CN103757136B - 一种染色体整合的人疱疹病毒6型的pcr检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种染色体整合的人疱疹病毒6型的PCR检测试剂盒,包括DNA提取剂、PCR试剂管成分、阴性对照和阳性对照;本发明弥补了国内CI-HHV-6检测的空白,通过本试剂盒检测样品DNA于178bp处有无特异性扩增条带,便可判断样品细胞内是否感染染色体整合人疱疹病毒6型,操作简单,灵敏度高,特异性强。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因检测技术,特别是一种染色体整合的人疱疹病毒6型的PCR检测试剂盒。
背景技术
人疱疹病毒6型(Human Herpesvirus 6, 以下简称HHV-6),是一类嗜人淋巴细胞的双链DNA病毒,于1986年由美国癌症中心的Salahuddin等首先从淋巴增生及AIDS病人的外周血单个核细胞中分离得到,属于β疱疹病毒亚科。HHV-6在体内可感染多种细胞,但最敏感的是外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中的CD4+T细胞。HHV-6在人群中普遍感染,血清HHV-6 IgG抗体阳性检出率很高。原发感染大都在婴儿期,是引起婴幼儿急疹(exanthem subitum, ES)的病原,随后潜伏并持续存在于宿主体内,不引起临床症状。当人体受到各种非特异性刺激、机体抵抗力减弱、免疫功能低下时,容易发生HHV-6的再激活或外源性再感染。临床研究表明HHV-6与多发性硬化症(MS)等中枢神经系统疾病相关;它是骨髓移植、器官移植等免疫抑制患者中的主要致病性病原,也是引起严重移植物被排斥的重要病因;HHV-6在HIV感染后发展成AIDS过程中起促进作用;此外,HHV-6也是一肿瘤相关病毒,其DR7基因具有转化能力,发现其与人类多种肿瘤如淋巴瘤、白血病、口腔癌等有关。
HHV-6与其他疱疹病毒一样,病毒颗粒呈球形,有包膜,平均直径约为150纳米(nm)。基因组为线状双链DNA。其核衣壳与包膜之间为基质蛋白组成的皮层(Tegument),它是人类疱疹病毒家族中唯一可以整合到人类染色体末端的病毒,在此情况下HHV-6的完整基因组可以整合到人类染色体的端粒末端,称为染色体整合的人疱疹病毒6型(Chromosomally integrated HHV-6,以下简称CI-HHV-6)。国外研究表明,健康人群中HHV-6的整合率为1%左右,在脑炎患者中整合率为3% ,并且整合的HHV-6可以游离下来,引起HHV-6的再激活。因此检测人群中CI-HHV-6的发生率,以及CI-HHV-6与HHV-6相关疾病的发生是否有相关性显得尤为重要。
在感染CI-HHV-6个体中,每个有核细胞都稳定整合一份HHV-6完整基因组,并以50%的概率稳定传给后代。在人群中,潜伏感染的非染色体整合形式的HHV-6病毒在全血中含量很低,通常利用巣式PCR在人外周血中检测HHV-6 DNA,但巣式PCR检测灵敏度极高,极易受空气中微量的气溶胶的污染,导致检测结果假阳性;CI-HHV-6可通过染色体荧光原位杂交(fluorescence in 1 situ hybridization ,FISH)检测,但FISH技术首先需要培养人外周血细胞,制备人类中期染色体,合成HHV-6特异性荧光探针,并进行杂交后洗脱,检测周期长,假阳性高;另外CI-HHV-6也可通过荧光定量PCR(以下简称Q-PCR)检测,但Q-PCR检测需要特异的引物、探针和Q-PCR酶,并且需要专门的荧光定量PCR仪,检测成本比较高,不利于大规模人群普查重复使用。
发明内容
针对目前CI-HHV-6检测存在的不足,提供一种操作简单,灵敏度高,可用于CI-HHV-6快速诊断与流行病学调查的试剂盒,本发明是这样实现的:
一种染色体整合的人疱疹病毒6型的PCR检测试剂盒,其特征在于,包括:
A)DNA提取剂:红细胞裂解液、Proteinase K溶液、DNA抽提液、NaAc、无水乙醇、体积比为75%乙醇、 TE缓冲液;其中,所述红细胞裂解液配方为139.6 mmol/L NH4Cl溶液中加入16.96 mmol/L Tris-HCl;DNA抽提液为体积比为25:24:1的苯酚、氯仿和异戊醇;TE缓冲液配方为10mmol/L Tris-HCl溶液中加入1mmol/L EDTA;
B)PCR试剂管成分:2×Taq Master Mix 15μl、ddH2O 11μl、1.0μl浓度为10μM的引物SEQ ID No.1 以及1.0μl浓度为10μM的引物SEQ ID No.2 ;
其中SEQ ID No.1:5' -GTTGACGGTGGAAGCCTTTTTA -3';
SEQ ID No.2:5'- TTTAGCGGGGACCATGTAGTTG -3';
C)阴性对照:已灭菌的双蒸水;
D)阳性对照:人疱疹病毒6型标准株GS DNA 。
本发明弥补了国内CI-HHV-6检测的空白,在涉及CI-HHV-6特异性引物的基础上研制成的简单、快速检测CI-HHV-6的试剂盒,通过本试剂盒检测样品DNA于178bp 处有无特异性扩增条带,便可判断样品细胞内是否存在染色体整合人疱疹病毒6型,2小时即可出结果,操作简单,灵敏度高,特异性强。
附图说明
图1 为25-36号样品PCR检测电泳图。
图2 为380-392号样品PCR检测电泳图。
图3 为467-480号样品PCR检测电泳图。
图4 为HHV-6 U22标准品的PCR电泳图。
图5 为 pMD19T-U22重组质粒的双酶切鉴定电泳图。
图6为Q-PCR 标准曲线。
图7 为467-480号样品Q-PCR检测结果。
具体实施方式
实施例1 人外周血CI-HHV-6检测
(1)样品DNA提取:红细胞裂解液、Proteinase K溶液(南京凯基生物科技发展有限公司)、DNA抽提液、NaAc、无水乙醇、体积比为75%乙醇、 TE缓冲液;其中,所述红细胞裂解液配方为139.6 mmol/L NH4Cl溶液中加入16.96 mmol/L Tris-HCl;DNA抽提液为体积比为25:24:1的苯酚、氯仿和异戊醇的混合液;TE缓冲液配方为10mmol/L Tris-HCl溶液中加入1mmol/L EDTA。;
(2)PCR试剂管成分:2×Taq Master Mix 15μl,ddH2O 11μl,1.0μl浓度为10μM的引物SEQ ID No.1 ,1.0μl浓度为10μM的引物SEQ ID No.2 ;
SEQ ID No.1:5' -GTTGACGGTGGAAGCCTTTTTA -3';
SEQ ID No.2:5' -TTTAGCGGGGACCATGTAGTTG -3'。
(3)阴性对照:已灭菌的双蒸水;
(4)阳性对照:HHV-6标准株GS DNA;
按照以下的程序进行检测:
(1)样品DNA提取:收集500份人外周血,各取1ml血液样品加入2ml的红细胞裂解液,颠倒混匀,10,000 rpm离心1 min,吸去上清,在沉淀中加入20μl Proteinase K溶液, 55℃水浴1h;加等体积的DNA抽提液,颠倒混匀后12000rpm离心10min,再加入等体积DNA抽提液,12000rpm离心10min后再加入1/10体积2.5 mM NaAc和2倍体积无水乙醇,颠倒混匀,-20℃沉淀过夜。4℃,12000rpm离心10min,弃上清,加体积比为75%乙醇1ml/管,4℃,12000rpm离心10min,弃上清,室温晾干,沉淀即为DNA,加100μl TE溶解,获得与500份人外周血对应的DNA提取液,它们的编号分别为1-500;
(2)PCR扩增,在PCR试剂管内加入DNA提取液2.0μl,置于PCR仪中(美国PE公司MJ-PTC-100)进行扩增:94℃预变性5 min;94℃ 45s,55℃ 45s,72℃ 45s, 循环30次, 72℃ 延伸8 min;同时设立阳性对照和阴性对照,阳性对照中在PCR试剂管内加入HHV-6标准株GS DNA(香港大学吴文翰教授赠予),阴性对照中在PCR试剂管内加入灭菌的ddH2O 2μl;
(3)PCR扩增产物分析,取8μl的扩增产物,置于浓度为1%的琼脂糖凝胶溶液中,100V下电泳20min后在体积比为5%的溴化乙锭溶液中染色,在紫外灯下观测结果。
图1、图2、图3分别对应500份样品中出现特异性条带样品的检测电泳图,其中M泳道为DNA标准值,P泳道为阳性对照,N泳道为阴性对照,其中,28、36、392、479号泳道在178bp 处有特异性扩增条带,则认为该四个泳道对应的样品细胞内存在染色体整合人疱疹病毒6型。
实施例2 Q-PCR法对467-480号样品进行染色体整合人疱疹病毒6型检测对照
实施例涉及的引物序列:
SEQ ID No.3:5'–CGCTCGGAAAGGAAACATTA–3'
SEQ ID No.4: 5 '–AAGTGGAACTGCTTGGTGGC–3'
引物序列构建参考“人类疱疹病毒6A 对神经细胞的嗜性及细胞周期的影响”郭丹丹等,南京医科大学学报,2011年7月。
(1)重组标准质粒pMD19T-U22的构建
以HHV-6标准株GS DNA 为模板(香港大学吴文翰教授赠予)以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4为引物,进行PCR扩增反应,获得PCR扩增产物。
PCR反应体系:2×Taq Master Mix (北京百泰克生物技术有限公司生产) 15μl, 1.0μl浓度为10μM的SEQ ID No.3,1.0μl浓度为10μM的SEQ ID No.4 ,样品DNA2.0μl,ddH2O 11μl。
PCR反应条件:94℃预变性5 min;94℃ 45s,55℃ 45s,72℃ 45s, 循环30次, 72℃ 延伸8 min。
对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,称取0.5 g琼脂糖于烧瓶中,加入50 ml TAE,微波炉中加热至完全溶解,冷却至60℃时加入EB 2.5μl,混匀,充槽,室温冷却30min后, 加10μl PCR产物进行电泳。如图4所示,HHV-6 DNA中U22基因在194bp中存在特异性扩增条带,其中1泳道是HHV-6 U22 PCR片段,M泳道是DNA标准品D2000,参照胶回收试剂盒(Agarose GeL DNA Extraction Kit ver. 3,0, TaKaRa)回收目的片段。
U22基因片段与克隆载体pMD19-T(购自TaKaRa)连接,连接反应体系:2× ligation buffer 5.0μl,pMD19-T 载体 0.5μl,U22 PCR产物 2μl ,ddH2O 2.5μl。 16℃连接30min,连接产物转化DH5α感受态细菌(购自TIANGEN公司)。转化的质粒在DH5α中大量扩增,提取质粒DNA,溶于100μlTE中用于后续实验。带有U22基因的克隆载体命名为pMD19T-U22。对连接产物pMD19T-U22进行双酶切鉴定。双酶切鉴定体系:10×K Buffer 2.0μl,pMD19T -U22,5.0μl,EcoRⅠ1.0μl,HindⅢ 1.0μl, ddH2O 11μl,37℃酶切2h后进行1%的琼脂糖凝胶电泳,电泳结果如图5所示,其中M泳道是DNA标准品DL5000,1泳道是pMD19T-U22双酶切结果,从电泳结果可见大、小2条带,分别符合酶切后质粒载体pMD19T (2692bp)和目的片断U22的长度(194bp),说明U22基因片断已连接到pMD19-T载体上,重组标准质粒pMD19T-U22构建成功。
其中EcoRⅠ和HindⅢ购自TaKaRa公司。
(2) 建立Q-PCR标准曲线
用分光光度计测定pMD19T-U22重组质粒的浓度,根据质粒的分子量与质粒浓度,计算拷贝数,制得标准品,换算公式:
质粒拷贝浓度(copy/μl ):C=(质粒浓度×6.02×1023 )/质粒分子量(MW)。
将标准品按10倍梯度稀释成10-1-10-6,以浓度梯度标准品为模板,以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4为引物分别进行Q-PCR扩增,建立反映Ct值与质粒浓度对应关系的定量标准曲线;同时以灭菌水代替DNA模版,进行阴性对照。
Q-PCR反应体系:
SYBR Green Realtime PCR Master mix 10.0 μl;
0.8μl浓度为10μM的SEQ ID No.3 ;
0.8μl浓度为10μM的SEQ ID No.4 ;
标准品DNA模板2.0μl;
6.4μl的ddH2O;
Q-PCR扩增程序:Stage 1: 预变性 95℃ 30s;Stage 2 :循环反应:95℃ 5s,60℃ 34s,40个循环;Stage 3溶解曲线95℃ 15s, 60℃ 60s, 95℃ 15s。
读取Ct值,进行记录分析,以起始浓度拷贝数的log值为横坐标,以Ct值为纵坐标,y=-3.0783x+50.387,R2=0.9965,绘制标准曲线,如图6所示。
(3) 对实施例1中467-480号样品用Q-PCR方法检测,与实施例1进行对照
A)样品DNA提取,取实施例1中467-480号样品的DNA提取液;
B)以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4为引物,进行Q-PCR检测:
Q-PCR反应体系:
SYBR Green Realtime PCR Master mix 10.0 μl,
0.8μl浓度为10μM的SEQ ID No.3,
0.8μl浓度为10μM的SEQ ID No.4,
样品DNA2.0μl,
6.4μl的ddH2O ;
Q-PCR扩增程序: Stage 1: 预变性 95℃30s;Stage 2 :循环反应:95℃ 5s,60℃ 34s,40个循环;Stage 3溶解曲线95℃ 15s, 60℃ 60s, 95℃ 15s。
467-480号样品Q-PCR反应结果如图7所示,测得479号样品HHV-6全血拷贝数为5.3×106/ml,鉴于每毫升人全血中总细胞的数目大约在5×106至1×107之间,CI-HHV-6的个体每个细胞中都含有一份HHV-6基因组,则其对应的样品细胞内存在染色体整合人疱疹病毒6型,与实施例1中的检测结果一致。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京医科大学
<120> 一种染色体整合的人疱疹病毒6型的PCR检测试剂盒
<130> 4
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gttgacggtg gaagcctttt ta 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
tttagcgggg accatgtagt tg 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
cgctcggaaa ggaaacatta 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
aagtggaact gcttggtggc 20
Claims (2)
1.一种染色体整合的人疱疹病毒6型的PCR检测试剂盒,其特征在于,包括:
A)DNA提取剂:红细胞裂解液、Proteinase K溶液、DNA抽提液、NaAc、无水乙醇、75%乙醇、 TE缓冲液;
B)PCR试剂管成分:2×Taq Master Mix 15μl、ddH2O 11μl、1.0μl浓度为10μM的引物SEQ ID No.1 以及1.0μl浓度为10μM的引物SEQ ID No.2 ;
C)阴性对照:已灭菌的双蒸水;
D)阳性对照:人疱疹病毒6型标准株GS DNA 。
2.根据权利要求1所述的染色体整合的人疱疹病毒6型的PCR检测试剂盒,其特征在于,所述DNA抽提液为苯酚、氯仿和异戊醇以体积比25:24:1混合而成。
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