CN105189787A - 使用hla标志物测定母体血液中的胎儿dna的分数的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明包括使用HLA基因座测定母体血液或血浆中胎儿DNA的分数的方法，其中所述母本和胎儿HLA等位基因通过克隆或数字方法来检测和定量。

Description

使用HLA标志物测定母体血液中的胎儿DNA的分数的方法
1997年在母体血液中发现无细胞胎儿DNA已经开启了非侵袭性产前诊断和筛选的新领域。循环胎儿DNA的用途包括Rh组基因分型以及筛选非整倍性和单基因疾病，综述于Jiang, P., 等人(2012) FetalQuant: deducing fractional fetal DNA concentration from massively parallel sequencing of DNA in maternal plasma, Bioinformatics 28:2883。此类诊断应用需要母体循环中存在的总DNA内的胎儿DNA的分数(也被称为“胎儿分数”)的知识。对于一些应用，这将是仅仅质量控制问题。例如，由CLIA实验室提供的一些目前的商业非侵袭性产前诊断(NIPD)测试表明，如果母体血浆中的DNA的<4%是胎儿的，则测试结果将是无法得出结论的，所以不运行测试。对于其他应用，诸如非整倍性和隐性等位基因的拷贝数的检测，胎儿分数的精确测定是必需的。
目前定量母体血浆中的胎儿DNA的方法涉及检测Y染色体基因座(例如，SRY或DYS14，美国专利号6,258,540)；检测胎儿表观遗传标志物(例如，基因乳腺丝抑蛋白、RASSF1A和SERPINB2的甲基化模式，综述于Hahn, S., 等人, (2011) Cell-free nucleic acids as potential markers for preeclampsia, Placenta, 32:s17)；或希望发现可以区分母本DNA与胎儿DNA的有信息的单核苷酸多态性(SNP)，而靶向大量的染色体基因座(美国申请系列号12/644,388)。基于Y-染色体的方法的明显缺点是其不适用于女性胎儿。由于缺乏可重复性，表观遗传方法是不佳的。使用多个SNP的方法(例如，Jiang，等人，同上)在整个基因组寻找有信息的SNP中需要复杂数学分析。测定胎儿分数的更可预测且精确的方式是期望的。
发明概述
本发明是测定样品中胎儿核酸的分数的方法，其包括：定量检测所述样品中的至少一种非母本HLA等位基因；定量检测所述样品中在相同基因座的至少一种母本HLA等位基因；使用上述检测的量，测定所述样品中胎儿核酸的分数。在一些实施方案中，所述测定步骤包括计算步骤中测定的所述非母本HLA等位基因的量与所有HLA等位基因的量的总和的比率的2倍。在一些实施方案中，所述至少一种非母本和母本HLA等位基因选自HLA-A、HLA-B、HLA-C、DRB1、DRB3、DRB4、DRB5、DQA1、DQB1、DPA1和DPB1等位基因、或HLA-A，外显子2 和3；HLA-B，外显子2 和3；HLA-C，外显子2 和3；DQA1，外显子2；DQB1，外显子2 和3；DPA1，外显子2；DPB1，外显子2；DRB1，外显子2；DRB3，外显子2；DRB4，外显子2；和DRB5，外显子2或来自所述HLA基因的内含子序列或来自所述基因的外显子和内含子序列的组合。在一些实施方案中，所述HLA等位基因通过包括以下的方法定量检测：测序，具体而言克隆测序和任选包括克隆扩增的步骤。在一些实施方案中，所述克隆扩增步骤用正向引物和反向引物进行，各引物包含衔接序列和HLA-杂交序列。在一些实施方案中，所述方法包括在测序之前的目标富集步骤，例如，通过至少一轮基因组DNA扩增或通过目标捕获。在一些实施方案中，所述HLA等位基因通过包括以下的方法定量检测：用正向引物和反向引物扩增，以获得HLA扩增子； 进行克隆测序以测定HLA扩增子的序列； 鉴定在相同基因座的至少一种母本HLA等位基因和至少一种非母本HLA等位基因； 比较母本和非母本HLA序列克隆的数目，从而测定所述样品中胎儿核酸的分数。在一些实施方案中，所述鉴定步骤包括以下计算步骤：将在所述HLA基因座的序列与HLA序列数据库进行比较； 将所述序列分选至对应于已知HLA等位基因的多个箱(bins)； 将一个或两个多数序列鉴定为母本等位基因；将一个或两个最代表的少数序列鉴定为非母本等位基因。在一些实施方案中，所述比较步骤包括计算所述鉴定步骤中鉴定的在相同基因座的所述非母本HLA等位基因与HLA等位基因的总数的比率的两倍。在一些实施方案中，测定HLA扩增子的序列包括边合成边测序(sequencing by synthesis)。在一些实施方案中，在两个、三个或更多个基因座(例如，DPB1、DQB1和DRB1)检测在相同基因座的所述非母本HLA等位基因和所述母本HLA等位基因。在一些实施方案中，在相同反应体积中通过多重PCR同时扩增在两个、三个或更多个基因座的所述非母本和母本HLA等位基因。在一些实施方案中，所述HLA等位基因通过包括数字PCR的方法定量检测。在一些实施方案中，所述HLA等位基因通过包括以下的方法定量检测：将所述样品分成多个反应体积，各自包含零至近似五个拷贝的目标HLA等位基因；测定各反应体积中目标HLA等位基因的存在；将含有所述非母本HLA等位基因的反应体积的数目与含有在相同基因座的母本HLA等位基因的反应体积的数目进行比较，从而测定所述样品中胎儿核酸的分数。在本实施方案的变型中，所述测定包括通过数字PCR扩增。在一些实施方案中，所述方法进一步包括独立获得在至少一个HLA基因座的父母一方或双方的基因型信息。
在又另一个实施方案中，本发明是检测胎儿中的染色体异常的方法，其包括：提供来自怀有所述胎儿的母亲的血液样品；通过包括以下的方法测定所述样品中的胎儿核酸的分数：定量检测所述样品中的至少一种非母本HLA等位基因，定量检测所述样品中在相同基因座的至少一种母本HLA等位基因，比较所述母本和非母本HLA等位基因的量，从而测定所述样品中胎儿核酸的浓度；定量检测所述样品中的来自怀疑异常的至少一个染色体的基因座；确定先前步骤中检测的染色体基因座是否以相对于第二步骤中测定的胎儿DNA的浓度的异常量存在，从而检测染色体异常。在该实施方案的变型中，所述至少一种非母本HLA等位基因选自HLA-A、HLA-B、HLA-C、DRB1、DRB3、DRB4、DRB5、DQA1、DQB1、DPA1和DPB1等位基因，包括HLA-A，外显子2和3；HLA-B，外显子2和3；HLA-C，外显子2和3；DQA1，外显子2；DQB1，外显子2和3；DPA1，外显子2；DPB1，外显子2；DRB1，外显子2；DRB3，外显子2；DRB4，外显子2；和DRB5，外显子2或来自所述基因的外显子和内含子序列的组合。在该实施方案的变型中，在两个、三个或更多个基因座(例如，来自基因DPB1、DQB1和DRB1)检测在相同基因座的所述非母本HLA等位基因和所述母本HLA等位基因。在一些实施方案中，所述HLA等位基因通过包括以下的方法定量检测：测序，具体而言克隆测序和任选包括克隆扩增的步骤。在一些实施方案中，所述克隆扩增步骤用正向引物和反向引物进行，各引物包含衔接序列和HLA-杂交序列。在一些实施方案中，所述方法包括在测序之前的目标富集步骤，例如，通过至少一轮基因组DNA扩增或通过目标捕获。在一些实施方案中，所述HLA等位基因通过包括以下的方法定量检测：用正向引物和反向引物扩增，以获得HLA扩增子；进行克隆测序以测定HLA扩增子的序列；鉴定在相同基因座的至少一种母本HLA等位基因和至少一种非母本HLA等位基因；比较母本和非母本HLA序列克隆的数目，从而测定所述样品中胎儿核酸的分数。在一些实施方案中，所述鉴定步骤包括以下计算步骤：将在所述HLA基因座的序列与HLA序列数据库进行比较；将所述序列分选至对应于已知HLA等位基因的多个箱(bins)；将一个或两个多数序列鉴定为母本等位基因；将一个或两个最代表的少数序列鉴定为非母本等位基因。在一些实施方案中，所述比较步骤包括计算所述鉴定步骤中鉴定的在相同基因座的所述非母本HLA等位基因与HLA等位基因的总数的比率的两倍。在一些实施方案中，测定HLA扩增子的序列包括边合成边测序。在一些实施方案中，在两个、三个或更多个基因座(例如，DPB1、DQB1和DRB1)检测在相同基因座的所述非母本HLA等位基因和所述母本HLA等位基因。在一些实施方案中，在相同反应体积中通过多重PCR同时扩增在两个、三个或更多个基因座的所述非母本和母本HLA等位基因。在一些实施方案中，所述HLA等位基因通过包括数字PCR的方法定量检测。在一些实施方案中，所述HLA等位基因通过包括以下的方法定量检测：将所述样品分成多个反应体积，各自包含零至近似五个拷贝的目标HLA等位基因；测定各反应体积中目标HLA等位基因的存在；将含有所述非母本HLA等位基因的反应体积的数目与含有在相同基因座的母本HLA等位基因的反应体积的数目进行比较，从而测定所述样品中胎儿核酸的分数。在本实施方案的变型中，所述测定包括通过数字PCR扩增。在一些实施方案中，所述方法进一步包括独立获得在至少一个HLA基因座的父母一方或双方的基因型信息。
在又另一个实施方案中，本发明是通过确定患者血液中的胎儿分数是否超过阈值水平而确定怀孕患者是否具有或可能发展先兆子痫的方法，其中通过包括以下的方法来测定所述胎儿分数：提供来自患者的血液样品；定量检测所述样品中的至少一种非母本HLA等位基因；定量检测所述样品中在相同基因座的至少一种母本HLA等位基因；比较所述母本和非母本HLA等位基因的量，从而测定所述样品中的胎儿分数。在该实施方案的变型中，所述至少一种非母本HLA等位基因选自HLA-A、HLA-B、HLA-C、DRB1、DRB3、DRB4、DRB5、DQA1、DQB1、DPA1和DPB1等位基因，例如，HLA-A，外显子2和3；HLA-B，外显子2和3；HLA-C，外显子2和3；DQA1，外显子2；DQB1，外显子2和3；DPA1，外显子2；DPB1，外显子2；DRB1，外显子2；DRB3，外显子2；DRB4，外显子2；和DRB5，外显子2或来自所述基因的外显子和内含子序列的组合。在一些实施方案中，所述HLA等位基因通过包括以下的方法定量检测：测序，具体而言克隆测序和任选包括克隆扩增的步骤。在一些实施方案中，所述克隆扩增步骤用正向引物和反向引物进行，各引物包含衔接序列和HLA-杂交序列。在一些实施方案中，所述方法包括在测序之前的目标富集步骤，例如，通过至少一轮基因组DNA扩增或通过目标捕获。在一些实施方案中，所述HLA等位基因通过包括以下的方法定量检测：用正向引物和反向引物扩增，以获得HLA扩增子；进行克隆测序以测定HLA扩增子的序列；鉴定在相同基因座的至少一种母本HLA等位基因和至少一种非母本HLA等位基因；比较母本和非母本HLA序列克隆的数目，从而测定所述样品中胎儿核酸的分数。在一些实施方案中，所述鉴定步骤包括以下计算步骤：将在所述HLA基因座的序列与HLA序列数据库进行比较；将所述序列分选至对应于已知HLA等位基因的多个箱(bins)；将一个或两个多数序列鉴定为母本等位基因；将一个或两个最代表的少数序列鉴定为非母本等位基因。在一些实施方案中，所述比较步骤包括计算所述鉴定步骤中鉴定的在相同基因座的所述非母本HLA等位基因与HLA等位基因的总数的比率的两倍。在一些实施方案中，测定HLA扩增子的序列包括边合成边测序。在一些实施方案中，在两个、三个或更多个基因座(例如，DPB1、DQB1和DRB1)检测在相同基因座的所述非母本HLA等位基因和所述母本HLA等位基因。在一些实施方案中，在相同反应体积中通过多重PCR同时扩增在两个、三个或更多个基因座的所述非母本和母本HLA等位基因。在一些实施方案中，所述HLA等位基因通过包括数字PCR的方法定量检测。在一些实施方案中，所述HLA等位基因通过包括以下的方法定量检测：将所述样品分成多个反应体积，各自包含零至近似五个拷贝的目标HLA等位基因；测定各反应体积中目标HLA等位基因的存在；将含有所述非母本HLA等位基因的反应体积的数目与含有在相同基因座的母本HLA等位基因的反应体积的数目进行比较，从而测定所述样品中胎儿核酸的分数。在本实施方案的变型中，所述测定包括通过数字PCR扩增。在一些实施方案中，所述方法进一步包括独立获得在至少一个HLA基因座的父母一方或双方的基因型信息。
在本实施方案的又另一个变型中，本发明是通过经由上文所述的方法定期测定患者血液中的胎儿分数而监测怀孕患者的先兆子痫的发展的方法，且如果检测到胎儿分数的增加则将患者诊断为具有或可能发展先兆子痫。在该实施方案的变型中，所述至少一种非母本HLA等位基因选自HLA-A、HLA-B、HLA-C、DRB1、DRB3、DRB4、DRB5、DQA1、DQB1、DPA1和DPB1等位基因，例如，HLA-A，外显子2和3；HLA-B，外显子2和3；HLA-C，外显子2和3；DQA1，外显子2；DQB1，外显子2和3；DPA1，外显子2；DPB1，外显子2；DRB1，外显子2；DRB3，外显子2；DRB4，外显子2；和DRB5，外显子2或来自所述基因的外显子和内含子序列的组合。在该实施方案的进一步变型中，在两个、三个或更多个基因座(例如，DPB1、DQB1和DRB1)检测在相同基因座的所述非母本HLA等位基因和所述母本HLA等位基因。
在又另一个实施方案中，本发明是通过确定母体血液中的胎儿核酸的浓度是否超过阈值水平而确定怀孕患者是否具有或可能发展先兆子痫的方法，其中胎儿核酸的浓度通过包括以下的方法来测定：提供来自所述患者的体积血液样品；定量检测所述样品的体积中的至少一种非母本HLA等位基因，从而测定胎儿核酸的浓度。在该实施方案的变型中，所述至少一种非母本HLA等位基因选自HLA-A、HLA-B、HLA-C、DRB1、DRB3、DRB4、DRB5、DQA1、DQB1、DPA1和DPB1等位基因，例如，HLA-A，外显子2和3；HLA-B，外显子2和3；HLA-C，外显子2和3；DQA1，外显子2；DQB1，外显子2和3；DPA1，外显子2；DPB1，外显子2；DRB1，外显子2；DRB3，外显子2；DRB4，外显子2；和DRB5，外显子2或来自所述基因的外显子和内含子序列的组合。在一些实施方案中，所述HLA等位基因通过包括以下的方法定量检测：测序，具体而言克隆测序和任选包括克隆扩增的步骤。在一些实施方案中，所述克隆扩增步骤用正向引物和反向引物进行，各引物包含衔接序列和HLA-杂交序列。在一些实施方案中，所述方法包括在测序之前的目标富集步骤，例如，通过至少一轮基因组DNA扩增或通过目标捕获。在一些实施方案中，所述HLA等位基因通过包括以下的方法定量检测：用正向引物和反向引物扩增，以获得HLA扩增子；进行克隆测序以测定HLA扩增子的序列；鉴定在相同基因座的至少一种母本HLA等位基因和至少一种非母本HLA等位基因；比较母本和非母本HLA序列克隆的数目，从而测定所述样品中胎儿核酸的分数。在一些实施方案中，所述鉴定步骤包括以下计算步骤：将在所述HLA基因座的序列与HLA序列数据库进行比较；将所述序列分选至对应于已知HLA等位基因的多个箱(bins)；将一个或两个多数序列鉴定为母本等位基因；将一个或两个最代表的少数序列鉴定为非母本等位基因。在一些实施方案中，所述比较步骤包括计算所述鉴定步骤中鉴定的在相同基因座的所述非母本HLA等位基因与HLA等位基因的总数的比率的两倍。在一些实施方案中，测定HLA扩增子的序列包括边合成边测序。在一些实施方案中，在两个、三个或更多个基因座(例如，DPB1、DQB1和DRB1)检测在相同基因座的所述非母本HLA等位基因和所述母本HLA等位基因。在一些实施方案中，在相同反应体积中通过多重PCR同时扩增在两个、三个或更多个基因座的所述非母本和母本HLA等位基因。在一些实施方案中，所述HLA等位基因通过包括数字PCR的方法定量检测。在一些实施方案中，所述HLA等位基因通过包括以下的方法定量检测：将所述样品分成多个反应体积，各自包含零至近似五个拷贝的目标HLA等位基因；测定各反应体积中目标HLA等位基因的存在；将含有所述非母本HLA等位基因的反应体积的数目与含有在相同基因座的母本HLA等位基因的反应体积的数目进行比较，从而测定所述样品中胎儿核酸的分数。在本实施方案的变型中，所述测定包括通过数字PCR扩增。在一些实施方案中，所述方法进一步包括独立获得在至少一个HLA基因座的父母一方或双方的基因型信息。
在又另一个实施方案中，本发明是检测胎儿中等位基因的存在或纯合状态的方法，其中所述等位基因与疾病状态相关，所述方法包括：提供来自怀有所述胎儿的母亲的血液样品；通过包括以下方法测定所述样品中非母本HLA等位基因的分数：定量检测所述样品中的至少一种非母本HLA等位基因；定量检测所述样品中在相同基因座的至少一种母本HLA等位基因；比较所述母本和非母本HLA等位基因的量，从而测定所述样品中非母本HLA等位基因的分数；定量检测所述样品中的与疾病状态相关的等位基因；将与疾病状态相关的等位基因的量与非母本HLA等位基因的分数进行比较，从而确定所述与疾病状态相关的等位基因在所述胎儿中是否以单一拷贝、两个拷贝存在或不存在。在该实施方案的变型中，所述至少一种非母本HLA等位基因选自HLA-A、HLA-B、HLA-C、DRB1、DRB3、DRB4、DRB5、DQA1、DQB1、DPA1和DPB1等位基因，例如，HLA-A，外显子2和3；HLA-B，外显子2和3；HLA-C，外显子2和3；DQA1，外显子2；DQB1，外显子2和3；DPA1，外显子2；DPB1，外显子2；DRB1，外显子2；DRB3，外显子2；DRB4，外显子2；和DRB5，外显子2或来自所述基因的外显子和内含子序列的组合。在一些实施方案中，所述HLA等位基因通过包括以下的方法定量检测：测序，具体而言克隆测序和任选包括克隆扩增的步骤。在一些实施方案中，所述克隆扩增步骤用正向引物和反向引物进行，各引物包含衔接序列和HLA-杂交序列。在一些实施方案中，所述方法包括在测序之前的目标富集步骤，例如，通过至少一轮基因组DNA扩增或通过目标捕获。在一些实施方案中，所述HLA等位基因通过包括以下的方法定量检测：用正向引物和反向引物扩增，以获得HLA扩增子；进行克隆测序以测定HLA扩增子的序列；鉴定在相同基因座的至少一种母本HLA等位基因和至少一种非母本HLA等位基因；比较母本和非母本HLA序列克隆的数目，从而测定所述样品中胎儿核酸的分数。在一些实施方案中，所述鉴定步骤包括以下计算步骤：将在所述HLA基因座的序列与HLA序列数据库进行比较；将所述序列分选至对应于已知HLA等位基因的多个箱(bins)；将一个或两个多数序列鉴定为母本等位基因；将一个或两个最代表的少数序列鉴定为非母本等位基因。在一些实施方案中，所述比较步骤包括计算所述鉴定步骤中鉴定的在相同基因座的所述非母本HLA等位基因与HLA等位基因的总数的比率的两倍。在一些实施方案中，测定HLA扩增子的序列包括边合成边测序。在一些实施方案中，在两个、三个或更多个基因座(例如，DPB1、DQB1和DRB1)检测在相同基因座的所述非母本HLA等位基因和所述母本HLA等位基因。在一些实施方案中，在相同反应体积中通过多重PCR同时扩增在两个、三个或更多个基因座的所述非母本和母本HLA等位基因。在一些实施方案中，所述HLA等位基因通过包括数字PCR的方法定量检测。在一些实施方案中，所述HLA等位基因通过包括以下的方法定量检测：将所述样品分成多个反应体积，各自包含零至近似五个拷贝的目标HLA等位基因；测定各反应体积中目标HLA等位基因的存在；将含有所述非母本HLA等位基因的反应体积的数目与含有在相同基因座的母本HLA等位基因的反应体积的数目进行比较，从而测定所述样品中胎儿核酸的分数。在本实施方案的变型中，所述测定包括通过数字PCR扩增。在一些实施方案中，所述方法进一步包括独立获得在至少一个HLA基因座的父母一方或双方的基因型信息。
附图简述
图1显示如实施例6所述的HLA基因座的ddPCR分析的结果。
发明详述
定义
术语“等位基因”是指基因的序列变体。一个或多个遗传差异可以构成等位基因。对于HLA等位基因，通常，多个遗传差异构成等位基因(即，大部分等位基因彼此相差多于一个碱基)。如本文所使用，母本等位基因是母亲中存在的两个等位基因之一。非母本等位基因是胎儿中存在、但母亲中不存在的等位基因。非母本等位基因可以是胎儿中存在的父本等位基因。非母本等位基因也可以是由减数分裂过程中的同源重组或基因转变或任一父母中的种系突变导致的新等位基因，且向下传递至胎儿。非母本等位基因也可以源自供体，例如卵子捐赠者，将遗传物质贡献给胎儿。
“克隆分析”的背景下的术语“克隆”是指分别分析所有均源自单一分子的分子的聚集物或群体。例如，“克隆测序”是指单独测序源自相同分子(目标扩增子)的各扩增子。
术语“深度测序”是指这样的测序方法，其中在单一测试中多次读取目标序列。单一深度测序运行由对相同目标序列的多次测序反应运行且各自生成独立的序列读取值构成。
“数字分析”或“数字稀释”的背景下的术语“数字”是指分析样品中存在的许多单个分子的每一个。数字稀释是指将样品分配至多个反应体积，其中平均一个或更少分子存在于各反应体积。在一些情况下，数字稀释使得能够数字读出，例如从各单个分子获得是/否结果和将通过计数克隆序列的数目从分子群体获得的数字结果列表。
术语“数字小滴PCR”或“ddPCR”是指由样品的数字稀释导致的多个反应体积(“小滴”)中进行的PCR。
术语“胎儿分数”是指总核酸间的胎儿核酸的比例。例如，胎儿分数可以代表存在于(或分离自)母体血浆的总DNA中的胎儿DNA的比例。应当理解，对于杂合胎儿，胎儿等位基因之一的分数将代表胎儿分数的一半。
术语“母体(母本)”和“母亲”是指怀有胎儿的妇女。本发明的方法适用于胎儿的遗传母亲以及怀有在遗传上与其无关的胎儿(例如，源自供体卵的胎儿)或以其他方式怀有供体的遗传物质的妇女。
术语“多态性”是指其中群体中可以发现基因组序列或编码的氨基酸序列的两种或更多种变体的状况。“单核苷酸多态性”(SNP)是其中序列中的变异由基因组序列中的单一多态核苷酸位置组成的多态性。
术语“基因型”是指个体或源自个体的样品中含有的一个或多个基因的一个或多个等位基因的组合。
术语“单倍型”是指个体的相同染色体上存在的一个或多个基因的一个或多个等位基因的组合。
术语“测定HLA基因的基因型”是指测定主体中的HLA等位基因的所选组合。例如，在本发明中，“测定HLA-A基因的基因型”是指鉴定外显子(例如，HLA-A基因的外显子2、3和4)中的一个或多个中存在的多态残基(等位基因决定子)中的至少一个。以类似的方式，可以测定基因HLA-B、HLA-C、DRB1、DRB3、DRB4、DRB5、DPB1、DPA1、DQA1 和DQB1的基因型。
术语“目标区域”是指待分析的核酸序列的区域。
术语“核酸”是指天然和非天然的核苷酸(例如，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合物。该术语不受聚合物的长度(例如，单体的数目)限制。核酸可以是单链或双链的，且将通常含有5’-3’磷酸二酯键，尽管在一些情况下，核苷酸类似物可以具有其他连接。核酸可以包括天然存在的碱基(腺苷、鸟嘌呤(guanidine)、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶)以及非天然碱基。术语“非天然核苷酸”或“修饰的核苷酸”是指含有修饰的含氮碱基、糖或磷酸酯基，或在其结构中并入非天然部分的核苷酸。非天然核苷酸的实例包括双脱氧核苷酸，生物素化、胺化、脱氨基化、烷基化、苄基化和荧光团标记的核苷酸。
术语“引物”是指这样的短核酸(寡核苷酸)，其充当在通常包括适当缓冲液、存在核酸前体和一种或多种任选的辅因子和合适温度的合适条件下由核酸聚合酶的DNA合成的起始点。引物通常包括与目标序列至少基本上互补的至少一个目标杂交的区域。该区域通常长度为约15至约40个核苷酸。
引物的术语“衔接子区域”或“衔接子”是指通常位于目标杂交区域的5'的引物的区域。通常，所述衔接子在随后的分析步骤中发挥功能。例如，所述衔接子可以与用于扩增(例如，乳液PCR)的缀合至微粒或其他固体表面的寡核苷酸杂交。所述衔接子还可以充当用于随后步骤中使用的引物(例如，测序引物)的结合位点。所述衔接子区域通常长度为15至30个核苷酸。
术语“个别标识标签”、“标识标签”、“多重标识标签”或“MID”在本文中可互换用来指充当获得自特定样品的DNA的标志物的引物的区域。
术语“扩增条件”是指核酸扩增反应(例如，PCR扩增)中允许引物的杂交和模板依赖性延伸的条件。术语“扩增子”是指含有目标核酸序列的所有或片段且作为通过任何合适的扩增方法的体外扩增的产物形成的核酸分子。各种PCR条件描述于PCR Strategies (M. A. Innis, D. H. Gelfand,和J. J. Sninsky编辑, 1995, Academic Press, San Diego, CA)的第14章；PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications (M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky,和T. J. White编辑, Academic Press, NY, 1990)。
术语“样品”是指含有或推测含有来自个体的核酸的任何组合物。在本发明的背景下，其中测定胎儿分数的样品是母体血液和由其衍生的部分，例如血浆。然而，对于本发明的某些方面，例如用于测定亲本基因型，可以使用任何其他类型的身体样品，包括但不限于皮肤、血浆、血清、全血和血液组分、唾液、尿液、泪液、精液、阴道分泌液和其他流体和组织，包括石蜡包埋组织。样品还可以包括获得自个体的细胞的体外培养物的成分和组分。
与核酸测序相关的术语“有效读取值”是指成功分配(有或没有误差校正)至特定基因组序列的序列读取值。关于HLA等位基因，有效读取值是成功分配(有或没有误差校正)至预计存在于样品中的HLA等位基因之一的序列读取值。无法被分配至预计存在于样品中的任何等位基因或IMGT HLA序列数据库中的任何序列的读取值是无效读取值。
本发明提供了使用人白细胞抗原(HLA)基因座的独特特性估计胎儿分数的方法。HLA区域的基因(HLA基因)在人基因组中是最多态性的。HLA区域跨越染色体6的短臂上的近似350万个碱基对。主要区域是I类和II类区域。I类基因是HLA-A、HLA-B和HLA-C，且主要II类基因是HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR。在蛋白水平表达的多态性反映于HLA抗原的氨基酸序列中，且因此对于组织分型用于移植具有很大兴趣。这些多态性，对于II类基因主要位于外显子2中，且对于I类基因主要位于外显子2和3中。然而，对于胎儿分数测定的目的，所有多态性，包括沉默变化(不导致氨基酸变化的核苷酸变化)，以及HLA基因的内含子和其他非编码区中的变化是有用的。
选择HLA基因座作为待检测的目标非母本序列远优于现有目标。因此，本发明是对于测定胎儿分数的现有方法的重大改进。例如，检测Y-染色体序列的方法排除女性胎儿。相反，HLA基因位于常染色体(染色体6)，因此可以在两种性别中检测。此外，由于父亲和母亲两者，不像Y染色体标志物，具有HLA基因，所以计数器中的序列读数来自与胎儿分数计算中的分母相同的扩增子。广泛使用的基于SNP的方法(例如，美国申请系列号12/644,388)目的在于检测母本和胎儿序列之间的单核苷酸差异(SNP)。然而，大多数扩增和测序技术是易错的，使得许多人感觉单核苷酸变化是人为且不正确的SNP。相反，HLA等位基因彼此差异多个核苷酸。因此，包括检测HLA基因座内的等位基因的方法与非HLA基因座相比不那么易错。使用例如克隆测序的目前可用的HLA基因分型方法，使得能够将多个连锁的多态性的阶段设置于外显子内，且使得可能明确测定每个HLA等位基因的序列。该特点在从母本DNA区分胎儿DNA和准确定量胎儿分数中添加了额外的准确度。
本发明是定量母体血液或血浆中存在的无细胞DNA间的变体(非母本)HLA序列的分数或量的方法。所述方法进一步包括通过测定非母本HLA序列与母本HLA序列或HLA序列的总量相比的比例而获得胎儿DNA的比例(胎儿分数)的估计值。在一个实施方案中，所述方法进一步包括使用估计的胎儿分数作为用于测定胎儿非整倍性的参考。在其他实施方案中，估计的胎儿分数用作用于排斥(即，从诊断程序排除)具有不足量的胎儿DNA的样品的阈值。在又另一个实施方案中，所述方法包括使用估计的胎儿分数或胎儿DNA的量或浓度来诊断先兆子痫的可能性。在本实施方案的变型中，所述方法进一步包括监测胎儿分数或胎儿DNA的量或浓度且如果已经检测到增加则将患者鉴定为具有或可能发展先兆子痫。在又另一个实施方案中，所述方法包括使用估计的胎儿分数以确定胎儿中等位基因的存在或纯合状态。在本实施方案的变型中，所述方法包括检测胎儿中的隐性等位基因的纯合状态(例如，与死亡率和发病率相关的状态)。在本实施方案的其他变型中，所述方法包括检测胎儿中的等位基因的单一拷贝(例如，关于隐性等位基因的携带者状态或关于常染色体显性或单倍体不足(haploinsufficient)的等位基因的与死亡率和发病率的相关的状态)。用HLA标志物测定的胎儿分数的准确和精确的估计值在解释对于突变体疾病相关的等位基因获得的结果是关键的。可以用本发明的方法使用任何多态性HLA基因或基因座。在一些实施方案中，所述HLA基因选自HLA-A、HLA-B、HLA-C、DRB1、DRB3、DRB4、DRB5、DQA1、DQB1、DPA1和DPB1。在一些实施方案中，靶向HLA基因的特异性外显子或外显子的部分，例如，HLA-A，外显子2 和3；HLA-B，外显子2 和3；HLA-C，外显子2 和3；DQA1:外显子2；DQB1:外显子2 和3；DPA1:外显子2；DPB1:外显子2；DRB1:外显子2、DRB3:外显子2；DRB4:外显子2；和DRB5:外显子2。在其他实施方案中，多态性HLA基因序列包含内含子序列或外显子和内含子序列的组合。
在一些实施方案中，以基因实验对象组(gene panel)的形式在相同反应中分析多个HLA基因或基因座。在一个实施方案中，所述实验对象组由基因序列形成，所述基因序列没有紧密连锁，且不处于连锁不平衡。当亲本HLA基因型未知时，该方法是特别有利的：使用几个不连锁的基因座确保至少一些基因座将是有信息的(即，关于胎儿中存在且在母亲中不存在的等位基因在母亲和胎儿之间的多态性)。例如，在本实施方案的变型中，同时分析来自基因DPB1和DQB1或DPB1和DRB1的序列。在另一个实施方案中，所述实验对象组由强连锁不平衡的紧密连锁的基因序列形成。该方法确保实验误差，诸如母本序列中的测序误差(其生成对应于不同于母本等位基因的已知HLA等位基因的序列)被认识到，且作为“噪声”而非“信号”被丢弃。例如，如果来自DQA1基因座的序列读数与母本等位基因相差一个碱基，则这些原则上可以，反映胎儿DNA中存在的未知的亲本等位基因，或者，相反，母本等位基因中的测序误差。如果这些DQA1非母本序列事实上源自胎儿DNA，则会基于已知的连锁不平衡模式预期，所述胎儿将具有特定DQB1或DRB1等位基因。如果非母本DQA1序列事实上是测序误差，则母本DQB1或DRB1序列中的独立测序误差会生成预期的DQB1或DRB1等位基因是极端不可能的。这允许区分胎儿等位基因(如果亲本等位基因是未知的)，且将其与导致对应于已知HLA等位基因的序列的母本等位基因中的测序误差进行区分。例如，在本实施方案的变型中，同时分析来自基因DQB1和DRB1的序列。在又另一个实施方案中，本发明包括检测包括彼此连锁不平衡的两个或更多个基因和不与剩余部分连锁不平衡的至少一个基因的HLA基因的组合。例如，在本实施方案的变型中，同时分析来自基因DPB1、DQB1和DRB1的序列。DPB1不与DQB1或不与DRB1强连锁不平衡，尽管DQB1和DRB1彼此连锁不平衡。
可以在平行反应中或通过一个、多重反应(例如，基因组PCR，其中几个扩增引物存在于相同的反应体积中)中组合分开的反应进行同时分析。在一些实施方案中，本发明的方法包括测序步骤，其使得能够定量检测样品中的母本和非母本HLA等位基因。在本实施方案中，所述方法需要“深度测序”，因为母本血浆或血液中的总DNA的仅一小部分(百分之几)预计源自胎儿。下一代测序(NGS)方法(也称为大规模平行测序(MPS)方法)平行克隆扩增数百万个单一DNA分子。然后个别测序每个克隆群体。有时，NGS(MPS)方法被称为克隆测序。技术的进步已经允许越来越长的序列读数，多达250个且更近多达700个核苷酸。然而，无细胞胎儿DNA以短片段存在，其中大部分为约160个碱基对长。(参见美国申请系列号12/940,992)对于此类短目标序列，确保现有测序技术的稳健性能。
本发明的方法的深度测序步骤需要目标富集步骤。在一些实施方案中，目标富集步骤包括扩增步骤。在其他实施方案中，使用其他目标富集方法，例如，描述于例如美国专利号7,867,703或8,383,338中的目标富集的基于文库或基于探针的方法。至少一轮扩增，例如，第一轮可以通过本领域已知的任何方法来进行。在一些实施方案中，进行多于一轮，例如，两轮扩增。在本实施方案的变型中，使用相同的引物进行随后几轮的扩增，例如，通过PCR的扩增。在本实施方案的其他变型中，所述引物的差异在于以3'-方向进一步延伸至HLA序列(嵌套引物)或在5'-末端具有额外的序列，例如，非HLA序列。
在一些实施方案中，富集的目标进行通过本领域已知的任何合适的方法的克隆扩增。在一些实施方案中，克隆扩增包括美国申请系列号12/245,666中详细描述的乳液PCR。简而言之，在乳液PCR过程中，使来自前轮扩增的扩增子和与寡核苷酸缀合的固相(例如，珠粒)接触，所述寡核苷酸能够与扩增子杂交，例如，经由与前轮扩增中使用的引物的衔接子区域杂交。作为结果，所述珠粒携带与珠粒上存在的衔接子区域杂交的退火的扩增子。然后将珠粒悬浮于水溶液中，且添加油以生成乳液。各珠粒变得悬浮于含有实施克隆轮的扩增所必要的所有试剂的油封闭的微滴中。各微滴封装用于扩增反应的反应室。在本实施方案的变型中，使用两种类型的珠粒：一种类型缀合至能够与扩增子的两条链之一杂交的寡核苷酸；且第二类型缀合至能够与扩增子的另一链杂交的寡核苷酸。在其他实施方案中，所述克隆扩增包括如例如美国专利号7,835,871、8,244,479、8,315,817和8,412,467中描述的基于二维表面的(例如，基于载片的)扩增。通常，可用或将变得可用的克隆扩增的任何方法在本发明的范围之内。
本发明的方法包括使用靶向(即，特异性杂交且能够扩增)HLA基因HLA-A、HLA-B、HLA-C、DRB1、DRB3、DRB4、DRB5、DQA1、DQB1、DPA1、和DPB1的序列的部分的引物。在一些实施方案中，所述引物靶向HLA基因的某些外显子或内含子，例如，HLA-A，外显子2 和3；HLA-B，外显子2 和3；HLA-C，外显子2 和3；DQA1:外显子2；DQB1:外显子2 和3；DPA1:外显子2；DPB1:外显子2；DRB1:外显子2、DRB3:外显子2；DRB4:外显子2；和DRB5:外显子2。在其他实施方案中，成对的引物靶向外显子和内含子序列的组合。在一些实施方案中，使用表1中列出的一种或多种引物。如表1中所示，一些引物是基因特异性的，即，可以从仅一个基因扩增序列。其他引物是通用的，即，可以从多于一个基因扩增序列。
在一些实施方案中，为了测定样品中的胎儿分数，在相同基因座的母本和非母本HLA等位基因的量通过数字小滴PCR定量测定。数字小滴PCR (ddPCR)使得能够绝对测量样品中的目标核酸，甚至在非常低的浓度。所述ddPCR方法包括数字稀释或小滴生成、PCR扩增、检测和(任选)分析的步骤。小滴生成步骤包括生成多个单独反应体积(小滴)，各自含有进行核酸扩增所必需的试剂。PCR扩增步骤包括使小滴(或更大的反应体积，其中已经沉积小滴)经受适于扩增核酸目标以生成扩增子的热循环条件。检测步骤包括鉴定含有和不含扩增子的小滴(或更大的反应体积，其中已经沉积小滴)。分析步骤包括产生例如样品中的目标核酸的浓度、绝对量或相对量(与另一目标相比)的定量。
ddPCR步骤可以手动(即，用通用设备)进行或用专门设备(诸如例如，得自Bio-Rad Labs.(Hercules, Cal.)或RainDance Tech.(Billerica, Mass.)的ddPCR设备或可得或将变得可得的类似设备)进行。在一些实施方案中，整个ddPCR步骤用专门设备来进行。在其他实施方案中，一个或多个步骤，例如，数字稀释、热循环、检测和分析用选自例如手动或自动通用移取设备、热循环仪、电泳装置等的通用设备来进行。
ddPCR产物的检测可以通过检测核酸的任何通用或序列特异性方式来进行。该检测可以在反应体积内或额外步骤诸如电泳或层析之后发生。该检测可以在扩增(实时PCR)过程中或扩增(终点PCR)完成之后发生。可检测标记可以缀合至PCR试剂，诸如引物或探针。所述标记可以通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、化学技术进行检测，或者可以使用其他技术。为了说明，有用的标记包括；放射性同位素、荧光染料、电子致密试剂、酶(如ELISA中所常用)、半抗原和针对其的抗血清或单克隆抗体可用的蛋白。作为标记的PCR试剂的替代方案，可以在PCR后用分开的标记试剂(例如，序列特异性标记的探针)进行检测。或者，可以使用检测核酸的非特异性方法，诸如电泳，随后染色。
不像测序，本文公开的基于ddPCR的方法得益于何种HLA基因座在父母之间是有信息的(即，多态性的)的知识。在一些实施方案中，所述方法包括将父母基因分型以鉴定有信息的HLA基因座的第一步骤。如果此类信息是可用的，则PCR试剂的单一集合可用于靶向母本血浆样品中的有信息的基因座。或者，希望至少一个基因座在母亲和胎儿之间是多态性的，在没有父本信息的情况下，母本样品可以经受使用一个或多个选自HLA-A、HLA-B、HLA-C、DRB1、DRB3、DRB4、DRB5、DQA1、DQB1、DPA1、和DPB1的基因座的ddPCR分析。在一些实施方案中，靶向HLA基因的特定外显子或外显子的部分，例如，HLA-A，外显子2 和3；HLA-B，外显子2 和3；HLA-C，外显子2 和3；DQA1:外显子2；DQB1:外显子2 和3；DPA1:外显子2；DPB1:外显子2；DRB1:外显子2、DRB3:外显子2；DRB4:外显子2；和DRB5:外显子2。在其他实施方案中，多态性HLA基因序列包含内含子序列或外显子和内含子序列的组合。
目前使用的HLA引物目的在于扩增和检测整个HLA外显子的序列。编码肽结合沟的HLA II类外显子(外显子2)的平均大小为约270个碱基对。因此，典型的HLA分型测定涉及约300个碱基对的扩增子(Bentley, G.,等人, (2009) High resolution, high throughput HLA genotyping by next-generation sequencing, Tissue Antigens, 74:393.) 相反，由于母体血液或血浆中发现的胎儿DNA的片段化的性质，本发明中的引物目的在于扩增和检测长度不长于160个碱基对的片段的序列。本发明中使用的引物独特地组合扩增短无细胞DNA的能力与靶向HLA基因的有信息的(即，最多态性的)区域的能力。在一些实施方案中，用包括具有表1中列出的HLA-杂交区域的至少一个引物的引物实践本发明的方法。
在一些实施方案中，扩增子通过以下测序：碱基掺入方法，例如，焦磷酸测序方法(美国专利号6,274,320、6,258,568和6,210,891)；氢离子检测方法(ISFET)(例如，美国专利号8,262,900)，或染料-终止子检测方法(美国专利号7,835,871、8,244,479、8,315,817和8,412,467)。
由本发明的方法生成的HLA序列数据包含个体DNA分子的HLA序列。本发明的方法中使用的典型NGS仪器(例如，GS家族, 454 Life Sciences, Branford, Conn.; ION PROTON®和PGM™, Life Technologies, Grand Island, N.Y.; HISEQ®和MISEQ®, Illumina, San Diego, Cal.)含有能够定量检测样品中存在的各序列(例如，样品中存在的在相同的基因座的各HLA等位基因序列)的数据分析模块。然后计数对应于胎儿和母本等位基因序列的读数的数目以测定样品中的胎儿等位基因和胎儿DNA的分数。
计算步骤通常通过能够执行软件程序的函数的计算机来进行。本发明可以用可用于或将变得可用于分析由克隆测序生成的个别核酸序列读数的任何合适的软件来实施。所述软件可以具有独特适合于分析HLA序列和分配HLA基因型的特定特征。例如，软件可以将从样品获得的序列读数与已知HLA等位基因的数据库进行比较。此数据库的一个实例是在欧洲分子生物学实验室(EMBL)维护的IMGT/HLA序列数据库，参见Robinson等人 (2003) IMGT/HLA and IMGT/MHC: sequence databases for the study of the major histocompatibility complex, Nucleic Acids Research, 31:311。用于分析HLA序列读数的典型软件鉴定样品中存在的读数间的大多数组。在典型的人样品中，对于测试的各HLA序列存在不多于四组序列读数：对于在相同基因座的两个HLA等位基因中的每个的正向和反向读数。(仅两个序列将存在于源自纯合个体的样品中)。在本发明的背景下，所述软件(如预编程或用户通过用户接口的输入)执行鉴定第三等位基因(除了样品中存在的在相同基因座的两个母本HLA等位基因以外的非母本(胎儿)HLA等位基因)的额外函数。所述软件(如预编程或用户通过用户接口的输入)必须将以低浓度(通常为1％至15％)存在的少数非母本等位基因与由于例如PCR错误插入、测序误差、相关的假基因、样品中的轻微DNA污染物等导致且以比非母本(胎儿)等位基因更低浓度(例如，≪0.5%)存在的人为结果进行区分。
在一些实施方案中，所述软件将序列读数与HLA序列数据库进行比较且将两个(或在纯合母亲的情况下，一个)最普遍的序列鉴定为在特定HLA基因座的母本等位基因。不限制本发明的范围，但仅仅通过实例的方式，Conexio HLA基因分型软件(Conexio Genomics, Ltd., Perth, Australia)将已经比对的合并的序列读数与给定扩增子的参考序列(例如，DQB1外显子2)进行比较，且将观察到的序列读数与IMGT/HLA序列数据库进行比较。对应于该扩增子的所有读数被分选至DQB1外显子2“箱(bin)”，且该软件假设对于任何一个样品存在仅两个等位基因序列(两个正向读数和两个反向读数)。这些序列被分选至“主要层(Master Layer)”且用于基因型分配。通常丰度比真实等位基因小得多、对应于人为物或污染物的所有其他序列读数被分选至“失败层(Failed Layer)”且不用于基因型分配。
本发明的方法需要检测多于一种基因型，即样品中存在的多于两个等位基因。在一些实施方案中，所述软件(如预编程或用户通过用户接口的输入)鉴定且将少数组分分选至多个“箱(bins)”，其代表对应于扩增子(例如，DQB1基因座)的不同的等位基因组。例如，代替对于DQB1外显子2仅具有一个“箱(bin)”，所述方法包括对于在DQB1基因座的多个等位基因生成多个“箱(bins)”(例如，DQB1*01:01、*02:01、*03:01等)。在一些实施方案中，生成多于2个，例如，3、4、5、6和多达15或20个此类箱。将对应于少数组分的HLA类型的序列分选至适当箱中。噪声(即，PCR和测序误差、假基因等)仍然通常分选至每个箱的失败层。该步骤允许快速鉴定多数组分的等位基因(母本等位基因)，以及鉴定对应于少数组分的读数。值得注意的是，该方法适合于鉴定胎儿等位基因，即使亲本基因型是未知的。在一些实施方案中，所述亲本基因型是已知的。在此类实施方案中，可以修改所述软件以鉴定和计数特定的母本和父本等位基因且丢弃作为“失败”读数的与其不同的所有读数。
在一些实施方案中，所述方法包括尽可能减少由于例如PCR错误插入、测序误差、相关的假基因、样品中的轻微DNA污染物等产生的人为结果导致的误差的步骤。PCR或测序误差可以将母本等位基因“转化”成另一种已知的HLA等位基因是可能的。尽管预期该事件是稀少的，即，频率比非母本等位基因的频率低得多，但在一些实施方案中，本发明的方法包括尽可能减少此类误差的步骤。例如，所述方法可以包括分析处于强连锁不平衡的基因的两种扩增子，例如，DQA1和DQB1。如果误差将多数等位基因转化成对应于DQB1的已知第三非母本等位基因的序列，则随机误差也应当将母本DQA1等位基因转化成对应于与人为DQB1等位基因连锁不平衡的DQA1等位基因的序列是极不可能的。
本发明是测定样品中胎儿核酸的分数或浓度的方法，其包括：定量检测所述样品中的至少一种非母本HLA等位基因，定量检测在相同基因座的至少一种母本HLA等位基因；且使用所述母本和非母本等位基因的量，测定所述样品中的胎儿分数。在一些实施方案中，至少一种HLA等位基因选自HLA-A、HLA-B、HLA-C、DRB1、DRB3、DRB4、DRB5、DQA1、DQB1、DPA1、和DPB1等位基因，具体地在一些实施方案中，所述等位基因包含选自以下的序列：HLA-A，外显子2 和3；HLA-B，外显子2 和3；HLA-C，外显子2 和3；DQA1，外显子2；DQB1，外显子2 和3；DPA1，外显子2；DPB1，外显子2；DRB1，外显子2；DRB3，外显子2；DRB4，外显子2；和DRB5，外显子2、或内含子序列或来自这些基因的外显子和内含子序列的组合。在一些实施方案中，所述定量检测包括克隆测序。在一些实施方案中，所述方法包括在测序之前的目标富集步骤。在本实施方案的变型中，所述富集通过DNA扩增进行。在本实施方案的其他变型中，所述富集通过目标捕获进行。
所述方法进一步包括使用母本和非母本序列读数的量测定样品中的胎儿分数。所述测定步骤包括计算非母本(胎儿)读数与母本读数或与读数的总数减去背景噪声的比率。因为比率反映两个胎儿等位基因中的仅一个的比例，所以将该比率加倍以获得胎儿DNA的分数。
不将本发明限于单一技术或仪器、但仅仅通过实例的方式，可以使用测序仪器的GS家族包括如下所述的GS FLX®、GS FLX+®、GS FLX TITANIUM®或GS Junior® (454 Life Sciences, Branford, Conn.)进行该方法的实施方案。
在本实施方案中，所述目标富集和测序步骤包括：(a)在第一扩增反应中，使用扩增引物扩增包含多态性位点的一个或多个HLA-A、HLA-B、HLA-C、DRB1、DRB3、DRB4、DRB5、DQA1、DQB1、DPA1和DPB1的外显子或内含子，所述扩增引物包含5’-至3’-引发方向列出的以下序列：衔接序列、分子识别序列和HLA-杂交序列；(b)在第二扩增反应中，进行乳液PCR；(c)使用焦磷酸测序测定步骤(b)中获得的各扩增子的序列；(d)通过将步骤(c)中测定的HLA扩增子的序列与已知的HLA序列进行比较而将HLA等位基因分配至母亲或胎儿，以确定何种HLA等位基因存在于母体血液或血浆中；(e)对于一个或多个HLA等位基因，定量对应于步骤(c)中获得的各等位基因的胎儿和母本测序读数的数目；和(f)使用步骤(e)中获得的量，通过计算非母本(胎儿)读数与母本读数或与读数的总数减去背景或与读数的总数的比率来测定母体血液或血浆中存在的胎儿DNA的分数。
在本实施方案的变型中，所述方法包括在步骤(a)之后，合并来自多个个体的扩增子且对来自多个个体的扩增子的合并物进行随后的步骤(b) – (c)。在该变型中，所述扩增引物进一步包括也称为多重识别(MID)标签的个体识别标签。
在其他实施方案中，使用任何可用的深度测序技术和仪器(即，能够数字序列读出的技术和仪器)进行步骤(b)-(e)或其等效物。没有限制，仪器的实例包括仪器的GS家族(454 Life Sciences, Branford, Conn.)；ION PROTON®和PGM™ (Life Technologies, Grand Island, N.Y.)；HISEQ®和MISEQ® (Illumina, San Diego, Cal.)或其任何改进和改变。
在一些实施方案中，胎儿分数的测定包括将对应于非母本(胎儿)等位基因的读数与在相同基因座的所有读数的总和或与从样品获得的对应于在相同基因座的母本等位基因的读数或与母本等位基因加上胎儿等位基因的总和进行比较。在一些实施方案中，所述比较步骤包括计算对应于非母本(胎儿)等位基因的读数与从样品获得的在相同基因座的所有读数的总和；或与从样品获得的对应于在相同基因座的母本等位基因的读数或与母本等位基因加上胎儿等位基因的总和的比率的2倍。例如，在一个实施方案中，如果母本等位基因的读数的数目是M1和M2且非母本胎儿等位基因是F，则可以根据式1测定胎儿分数(FF)：
FF = 2 x F/(M1+M2+F) 式1。
在另一个实施方案中，可以将读数分解成各等位基因的正向(F)和反向(R)测序读数。然后胎儿分数(FF)可以被测定为根据式2 测定的反向(FFR)和正向(FFF)分数的平均值：
FFR = 2 x FR/(M1R+M2R+FR) FFF = 2 x FF/(M1F+M2F+FF)
FF = (FFR + FFF)/2 式2。
可以设计使用非母本胎儿等位基因F和母本等位基因M1和M2中的一个或两个或在纯合母亲的情况下单一母本等位基因M测定胎儿分数的任何数目的类似式，且在本发明的范围之内。
在又另一个实施方案中，可以测序几个HLA基因座。来自各基因座的读数可以用于根据式1或式2计算胎儿分数，且对各基因座的所得胎儿分数值取平均值以获得胎儿分数的估计值。
还在本发明的范围内的是需要测定母体血液或血浆中的胎儿分数或胎儿DNA的量的各种诊断和监测方法。在一个实施方案中，本发明是确定怀孕患者是否具有或可能发展先兆子痫的方法。所述方法包括确定胎儿分数(患者血液中的胎儿核酸的浓度)是否超过阈值水平。在本实施方案中，胎儿核酸的浓度通过包括以下的方法来测定：提供来自所述患者的血液样品；在所述样品中定量检测所述样品中的至少一种非母本HLA等位基因；任选地，定量检测所述样品中在相同基因座的至少一种母本HLA等位基因；且任选地，比较所述母本和非母本HLA等位基因的量，从而测定所述样品中胎儿核酸的分数或浓度。如果发现胎儿分数超过特定预定水平，则将所述患者诊断为具有或可能发展先兆子痫。所述预定水平可以是，例如，在相同妊娠阶段没有先兆子痫的患者的母体血液或血浆中的胎儿分数或胎儿DNA的量。
在本实施方案的变型中，本发明包括通过定期测定通过包括以下的方法测定的患者的血液或血浆中的胎儿分数或胎儿核酸的浓度而监测怀孕患者的先兆子痫的发展的方法：提供来自所述患者的血液样品；在所述样品中定量检测所述样品中的至少一种非母本HLA等位基因；任选地，定量检测所述样品中在相同基因座的至少一种母本HLA等位基因；任选地，比较所述母本和非母本HLA等位基因的量，从而测定所述样品中胎儿分数或胎儿核酸的浓度。如果定期测量检测到增加，则将所述患者诊断为具有或可能发展先兆子痫。
在其他实施方案中，本发明是检测胎儿染色体异常的方法。所述方法包括通过以下测定胎儿分数(母体血液中的胎儿DNA的浓度)：提供来自母亲的血液样品，定量检测所述样品中的至少一种非母本HLA等位基因；定量检测所述样品中在相同基因座的至少一种母本HLA等位基因；比较所述母本和非母本HLA等位基因的量，从而测定所述样品中胎儿核酸的分数。所述方法进一步包括定量检测所述样品中的来自怀疑异常的至少一个染色体的基因座；确定检测的染色体基因座是否以相对于步骤中测定的胎儿DNA的分数的异常量存在，从而检测所述胎儿染色体异常。所述异常量被定义为与在相同妊娠阶段的整倍体胎儿的母体血液中发现的相同基因座的量显著不同的量。
在另一个实施方案中，本发明是检测胎儿中等位基因的存在或纯合状态的方法，其中所述等位基因与疾病状态相关。所述疾病状态包括现有疾病或发展所述疾病的倾向性。所述方法包括提供来自怀有所述胎儿的母亲的血液样品；通过包括以下的方法测定所述样品中的非母本HLA等位基因的分数：定量检测所述样品中的至少一种非母本HLA等位基因，定量检测所述样品中在相同基因座的至少一种母本HLA等位基因，比较所述母本和非母本HLA等位基因的量，从而测定所述样品中非母本HLA等位基因的分数；定量检测所述样品中的与疾病状态相关的等位基因；将与疾病状态相关的等位基因的量与非母本HLA等位基因的分数进行比较，从而确定所述与疾病状态相关的等位基因在所述胎儿中是否以单一拷贝、两个拷贝存在或不存在。在本实施方案的一个变型中，所述方法包括检测代表携带一个隐性等位基因的胎儿的携带者状态的单一等位基因的存在。在本实施方案的另一个变型中，所述方法包括检测代表携带常染色体显性等位基因或单倍体不足的等位基因的胎儿的疾病状态的单一等位基因的存在。在本实施方案的另一个变型中，所述方法包括在胎儿中检测与胎儿的疾病状态相关的隐性等位基因的纯合状态。
实施例
实施例 1
样品收集和 DNA 纯化
从人主体收集样品：在妊娠末三月的妇女和胎儿的父亲。如下制备DNA。收集全血且在两周内处理。通过在环境温度以1600 x g离心10分钟而制备“血沉棕黄层”。小心去除血浆(上清液)以避免任何细胞，且以16,000 x g重新离心10分钟。在不干扰细胞沉淀的情况下小心取出无细胞的血浆，且储存在-80℃。通过使用QIAGEN QIAMP® DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Valencia, Cal.)从“血沉棕黄层”制备DNA，且根据COBAS® EGFR突变测试试剂盒:EDTA血浆方案(Roche Applied Science, Indianapolis, Ind.)根据制造商的说明从无细胞的血浆制备DNA。使用Oragene-Dx试剂盒(DNA Genotek, Kanata, Ont.)收集唾液，且根据制造商的说明分离DNA。使用Gentra PUREGENE®试剂盒(Qiagen, Valencia, CA)从细胞系纯化DNA。
实施例 2
父母的基因分型
通过Moonsamy, P., 等人(2013) Tissue Antigens, 81:141公开的方法或如对于GS GType HLA引物HR试剂盒所述，使用来自实施例1中分离的血沉棕黄层或唾液的DNA进行父母的基因分型。DQB1基因座被认为是有信息的：父亲具有母亲不存在的DQB1等位基因。父母的基因型如下：
实施例 3
来自血浆的无细胞 DNA 的深度测序
用以下在个别25 µl反应中进行PCR扩增：1-10 ng DNA模板和10皮摩尔各正向和反向引物，10 mM Tris-HCl, pH 8.3，50 mM KCl，1.5 mM MgCl，150 µM各dA、dC、dG和dUTP，甘油10% w/v和AmpliTaq Gold® DNA聚合酶。热循环条件：95℃-10分钟；31个循环的95℃-15秒，60℃-45秒，72℃-15秒；72℃-5分钟，在ABI GeneAmp® PCR System 9700中。
用于与GS FLX®仪器使用的引物具有5’-3’-取向的以下排列：衔接子-关键标签-MID -HLA-杂交序列。用于与MI-SEQ®仪器使用的引物具有5’-3’-取向的以下排列：衔接子– MID – HLA-杂交序列。根据制造商的推荐设计衔接子、关键标签和MID序列。HLA-杂交序列列于表1中。
表 1
引物的 HLA- 杂交序列
*S = C或G。引物样品含有在所示位置含有C或G的寡核苷酸的等量混合物。
扩增子清理、定量、稀释和合并如下进行。使用AMPURE®系统(Agencourt Bioscience Corp., Beverly, Mass.)，遵循454 Life Sciences GS GType HLA MR和HR试剂盒(Roche Applied Science, Indianapolis, Ind.)中描述的清理方案，从扩增子去除短的非特异性和引物二聚体人为产物。在96孔E-GEL® (Life Technologies, Carlsbad, Cal.)通过电泳进一步评估纯化扩增子的等分试样。如果观察到引物二聚体，则重复AMPure步骤且通过E-GEL®重新评估产物。然后在微板荧光分光光度计上通过QUANT-IT™ PICOGREEN®测定(Life Technologies, Carlsbad, Cal.)定量纯化的扩增子。八个标准品跨越0 ng/µl至12.5 ng/µl的DNA浓度。无法通过PICOGREEN®检测的任何扩增子被分配0.1 ng/µl的浓度(以允许进行稀释度计算)，且完成随后的步骤。将扩增子稀释至1 x 106个分子/µl。制备扩增子的合并物，使得合并注定用于在454 PicoTiter板(PTP)的单一区域上测序的所有扩增子；通常将5 ul各扩增子添加至合并物。
乳液PCR、珠粒回收和焦磷酸测序如下进行。乳液PCR(emPCR)、含有DNA的珠粒的富集和GS FLX®仪器(454 Life Sciences, Branford, Conn.)上的焦磷酸测序在4-区域PTP上根据GS FLX TITANIUM®系列手册:emPCR方法手册 - LibA MV (2010年1月)；测序方法手册(2010年5月)来实施，具有以下例外：1) 在emPCR过程中，以每个珠粒0.4-0.5拷贝使用扩增子合并物，2) 以指定的0.25倍的浓度使用emPCR引物，3) 通过在MultiProbe HT液体处理器(Perkin Elmer, Waltham, Mass.)上使用REMe模块(Roche Applied Science, Indianapolis, Ind.)使珠粒富集自动化，和4) 对于测序，将60％推荐装载量的富集的DNA珠粒分配至PTP板上。以相同的方式实施GS JUNIOR®仪器上的测序，除了使用的方法手册是GS JUNIOR® emPCR Amplification Method Manual Lib-A_March 2012和GS Junior Sequencing Manual_Jan2013。
使用454 AVA®软件的一致函数整合序列。基于Microsoft Windows®的计算机上安装的ASSIGN ATF® 454软件(v 34) (Conexio Genomics, Ltd., Perth, Australia)用于序列的分析。该软件将等位基因分配至每个序列读数且计算对应于每个等位基因的序列读数的数目。结果显示于表2中。列“有效读数”显示其中序列被成功读取且标识为HLA DQB1基因的亲本等位基因之一的读数的数目。
表 2
实施例 3 中获得的序列读数
胎儿分数被计算为对应于非母本(胎儿)等位基因的读数与从样品获得的所有读数的总和的比率的两倍，如表3中所示。
表 3
胎儿分数的测定
该计算测定获得的HLA DQB1序列的5.8％来自亲本等位基因，代表单倍体基因组当量。负责二倍体胎儿基因组，血浆DNA的5.8 x 2 =11.6%是胎儿的。
实施例 4
检测等位基因的存在或纯合状态
在本预示性实施例中，患者怀有胎儿，其中父母双方都是囊性纤维化跨膜调节蛋白(CFTR)基因(基因型Dd)的相同突变等位基因的携带者。本发明的方法使得能够确定胎儿是否无突变，是携带者或对于所述突变是纯合的，且将受到囊性纤维化(CF)影响。第一步骤包括通过实施例1和3中描述的方法确定母体血液样品中的胎儿分数，其中母本HLA等位基因是H1和H2且在相同基因座的非母本HLA等位基因是H3。基于表4中的日期，样品中的胎儿分数为2x2=4%。
表 4
样品中胎儿 HLA 等位基因的假设分数
第二步骤包括通过任何测序方法，例如，实施例3中描述的方法，确定相同样品中的突变CFTR等位基因(d)和非突变CFTR等位基因(D)的分数。以下是基于样品中被测定为4%的胎儿分数的CF状态的假设确定(表4中的假设数据)。根据表5中呈现的假设数据，如果突变(d)等位基因以52％存在且非突变(D)等位基因以48％存在。样品中的突变等位基因的过量是4％，其对应于相同样品中测定的胎儿分数。因此，胎儿可能仅携带突变等位基因(基因型dd)且受到囊性纤维化影响。
表 5
样品中 CFTR 等位基因的假设分数
实施例 5
细胞系对照样品
在ddPCR的真正临床对照不存在的情况下，使用被鉴定为与HLA-DQB1的探针结合区域下的四种已知亲本等位基因中的每种匹配的来自细胞系的DNA(表6)。
表 6
在探针结合区域中具有与所示等位基因相同的序列的细胞系
将细胞系DNA稀释和/或掺合以生成人为的纯母本或父本DNA对照。类似地，与母本等位基因(M1和M2)匹配的来自细胞系的DNA样品用与父本等位基因匹配的那些掺入，以生成10％和2.5％父本DNA掺合物。使用对于一个母本等位基因和单一父本等位基因(纯合的父亲)特异性的两TaqMan小沟结合剂(MGB)探针测定法表征所有样品。FAM-标记的探针与M1等位基因完全匹配，针对M2和P等位基因具有2-3个错配。Vic-标记的探针与父本等位基因完全匹配，针对母本等位基因中的每个具有1-2个错配。在与所有等位基因良好匹配的保守区域中设计139个碱基对的短扩增子的引物(表7)。
表 7
寡核苷酸序列
实施例 6
数字小滴 PCR(ddPCR)
根据QX100™小滴生成器(BioRad Labs., Hercules, Cal.)的制造商的说明完成ddPCR设置。在一式两份反应中运行各样品。将9uL样品与BioRad Droplet PCR Supermix、250nM各探针和900nM各引物和4个单位的尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)在最终20µL PCR体积中合并。将最终反应混合物连同平行孔中的70uL的小滴生成油转移至小滴生成器芯片上的单一孔中。在完成小滴生成后，将40uL悬浮于油中的所得小滴转移至96孔板。然后使用以下热循环概况循环小滴：50℃持续5分钟(UNG步骤)，随后为在95℃的10分钟热活化步骤，和40个循环的94℃(30秒)至57℃(1分钟)，和98℃保持10分钟。使用BioRad QX100™小滴读取器读取FAM和VIC通道两者中的各小滴的端点荧光。为了避免假阳性，在无目标对照重复和/或纯母本细胞系对照(在VIC通道中)和纯父本细胞系对照(在FAM通道中)观察到的任何噪声上绘制阳性小滴调用(calls)的阈值。通过乘以20将来自每份样品两个重复的合并孔的拷贝数/µL浓度输出值转化为每个反应的小滴数。
通过将VIC阳性值(检测母本等位基因)除以总信号(VIC阳性值 + 2 x FAM M1阳性值)测定胎儿DNA的百分数(胎儿分数)。母体来源的样品中检测到任何父本等位基因表明母体血液中循环胎儿DNA。由于仅一个父本等位基因被传递至胎儿，VIC信号必须加倍以获得正确的胎儿分数。结果显示于图1中。在样品1-6中，上小图(FAM通道)代表母本等位基因检测，且下小图(VIC通道)代表父本等位基因检测(表8)。
表8中的数据显示该ddPCR测定在母本DNA的背景中以2.5和10％检测到父本等位基因的能力；以及来自妊娠末三月的母亲的临床血浆样品中的胎儿分数的测定值被计算为父本等位基因的分数的两倍。
表 8
测定的母本和父本等位基因分数和或胎儿分数
样品编号 说明 观察到的M1等位基因(拷贝数/rxn) 观察到的P等位基因(拷贝数/rxn) %母本DNA* (M1 x 2)/(总计**) %父本等位基因P/(总计) %胎儿DNA %P x 2
1 无目标对照 0 0 0 0 N/A
2 父本对照：2000c P细胞系DNA 0 2000 0 100 N/A
3 母本对照：1000c M1 + 1000c M2细胞系DNA掺合物 1018 0 100 0 N/A
4 10% P对照：200c P和1000c各M1, M2细胞系DNA掺合物 972 192.8 91.0 9.0 N/A
5 2.5% P对照：50c P和1000c各M1, M2细胞系DNA掺合物 1090 49 97.8 2.2 N/A
6 临床样品：末三月母体血浆 48.6 6.52 88.2 5.91 11.82
* ％母本是杂合母亲(基因型M1 M2)中的单一等位基因的%的两倍(M1 x 2)
** 人为样品的“总计”为(2 x M1 + P)。如果父亲是杂合的(基因型P1 P2)，则这会是(2 x M1 + 2 x P1)。临床样品的“总计”是(2 X M1) + (2 x P)以解释二倍体母亲和二倍体胎儿，其中M1等位基因不被传递至胎儿。当M1等位基因被传递至胎儿时，其会是2 (M1-P) + (2 x P)。在本实施例中，对婴儿基因分型证实了M1不被传递至胎儿。
尽管已经关于特定实施例详细描述了本发明，但对本领域技术人员显而易见的是，可以在本发明的范围内进行各种修改。因此，本发明的范围不应受到本文所述的任何实施例而应受到下面呈现的权利要求来限定。

Claims (23)

1.测定血液或血浆样品中胎儿核酸的分数的方法，其包括：
(a) 定量检测所述样品中的至少一种非母本HLA等位基因；
(b) 定量检测所述样品中在相同基因座的至少一种母本HLA等位基因；
(c) 使用步骤(a)和(b)中检测的量，测定所述样品中的胎儿核酸的分数。
2.权利要求1的方法，其中所述测定步骤包括计算步骤(a)中检测的所述非母本HLA等位基因的量与步骤(a)和(b)中测定的HLA等位基因的量的总和的比率的2倍。
3.权利要求1或2中任一项的方法，其中所述至少一种非母本和母本HLA等位基因包含选自以下的序列：HLA-A，外显子2和3；HLA-B，外显子2和3；HLA-C，外显子2和3；DQA1，外显子2；DQB1，外显子2和3；DPA1，外显子2；DPB1，外显子2；DRB1，外显子2；DRB3，外显子2；DRB4，外显子2；和DRB5，外显子2或来自所述HLA基因的内含子序列或来自所述基因的外显子和内含子序列的组合。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述HLA等位基因通过包括以下的方法定量检测：测序，具体而言克隆测序。
5.权利要求4的方法，其进一步包括在测序之前的目标富集步骤，且其中所述目标富集步骤包括至少一轮基因组DNA扩增或目标捕获。
6.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述HLA等位基因通过包括以下的方法定量检测：
(a) 用正向引物和反向引物扩增，以获得HLA扩增子；
(b) 进行克隆测序以测定步骤(a)中获得的HLA扩增子的序列；
(c) 鉴定在相同基因座的至少一种母本HLA等位基因和至少一种非母本HLA等位基因；
(d) 比较步骤(c)中鉴定的母本和非母本HLA序列克隆的数目，从而测定所述样品中的胎儿核酸的分数。
7.权利要求6的方法，其中步骤(c)中的鉴定包括以下计算步骤：
(a) 将在所述HLA基因座的序列与HLA序列数据库进行比较；
(b) 将所述序列分选至对应于已知HLA等位基因的多个箱；
(c) 将一个或两个多数序列鉴定为母本等位基因；
(d) 将一个或两个最代表的少数序列鉴定为非母本等位基因。
8.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述HLA等位基因通过包括数字PCR的方法定量检测。
9.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述HLA等位基因通过包括以下的方法定量检测：
(a) 将所述样品分成多个反应体积，各自包含零至近似五个拷贝的目标HLA等位基因；
(b) 测定各反应体积中目标HLA等位基因的存在；
(c) 将含有所述非母本HLA等位基因的反应体积的数目与含有在相同基因座的母本HLA等位基因的反应体积的数目进行比较，从而测定所述样品中的胎儿核酸的分数。
10.权利要求1至9中任一项的方法，其进一步包括独立获得在至少一个HLA基因座的父母一方或双方的基因型信息。
11.检测胎儿中的染色体异常的方法，其包括：
(a) 提供来自怀有所述胎儿的母亲的血液样品；
(b) 通过包括以下的方法测定所述样品中胎儿核酸的分数：定量检测所述样品中的至少一种非母本HLA等位基因；定量检测所述样品中在相同基因座的至少一种母本HLA等位基因； 比较所述母本和非母本HLA等位基因的量，从而测定所述样品中的胎儿核酸的浓度；
(c) 定量检测所述样品中的来自怀疑异常的至少一个染色体的基因座；
(d) 确定步骤(c)中检测的染色体基因座是否以相对于步骤(b)中测定的胎儿DNA的浓度的异常量存在，从而检测染色体异常。
12.权利要求11的方法，其中所述至少一种非母本HLA等位基因选自HLA-A，外显子2和3；HLA-B，外显子2和3；HLA-C，外显子2和3；DQA1，外显子2；DQB1，外显子2和3；DPA1，外显子2；DPB1，外显子2；DRB1，外显子2；DRB3，外显子2；DRB4，外显子2；和DRB5，外显子2或来自所述基因的外显子和内含子序列的组合。
13.权利要求11或12中任一项的方法，其中在步骤(a)中，在两个、三个或更多个基因座检测在相同基因座的所述非母本HLA等位基因和所述母本HLA等位基因。
14.通过测定患者血液中的胎儿分数是否超过阈值水平而确定怀孕患者是否具有或可能发展先兆子痫的方法，其中通过包括以下的方法来测定所述胎儿分数：提供来自所述患者的血液样品；定量检测所述样品中的至少一种非母本HLA等位基因；定量检测所述样品中在相同基因座的至少一种母本HLA等位基因；比较所述母本和非母本HLA等位基因的量，从而测定所述样品中的胎儿分数。
15.权利要求14的方法，其中所述至少一种非母本HLA等位基因选自HLA-A，外显子2和3；HLA-B，外显子2和3；HLA-C，外显子2和3；DQA1，外显子2；DQB1，外显子2和3；DPA1，外显子2；DPB1，外显子2；DRB1，外显子2；DRB3，外显子2；DRB4，外显子2；和DRB5，外显子2或来自所述基因的外显子和内含子序列的组合。
16.权利要求14或15中任一项的方法，其中在步骤(a)中，在两个、三个或更多个基因座检测在相同基因座的所述非母本HLA等位基因和所述母本HLA等位基因。
17.通过经由权利要求14的方法定期测定患者血液中的胎儿分数而监测怀孕患者的先兆子痫的发展的方法，且如果检测到胎儿分数的增加则将患者诊断为具有或可能发展先兆子痫。
18.通过测定母体血液中的胎儿核酸的浓度是否超过阈值水平而确定怀孕患者是否具有或可能发展先兆子痫的方法，其中通过包括以下的方法来测定胎儿核酸的浓度：提供来自所述患者的体积血液样品；定量检测所述样品的体积中的至少一种非母本HLA等位基因，从而测定胎儿核酸的浓度。
19.权利要求18的方法，其中所述至少一种非母本HLA等位基因选自HLA-A，外显子2和3；HLA-B，外显子2和3；HLA-C，外显子2和3；DQA1，外显子2；DQB1，外显子2和3；DPA1，外显子2；DPB1，外显子2；DRB1，外显子2；DRB3，外显子2；DRB4，外显子2；和DRB5，外显子2或来自所述基因的外显子和内含子序列的组合。
20.权利要求18或19中任一项的方法，其中在步骤(a)中，在两个、三个或更多个基因座检测在相同基因座的所述非母本HLA等位基因和所述母本HLA等位基因。
21.检测胎儿中的等位基因的存在或纯合状态的方法，其中所述等位基因与疾病状态相关，所述方法包括：
(a) 提供来自怀有所述胎儿的母亲的血液样品；
(b) 通过包括以下的方法测定所述样品中的非母本HLA等位基因的分数：定量检测所述样品中的至少一种非母本HLA等位基因；定量检测所述样品中在相同基因座的至少一种母本HLA等位基因；比较所述母本和非母本HLA等位基因的量，从而测定所述样品中的非母本HLA等位基因的分数；
(c) 定量检测所述样品中的与疾病状态相关的等位基因；
(d) 将与疾病状态相关的等位基因的量与非母本HLA等位基因的分数进行比较，从而确定所述与疾病状态相关的等位基因在所述胎儿中是否以单一拷贝、两个拷贝存在或不存在。
22.权利要求21的方法，其中所述至少一种非母本HLA等位基因选自HLA-A，外显子2和3；HLA-B，外显子2和3；HLA-C，外显子2和3；DQA1，外显子2；DQB1，外显子2和3；DPA1，外显子2；DPB1，外显子2；DRB1，外显子2；DRB3，外显子2；DRB4，外显子2；和DRB5，外显子2或来自所述基因的外显子和内含子序列的组合。
23.权利要求21至22中任一项的方法，其中在步骤(a)中，在两个、三个或更多个基因座检测在相同基因座的所述非母本HLA等位基因和所述母本HLA等位基因。
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