样品；

(b)在所述体积的样品中定量检测至少一个供体HLA等位基因；

(c)确定供体DNA的浓度；和

(d)将所述供体DNA的浓度与阈值比较，其中如果达到或超过阈值，则所述受体具有移植物排斥反应或可能发展出移植物排斥反应。

15.权利要求14所述的方法，其中所述至少一个供体HLA等位基因选自DQA1，外显子2；DQB1，外显子2和3；DPA1，外显子2；DBP1，外显子2；DRB1，外显子2；DRB3，外显子2；DRB4，外显子2；和DRB5，外显子2或来自所述基因的外显子和内含子序列的组合。

16.权利要求14或15中任一项所述的方法，其中在步骤(a)中，在两个、三个或更多个基因座处检测在同一基因座处的供体HLA等位基因和受体HLA等位基因。

17.一种监视移植物受体的移植物排斥反应发展的方法，所述方法如下进行：定期确定所述受体的血液中供体HLA等位基因的分数，并且如果检测到供体DNA的分数增加，则将患者诊断为具有移植物排斥反应或可能发展出移植物排斥反应。

18.一种定量检测SCID儿童的血液中母体细胞的方法，所述方法包括：

(a)提供来自所述儿童的血液样品；

(b)对所述样品探测在至少一个基因座处至少一种非传播的母体HLA等位基因的存在；

(c)将步骤(b)中检测到的母体等位基因定量，从而定量检测母体细胞。