CN116042848A - 一种通过血样检测判断动物体内存在移植物的方法 - Google Patents
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract
本申请涉及医学检验技术领域，具体涉及一种通过血样核酸检测评估动物体内移植物存活情况的方法。在此提供了一种通过检测循环中的微量核酸验证脑内移植物是否存活的方法，其包括：a)从受移植生物体内抽取血样；b)通过核酸检测法检测所述血样中有否移植物的特有基因的存在；c)通过所述血样中存在所述移植物特有基因的事实判断所述脑内移植物是否存活。
Description
技术领域
本申请涉及医学检验技术领域，具体涉及一种通过血样核酸检测评估动物体内存在移植物的方法。
背景技术
细胞治疗是将神经细胞注射进入患者或动物模型的脑组织，植入的细胞通过替代的方式修复和重建宿主的神经系统，从而产生持续的治疗效果。其中，移植物的长期存活对治疗效果是非常关键的。然而，要在活体动物中确定移植的细胞是否存在高度依赖各种标记物和示踪方法，需要对移植细胞进行基因编辑，并且需要特殊成像设备的辅助，而且在人体试验中，目前无法使用细胞标记物，缺少动态监测细胞存活和状态的方法。
Cas蛋白的反式切割活性最早在2016年被报道，Cas13a在与靶RNA结合后，会激活其非经典的对于任意RNA的切割能力，转染有CRISPR/Cas13a的大肠杆菌细胞生长减缓。在LbuCas13a被报道时，Cas13a的反式切割活性首次被用于核酸检测。2018年，2种基于CRISPR/Cas12a的核酸检测技术：DETECTR(DNA endonuclease-targeted CRISPR transreporter)和HOLMES(an one-Hour Low-cost Multipurpose highly Efficient System)被开发。实现了人类乳突病毒(human papillomavirus,HPV)的检测和分型、SNP检测。随着Cas12b被发现，该类酶在检测中的应用有待于进一步被挖掘。
2018年，中国科学院动物研究所的李伟、周琪、滕飞等人申请了名为“核酸检测方法”的中国发明专利，在此文献中他们报道了一种基于CRISPR/Cas12b的检测体系并将其命名为“CDetection”；之后，又在进一步的文章发表中更为详尽地解释了这种核酸检测技术的工作原理，具体可见：CDetection:CRISPR-Cas12b-based DNA detection with sub-attomolar sensitivity and single-base specificity；Teng et al.Genome Biology(2019)。
发明内容
本申请所涉及的核酸检测技术即基于“CDetection”技术。本申请要解决的技术问题为：通过采集少量外周血液并检测其中的核酸来评估脑内移植的异体细胞的存活情况，以解决现有细胞治疗临床试验中细胞移植后无法追踪等问题。
本申请提供了：
1.一种通过检测循环中的微量核酸验证动物体内移植物是否存活的方法，所述方法包括：a)从受移植生物体内抽取血样；b)通过核酸检测法检测所述血样中是否有移植物的特有基因的存在；c)通过所述血样中存在所述移植物特有基因的事实判断所述移植物是否存在于所述动物体内：若检测到所述移植物特有基因，则判断为该动物体内存在所述移植物；其中，所述动物体内移植物选自通过下组的一项或多项的移植物：脑移植、静脉注射移植、经鼻滴入移植、局部组织/器官/空腔注射移植、局部包埋/贴片移植。
2.根据项1所述的方法，其中，所述核酸检测法的步骤为：
-核酸扩增步骤：使用靶向移植物的特有基因的引物进行PCR反应扩增来自所述血样中的移植物核酸；
-催化/显色步骤：使用sgRNA与Cas12b和荧光探针检测血浆中是否存在来自移植物的特有基因的序列片段，其中，在sgRNA结合靶核酸的情况下所述Cas12b会反式切割荧光探针从而显示荧光，基于荧光检测的结果来确认所述血样中是否有移植物的特有基因的存在。
3.根据项2所述的方法，其中，所述移植物和受移植生物体都是哺乳动物来源的。
4.根据项3所述的方法，其中，所述移植物是人来源的，而受移植生物体是小鼠；所述特有基因为TBC1D8B、ADH1C(A)或者BCL11A。
5.根据项3所述的方法，其中，所述移植物和受移植生物体均是人来源的，所述特有基因为移植物供者和受移植生物体的差异基因位点，所述特有基因优选为组织相容性复合体(MHC)基因中的白细胞表面抗原(HLA)位点。
6.根据项4所述的方法，其中，当所述基因是TBC1D8B时，所述F端引物选自SEQ IDNO.1、3、5、8、11中的任一项，最优选为SEQ ID NO.1；而R端引物选自SEQ ID NO.2、4、6、7、9、10中的任一项，最优选为SEQ ID NO.9。
7.根据项4所述的方法，其中，当所述基因是TBC1D8B时，所述sgRNA的序列选自SEQID NO.13-17的任一项，最优选为SEQ ID NO.17。
8.根据项4或5所述的方法，所述荧光探针的序列如SEQ ID NO.18号所示，具体为5'-FAM-TTTTTTT-BHQ1-3'。
9.根据项5所述的方法，其中，所述F端引物选自SEQ ID NO.23、27、30、34、38中的任一项；而R端引物选自SEQ ID NO.24、28、31、35、39中的任一项。
10.根据项5所述的方法，其中，所述sgRNA的序列选自SEQ ID NO.22、25、26、29、32、33、36、37中的任一项。
11.根据项3所述的方法，其中，在扩增步骤使用等温扩增反应，孵育时间为至少15分钟，温度为37至50℃。
12.根据项3所述的方法，其中，在催化/显色步骤所使用的反应时间为至少25分钟，Cas酶浓度为20至200nM，荧光探针的初始浓度为150至1000nM。
本申请取得的有益技术效果
采用本申请的技术方案，在受移植生物体的体内成功检测到了微量的移植物物种的核酸信息(灵敏度达20拷贝每微升)，这表明本申请请求保护的技术方案是一种有潜力的在临床以及前临床试验中评估脑内移植的异体细胞的存活情况的医学检验方法。
附图说明
图1为“位点筛选实验”的结果示意图；该实验是从文献中查阅得到的一些基因，每个基因随机挑选了一个gRNA靶向的位点，目的在于挑选反式切割荧光信号高，能高度激活反式切割活性的位点)，该实验的结果说明，TBC1D8B靶向的区域可以作为候选位点(RFU是指相对荧光单位)；
图2为“dsDNA浓度筛选实验”的结果示意图(dsDNA是作为激活CRISPR反式切割的激活子，该实验主要是验证在在该位点的检测中，Cas-sgRNA-dsDNA三元复合物具有很好的反式切割活性)，该实验的结果说明，Cas-sgRNA-dsDNA三元复合物具有很好的反式切割活性。
图3为“引物筛选实验”的结果示意图，该实验的结果说明，TBC1D8B位点的引物取得了较佳的结果，在此使用了热图，荧光信号值越高，则引物扩增能力越强，热图的颜色越深；确定最终引物为F3R5。
图4为“sgRNA特异性实验”的结果示意图，该实验的结果说明基于目前位点选择的高效率sgRNA在用来检测人基因组和鼠基因组作为模板等温扩增的产物结果图示中并不能很好的区分两种物种的基因组；“倍数变化”表示该时间终点荧光值与检测起点荧光值的比值。
图5为“通过sgRNA错配提高检测特异性实验”的结果示意图，该实验的结果说明在用不同sgRNA间隔体对sgRNA进行错配后，发现tgRNA5号错配方案能很好地区分两种物种的基因组。
图6为“序列分析人鼠靶向区域的靶位点引物和sgRNA特异性”，为了进一步验证引物与sgRNA具有足够强的特异性，所以使用软件MEGA-X对C57鼠、人的序列进行比对，并将sgRNA与一对引物的序列进行比对，可以发现引物F、R均能完美的与人的基因组序列匹配，与鼠的存在很大的差异，sgRNA甚至丧失了TTN的PAM位点，间隔体也没有匹配碱基，无法发生正常的反式切割，这证明引物、sgRNA特异性良好。
图7为“293T模拟真实样本环境灵敏度检测”的结果示意图，在该实验中，使用293T细胞基因组与C57鼠基因组按照拷贝数以一定比例混合，模拟鼠的血浆内的核酸比例，如图所示，该检测体系可以检测到反应体系中人基因组的拷贝数大约50-500个。
图8为“移植物Q2细胞基因组与小鼠基因组按比例混合后灵敏度检测”的结果示意图，在该实验中，使用移植物Q2细胞基因组与C57鼠基因组按照拷贝数以一定比例混合，模拟鼠的血浆内的核酸拷贝，如图所示，该检测体系可以检测到反应体系中人基因组的拷贝数大约20个。
图9为“真实血浆样本检测”的结果示意图，在该检测中，使用注射Q2细胞后的小鼠血浆作为样本，用上述方法进行检测，能够检出，说明274号小鼠的血浆中有拷贝的人基因组能被该检测方法所识别检出。
图10为“Q2基因组与C57小鼠基因组检测比例灵敏度分析”，在该检测中，Q2细胞的基因组作为样本，以小鼠基因组为背景，按照1:1、1:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000的比例混合的核酸作为样本用上述方法进行检测，证明该检测体系可以在小鼠的基因组背景下最好能检测到反应体系中Q2基因组的比例为1:1000。
图11为“Q2基因组与293T细胞系基因组检测比例灵敏度分析”，在该检测中，Q2细胞的基因组作为样本，以293T基因组为背景，按照1:1、1:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000的比例混合的核酸作为样本用上述方法进行检测，证明该检测体系可以在293T细胞系的基因组背景下最好能检测到反应体系中Q2基因组的比例为1:1000。
图12为“HLA位点真实血浆或血清临床样本检测”，在该检测中，以脑内注射Q2细胞系分化的神经细胞后3天、14天、24周、36周的病人血清或血浆作为样本，注射前的血清作为对照，提取样本中的全部核酸作为样本用上述方法进行检测，结果如图所示。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本申请的具体实施例。虽然附图中显示了本申请的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本申请而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。
需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
如本文所用，就特定组分而言“基本上不含”在本文中用于表示特定组分未被有目的地配制到组合物中和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此，由组合物的任何意外污染导致的特定组分的总量低于0.05％，优选低于0.01％。最优选的是其中特定组分的量用标准分析方法检测不到的组合物。
如在本说明书中所使用的，“一”或“一个”可以表示一个或多个。如权利要求中所使用的，当与单词“包含”一起使用时，单词“一”或“一个”可以表示一个或多于一个。
在权利要求中使用术语“或”用于表示“和/或”，除非明确指出仅指代替代方案或者替代方案是相互排斥的，尽管本公开内容支持仅指代替代方案和“和/或”的定义。如本文所用，“另一个”可以表示至少第二个或更多个。
贯穿本申请，术语“约”用于指示值包括装置的误差的固有变化，该方法用于测定该值或存在于研究对象之间的变化。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本申请生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
本申请涉及一种验证动物体内移植物是否存活的方法。
在一个具体实施方式中，提供了一种通过检测循环中的微量核酸验证动物体内移植物是否存活的方法，所述方法包括：a)从受移植生物体内抽取血样；b)通过核酸检测法检测所述血样中是否有移植物的特有基因的存在；c)通过所述血样中存在所述移植物特有基因的事实判断所述移植物是否存在于所述动物体内：若检测到所述移植物特有基因，则判断为该动物体内存在所述移植物；其中，所述动物体内移植物选自通过下组的一项或多项的移植物：脑移植、静脉注射移植、经鼻滴入移植、局部组织/器官/空腔注射移植、局部包埋/贴片移植。
在本说明书的上下文中，“循环”特指血液循环，即血液在心泵的作用下循一定方向在心脏和血管系统中周而复始地流动；其包括体循环和肺循环，两者互相联接，构成完整的循环系统。“移植”原意指将植物移动到其他地点种植，在医疗领域以及在本申请中，特指将生命体或生命体的部分转移至其他生物体，并使它们共同生存，典型的例子有器官移植，例如转移一个人的肝脏代替另一个人的肝脏，即为“肝移植”。在本文中，“核酸”是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的总称，是由许多核苷酸单体聚合成的生物大分子化合物；核酸由核苷酸组成，而核苷酸单体由五碳糖、磷酸基和含氮碱基组成。如果五碳糖是核糖，则形成的聚合物是RNA；如果五碳糖是脱氧核糖，则形成的聚合物是DNA。在本申请中，提供了一种通过检测循环中的微量核酸验证动物体内移植物是否存活的方法。
在又一具体实施方式中，所述核酸检测法的步骤为：
-扩增步骤：使用靶向移植物的特有基因的引物进行PCR反应扩增来自所述血样中的移植物核酸；
-催化/显色步骤：使用sgRNA与Cas12b和荧光探针检测血浆中是否存在来自移植物的特有基因的序列片段，其中所述Cas12b反式切割荧光探针会显示荧光，基于荧光检测的结果来确认所述血样中是否有移植物的特有基因的存在。
在本说明书的上下文中，Crispr-Cas系统是指原核生物的一种获得性免疫系统，用于抵抗存在于噬菌体或质粒的外源遗传元件的入侵；其为存在于大多数细菌与所有的古菌中的一种防御机制，以消灭外来的质体或者噬菌体的DNA。具体地在生物技术领域，Crispr-Cas系统被用作一种基因编辑工具，其中CAS是核酸内切酶，可以利用CRISPR序列中间隔序列(spacer)对应的RNA(通常称作sgRNA)指引，识别并且切割特定与其序列互补的DNA链。具体地在本申请中，Crispr-Cas系统被用作一种核酸检测工具；2018年，中国科学院动物研究所的李伟、周琪、滕飞等人申请了名为“核酸检测方法”的中国发明专利，在此文献中他们报道了一种基于CRISPR/Cas12b的检测体系并将其命名为“CDetection”；之后，又在进一步的文章发表中更为详尽地解释了这种核酸检测技术的工作原理，具体可见：CDetection:CRISPR-Cas12b-based DNA detection with sub-attomolar sensitivityand single-base specificity；Teng et al.Genome Biology(2019)。本申请所涉及的核酸检测技术即基于“CDetection”技术；该技术利用sgRNA对目标核酸序列进行识别，并利用探针和CAS蛋白的反式切割能力放出与目标核酸序列有定量关系的荧光信号。本申请的核酸检测法基于CDetection技术，其如上所述具体地包括扩增步骤和催化/显色步骤。
在一个具体实施方式中，所述移植物和受移植生物体都是哺乳动物来源的。优选地，所述哺乳动物是人类。
在一个具体实施方式中，所述移植物是人来源的，而受移植生物体是小鼠；所述特有基因为TBC1D8B、ADH1C(A)或者BCL11A；在本说明书的上下文中，TBC1D8B也可以称为TBC1domain family member 8B，该基因编码具有TBC(Tre-2/Bub2/CDC16)结构域的蛋白质；一些具有该结构域的哺乳动物蛋白已被证明通过与特定的Rab蛋白结合并影响其GTPase活性而起到Rab-GAP的作用；ADH1C(A)编码乙醇脱氢酶1C，其为酒精脱氢酶家族成员；该酶家族的成员代谢多种底物，包括乙醇、视黄醇、其他脂肪醇、羟基类固醇和脂质过氧化产物；BCL11A编码BAF染色质重塑复合亚基，其发挥白血病疾病基因的作用；在造血细胞分化过程中，该基因被下调；它可能与淋巴瘤发病机制有关，因为与B细胞恶性肿瘤相关的易位也解除了其表达的调节。上述三基因均为人特异的或者与小鼠同源基因差异较大的基因。
在又一具体实施方式中，所述移植物和受移植生物体均是人来源的，所述特有基因为移植物供者和受移植生物体的差异基因位点，所述特有基因优选为组织相容性复合体(MHC)基因中的白细胞表面抗原(HLA)基因位点。
在本说明书的上下文中，MHC是指某一染色体上的一群紧密连锁的基因群，它们编码的抗原决定着机体的组织相容性，且与免疫应答和免疫调节密切相关。人组织相容性抗原系统也称之为人类白细胞抗原系统(HLA Human Leucocyte Antigen)；它是人体生物学“身份证”，由父母遗传；能识别“自己”和“非己”，并通过免疫反应排除“非己”，从而保持个体完整性。因而，HLA通常能决定造血干细胞移植的成败，造血干细胞移植要求捐献者和接受移植者进行HLA配型。由于HLA的每个位点上都有许多等位基因，而且又均为共显性复等位基因，由此导致了HLA的多样性。本申请即利用HLA的多样性在同种异体移植中检测移植物特有的HLA位点，从而判断移植物的存活。
在一个具体实施方式中，所述F端引物选自SEQ ID NO.1、3、5、8、11中的任一项，最优选为SEQ ID NO.1；而R端引物选自SEQ ID NO.2、4、6、7、9、10中的任一项，最优选为SEQID NO.9。
在本说明书的上下文中，“引物”是指在核苷酸聚合作用起始时，刺激合成的，一种具有特定核苷酸序列的大分子，与反应物以氢键形式连接，这样的分子称为引物。引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与靶区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与靶区域另一端的另一条DNA模板链互补，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3'端开始合成新的核酸链。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链式反应、测序和探针合成等。在本申请中，引物被用于基于聚合酶链式反应的核酸扩增步骤。
在又一具体实施方式中，所述sgRNA的序列选自SEQ ID NO.13-17的任一项，最优选为SEQ ID NO.17。
在又一具体实施方式中，所述荧光探针的序列如SEQ ID NO.18号所示，具体为5'-FAM-TTTTTTT-BHQ1-3'。上述Cas蛋白在靶核酸存在的情况下会显现对荧光探针的反式切割活性。此处所使用的探针是一种双标记的水解探针，它是指一种寡核苷酸探针，其5'末端携带荧光基团，如FAM、TET、VIC、HEX等，3'端携带淬灭基团，如TAMRA、BHQ等。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；若酶促反应使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，就可以由荧光监测系统接收到荧光信号，且这种荧光信号可以和导致酶促反应激活的靶核酸建立定量关系。
在一个具体实施方式中，在扩增步骤使用等温扩增反应，孵育时间为至少15分钟，优选15至60分钟，温度为37至50℃。
在又一具体实施方式中，在催化/显色步骤所使用的反应时间为至少25分钟，优选25至120分钟，Cas酶浓度为20至200nM，荧光探针的初始浓度为150至1000nM。
实施例部分
基于CDetection技术的血样核酸检测步骤
按照以下顺序由血样制备待进行Cas酶催化反应的底物溶液，并使用适当的核酸检测法检测：
1.选取人多巴胺神经前体细胞2x105，脑立体定向注射到SCID小鼠大脑纹状体；
2.从接受细胞移植的动物取外周血，提取血样，血样进行核酸提取；
3.使用设计好的引物进行PCR反应扩增血样中的移植物核酸；
4.使用sgRNA与Cas12b和荧光探针底物检测血浆中序列片段。
对于其他(除脑移植物以外的)几种移植物的动物模型，使用下述步骤作为上面的步骤1(脑移植)的替代方案。
表1血样核酸检测中步骤1的替代方案
表2血样检测步骤中所用物料表
| 序号 | 仪器名称 | 供应商 |
| 1 | 实时荧光定量PCR仪 | ABI |
| 2 | 生物安全柜 | ThermoFisher |
| 3 | 迷你离心机 | DragonLAB |
| 4 | 迷你离心机 | DragonLAB |
| 5 | 干式恒温热台 | 杭州瑞诚仪器 |
| 6 | 冰箱 | 美菱 |
| 7 | 冰箱 | 美菱 |
| 8 | 移液枪 | ThermoFisher |
| 9 | 移液枪 | ThermoFisher |
| 10 | 移液枪 | ThermoFisher |
表3血样检测步骤中所用仪器设备表
使用QPCR仪检测荧光的实验步骤为：
(1)等温扩增25ul扩增体系，分别加入2ul模板(试剂盒纯化)；
(2)按照等温扩增PCR说明书加入引物、酶预混液、水；
(3)盖上盖子，颠倒混匀，顺时离心至管底进行39底敷育20min；
(4)取2ul产物于18ul检测体系中混匀；
(5)将20ul反应体系置于qPCR仪中，47，孵育30min，每1min检测一次FAM信号或通过酶标仪检测荧光信号。
使用“CDetection”方法检测样本中靶核酸是否存在的基本实验步骤为(引物筛选实验和sgRNA筛选实验也遵循此处的基本步骤，最后的实验结果都体现为荧光单位)：
第一步：核酸样本制备：所检测的核酸样本主要有两种：第一种方式-通过生物样本的核酸柱纯化提取所得到的核酸；第二种方式-经过PCR所得到的产物柱纯化后经Nanodrop定量得到；
第二步：核酸样本扩增：第一步的第一种方式所得核酸由于含量少长度长无法激活反式切割活性，所以需要经过高保真酶PCR，将待检测核酸指数放大后再进行后续步骤；
第三步：CRISPR反式切割检测：将第一步第二种方式所得到的PCR产物或者第二步所得的反应产物与CRISPR/Cas12b检测体系接触，然后在一定温度下进行孵育，同时检测荧光信号。
关于“CDetection”方法的最相关的现有技术文献为：
[1]Teng F,Guo L,Cui T,et al.CDetection:CRISPR-Cas12b-based DNAdetection with sub-attomolar sensitivity and single-base specificity.GenomeBiol,2019,20:132；
[2]Teng F,Cui T,Feng G,et al.Repurposing CRISPR-Cas12b for mammaliangenome engineering.Cell Discov,2018,4:63。
实施例1：sgRNA靶向位点筛选实验
位点筛选实验的目的是：在人特异或常表达的基因中筛选较好的基因位点，用于后续检测靶点。
位点筛选实验的设计是：通过高保真PCR，再经过PCR产物纯化，得到100bp长度的双链DNA片段，所得片段经Nanodrop测定浓度后换算成摩尔浓度，终浓度为2uM作为筛选的位点的靶点片段，在该片段处合成PAM为5'-TTN-3'的sgRNA(序列表中的SEQ ID NO.12)，37℃进行基于AaCas12b的CRISPR反式切割实验切割5'-FAM-TTTTTTT-BHQ1-3'探针(序列表中的SEQ ID NO.18)，180min后取终点信号值比较柱状图结果。
位点筛选实验的结论是：
TBC1D8B、ADH1C(A)和BCL11A位点具有较好信号值，其中TBC1D8B位点的荧光信号最强(如图1所示)。因此，下面的各个筛选实验都针对与TBC1D8B相对应的sgRNA和引物。
实施例2：荧光淬灭反应的理想底物浓度筛选实验
底物浓度筛选实验的目的是：与之前的文章检测其他位点灵敏度进行比较，证明检测的CRISPR系统组分正常。
底物浓度筛选实验的设计是：本筛选实验针对基因位点TBC1D8B；通过高保真PCR，使用合成的模板(序列表中的SEQ ID NO.19)和引物(序列表中的SEQ ID NO.20、21)，再经过PCR产物纯化，得到100bp长度的双链DNA片段(dsDNA)，所得片段经Nanodrop测定浓度后换算成摩尔浓度然后梯度稀释作为检测靶点片段浓度，36nM sgRNA终浓度，按照图2所示的比例稀释成相应的dsDNA浓度后，37℃进行基于AaCas12b的CRISPR反式切割实验切割5'-FAM-TTTTTTT-BHQ1-3'探针，于100min后取最佳信号值比较柱状图结果，未经等温扩增的AaCas12b-based CRISPR反式切割检测DNA片段可达2nM。
底物浓度筛选实验的结论如图2所示，所得到的检测灵敏度在纳摩尔级别，证明检测的CRISPR系统正常。
实施例3：引物筛选实验
引物筛选实验的目的是：通过引物筛选得到具有最强力扩增效率的引物，从而最大程度的得到检测的灵敏度。
引物筛选实验的设计是：通过位点的引物筛选，分别对F1-F5；R1-R6进行正交引物对筛选选出适用于等温PCR的引物，鼠基因组作为阴性对照，选取人293T基因组作为阳性模板，体系中基因组浓度为每个反应0.59ng(相当于200个拷贝)，经等温PCR后进行CRISPR反式切割检测，选择人293T基因组信号值提升最高倍数的引物引物筛选实验的结论是：
最终选择出效果最好的TBC1D8B位点引物F3、R5(序列表中的SEQ ID NO.1、9)(详见图3中颜色最深的格点)。在此，F端引物可以选自SEQ ID NO.1、3、5、8、11中的任一项，它们均可以正常工作；而R端引物可以选自SEQ ID NO.2、4、6、7、9、10中的任一项，它们均可以正常工作；但是，SEQ ID NO.1的SEQ ID NO.9的引物组合的效果最好。
实施例4：sgRNA特异性实验
sgRNA特异性实验的目的是：明确区分人的基因组与小鼠基因组的序列，将人的基因组从小鼠基因组中检测出来。
sgRNA特异性实验的设计是：基于位点(TBC1D8B)直接选择了一条效率较高的sgRNA(序列表中的SEQ ID NO.17)，用sgRNA分别检测人基因组和鼠基因组作为模板等温扩增的产物。
sgRNA特异性实验的结论是：该sgRNA并不能很好的区分两种物种的基因组，需要增强sgRNA的特异性(希望图4中的小鼠的ΔRn值更接近零)。
实施例5：通过sgRNA错配提高检测特异性
本实施例的目的/sgRNA错配的工作原理：当间隔区出现碱基的错配时，对于Cas酶的募集能力减弱或消失，从而降低甚至消除反式切割，从而实现靶序列与非靶序列的分离。
本实施例的实验设计是：为了进一步提高检测的准确性与特异性，所以要增大sgRNA对于鼠基因组的差异，于是对sgRNA间隔区(spacer)对sgRNA间隔区进行错配(mismatch)，用该sgRNA分别检测人基因组和鼠基因组作为模板扩增产物。
本实施例的结论是：tgRNA5(序列表中的SEQ ID NO.17)能很好的区分两种物种的基因组，产生最好的分离度。在此，sgRNA的序列可以选自SEQ ID NO.13-17的任一项，它们都可以正常工作，其中SEQ ID NO.17的效果最好。此处的实验结果可见于图5。
实施例6：序列分析人鼠靶向区域的靶标引物和sgRNA特异性
为了进一步验证引物与sgRNA具有足够强的特异性，所以使用软件MEGA-X对C57鼠，人的序列进行比对，并将sgRNA与一对引物的序列进行比对，可以发现引物F3、R5(序列表中的SEQ ID NO.1、9)均能完美地与人的基因组序列匹配，与鼠的存在很大的差异，sgRNA甚至丧失了TTN的PAM位点，间隔区也没有匹配碱基，无法发生正常的反式切割，证明引物、sgRNA(序列表中的SEQ ID NO.17)特异性良好。图6中框出的部分为表现最佳的各个引物以及sgRNA序列(即序列表中的SEQ ID NO.1、9、17)。
实施例7：293T模拟真实样本环境灵敏度检测
使用293T细胞基因组与C57鼠基因组按照拷贝数以一定比例混合，模拟鼠的血浆内的核酸比例，如图7所示，该检测体系可以检测到反应体系中人基因组的拷贝数大约50个。
实施例8：Q2细胞基因组与小鼠基因组按比例混合后灵敏度检测
使用Q2 ES细胞基因组与C57鼠基因组(5ng鼠基因组为背景)按照拷贝数以一定比例混合，模拟鼠的血浆内的核酸比例，先对样本进行PCR，随后取PCR产物辅以AaCas12bCRISPR反式切割，如图8所示，该检测体系可以检测到反应体系中人基因组的拷贝数大约20个。
实施例9：真实血浆样本检测
使用注射Q2细胞后的小鼠(另有未经历细胞移植的小鼠为阴性对照)血浆作为样本用上述方法进行检测能够检出274号小鼠的血浆中有拷贝的人基因组能被该检测方法所识别检出(图9)；可以看到，小鼠血浆检出值(荧光)高达6000单位。
实施例10：HLA位点区分Q2基因组与小鼠基因组或其他人细胞系基因组的比例分析
首先对Q2细胞系的HLA位点进行基因组分析，按照Q2基因组与人群中基因组数据库中70％差异的频率进行序列分析，根据计算分析得到HLA的待检测靶点6个，设计基于这6个位点设计了8条sgRNA(此处的序列是序列表中的第22、25、26、29、32、33、36、37号序列),经转录得到sgRNA，之后使用Q2细胞的基因组作为样本，以小鼠基因组或者293T基因组为背景，按照1:1、1:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000的比例作为样本用上述方法进行检测，PCR所用引物是序列表中的第23、24、27、28、30、31、34、35、38、39号序列。如图10所示，该检测体系可以在小鼠的基因组背景下最好能检测到反应体系中Q2基因组的比例为1:1000；如图11所示，在293T细胞系的基因组背景下最好能检测到反应体系中Q2基因组的比例为1:1000。除此以外，还使用注射Q2细胞后的病人血浆或血清作为样本用上述方法进行检测，检测结果如图12。
为了与实施例9对比，其他(除脑移植物以外的)几种移植物的动物模型的血样检测结果(荧光检出值)如下所示：
表4不同手术模型的血样核酸检测的检出值(荧光)
尽管以上结合附图对本申请的实施方案进行了描述，但本申请并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本申请权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本申请保护之列。
序列表
Claims (12)
1.一种通过检测循环中的微量核酸验证动物体内移植物是否存活的方法，所述方法包括：a)从受移植生物体内抽取血样；b)通过核酸检测法检测所述血样中是否有移植物的特有基因的存在；c)通过所述血样中存在所述移植物特有基因的事实判断所述移植物是否存在于所述动物体内：若检测到所述移植物特有基因，则判断为该动物体内存在所述移植物；其中，所述动物体内移植物选自通过下组的一项或多项的移植物：脑移植、静脉注射移植、经鼻滴入移植、局部组织/器官/空腔注射移植、局部包埋/贴片移植。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述核酸检测法的步骤为：
-核酸扩增步骤：使用靶向移植物的特有基因的引物进行PCR反应扩增来自所述血样中的移植物核酸；
-催化/显色步骤：使用sgRNA与Cas12b和荧光探针检测血浆中是否存在来自移植物的特有基因的序列片段，其中，在sgRNA结合靶核酸的情况下所述Cas12b会反式切割荧光探针从而显示荧光，基于荧光检测的结果来确认所述血样中是否有移植物的特有基因的存在。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述移植物和受移植生物体都是哺乳动物来源的。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述移植物是人来源的，而受移植生物体是小鼠；所述特有基因为TBC1D8B、ADH1C(A)或者BCL11A。
5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述移植物和受移植生物体均是人来源的，所述特有基因为移植物供者和受移植生物体的差异基因位点，所述特有基因优选为组织相容性复合体(MHC)基因中的白细胞表面抗原(HLA)位点。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，当所述基因是TBC1D8B时，所述F端引物选自SEQID NO.1、3、5、8、11中的任一项，最优选为SEQ ID NO.1；而R端引物选自SEQ ID NO.2、4、6、7、9、10中的任一项，最优选为SEQ ID NO.9。
7.根据权利要求4所述的方法，其中，当所述基因是TBC1D8B时，所述sgRNA的序列选自SEQ ID NO.13-17的任一项，最优选为SEQ ID NO.17。
8.根据权利要求4或5所述的方法，所述荧光探针的序列如SEQ ID NO.18号所示，具体为5'-FAM-TTTTTTT-BHQ1-3'。
9.根据权利要求5所述的方法，其中，所述F端引物选自SEQ ID NO.23、27、30、34、38中的任一项；而R端引物选自SEQ ID NO.24、28、31、35、39中的任一项。
10.根据权利要求5所述的方法，其中，所述sgRNA的序列选自SEQ ID NO.22、25、26、29、32、33、36、37中的任一项。
11.根据权利要求3所述的方法，其中，在扩增步骤使用等温扩增反应，孵育时间为至少15分钟，温度为37至50℃。
12.根据权利要求3所述的方法，其中，在催化/显色步骤所使用的反应时间为至少25分钟，Cas酶浓度为20至200nM，荧光探针的初始浓度为150至1000nM。
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