CN110499394A - 检测非洲猪瘟病毒的lamp引物组、试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测非洲猪瘟病毒的LAMP引物组，由外引物F3和外引物B3、内引物FIP和内引物BIP组成；基于LAMP引物组的试剂盒，包括检测非洲猪瘟病毒的LAMP引物组、免提取核酸扩增反应液和LAMP法鉴定反应液；基于LAMP引物组检测非洲猪瘟病毒的方法，利用外引物F3和B3对样品粗提液进行免提取扩增得到模板DNA，再利用内引物FIP和BIP进行恒温扩增，再加入LAMP法鉴定反应液观察结果；本发明结合免提取核酸扩增技术与环介导等温扩增技术，在无需PCR仪、提取DNA的前提下，利用待测动物组织或器官研磨或其唾液或尿液等物质进行免提取操作获得模板，再恒温水浴扩增后目视判断，简便快捷。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及检测非洲猪瘟病毒的LAMP引物组，本发明还涉及上述非洲猪瘟病毒的试剂盒，以及上述非洲猪瘟病毒的检测方法。
背景技术
非洲猪瘟(African Swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine fevervirus，ASFV)感染家猪和各种野猪(非洲野猪、欧洲野猪等)引起一种急性、出血性、烈性传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，该病也是我国重点防范的一类动物疫情。其特征是发病过程短，最急性和急性感染死亡率高达100％。非洲猪瘟病毒是非洲猪瘟科非洲猪瘟病毒属的重要成员，病毒有些特性类似虹彩病毒科和痘病毒科。病毒粒子的直径为175-215纳米，呈20面体对称，有囊膜。基因组为双股线状DNA，大小为170-190kb。在猪体内，非洲猪瘟病毒可在几种类型的细胞浆中，尤其是网状内皮细胞和单核巨噬细胞中复制。该病毒可在钝缘蜱中增殖，并使其成为主要的传播媒介。本病毒能从被感染猪之血液、组织液、内脏，及其他排泄物中证实出来，低温暗室内存在血液中之病毒可生存六年，室温中可活数周，可见其危害严重性。加热被病毒感染的血液55℃下30min或60℃下10min，病毒将被破坏，许多脂溶剂和消毒剂可以将其破坏。
疫病防控一直是猪场管理的重要环节，一旦出现缺位，将会导致严重后果，特别是在非洲猪瘟疫情高压下，疫病防控的好坏直接决定猪场的存亡。而疫病防控工作的到位、生物安全是否存在漏洞、发病猪场恢复的生产依据均来自于对非洲猪瘟病毒的检测。各级畜牧兽医部门要将非洲猪瘟疫情排查作为当前防控工作的重要内容，鼓励规模猪场、种猪场配置检测仪器设备，规范使用经我部批准或经中国动物疫病预防控制中心比对符合要求的检测方法，自行开展非洲猪瘟检测，提高排查工作的针对性和有效性。
免提取核酸扩增技术，是在无需提取待测动物DNA的前提下，直接利用其组织或器官研磨呈匀浆状或其唾液或尿液等物质，加入免提取核酸扩增反应液直接进行核酸扩增，但其扩增需要PCR仪来完成，涉及到PCR仪，该仪器价格国产和进口价格不一，便宜的2～3万，贵的20多万，且PCR 方法操作起来较复杂，对仪器和人员要求比较高，不适合基层或现场快速诊断，因此在国内的推广速度并不是很快。
环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是 2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件反应一定时间，即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。LAMP是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR，现己广泛应用于各个领域，如食品、环境、临床、工农业及畜牧业，但需要提取待测动物DNA作为模板，加大的材料准备的难度。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测非洲猪瘟病毒的LAMP引物组，通过设计该引物组能够建立一种面提取LAMP可视化检测技术，实现对非洲猪瘟病毒的检测。
本发明的另一目的是提供一种基于LAMP引物组检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，能够快速、简便的进行扩增，用于病毒检测。
本发明的第三个目的是提供一种基于LAMP引物组检测非洲猪瘟病毒的方法，解决了现有检测方法中对仪器设备和技术人员的依赖性强且需要提取待测动物DNA作为模板的问题。
本发明所采用的技术方案是，一种检测非洲猪瘟病毒的LAMP引物组，该LAMP引物组由外引物F3和外引物B3、内引物FIP和内引物BIP组成；
外引物F3的核苷酸序列为：
5’-GGTACACACGATGAAGCATAA-3’；
外引物B3的核苷酸序列为：
5’-CGTTTTTACCTATGATATGTGAACA-3’；
内引物FIP的核苷酸序列为：
5’-GGCTAAAGATTTCTTCCCCTTGCGACTCATGAACTTTATCTATGA TCG-3’；
内引物BIP的核苷酸序列为：
5’-TGCAATCCATCATGCACCAAAAGGCTTTTGAATCGTATCG-3’。
本发明所采用的另一技术方案是，一种基于LAMP引物组检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，包括检测非洲猪瘟病毒的LAMP引物组、免提取核酸扩增反应液和LAMP法鉴定反应液。
本发明的特点还在于，
非洲猪瘟病毒的LAMP引物组中外引物F3、外引物B3、内引物FIP和内引物BIP的浓度均为10μM。
免提取核酸扩增反应液包括：2×MightAmp Buffer Ver.3的体积为6.25μl，外引物F3的体积为0.376μl，外引物B3的体积为0.374μl，MightAmp DNA Polymerase Ver.3的体积为0.25μl，浓度为1.25U/μl，无菌水的体积为3.75μl；
2×MightAmp Buffer Ver.3中Mg2+浓度是4mM(2×)，dNTP浓度是600 μM(2×)。
LAMP法鉴定反应液为LAMP法普通鉴定反应液或LAMP法钙黄绿素荧光鉴定反应液或LAMP法羟基萘酚蓝鉴定反应液或LAMP法PicoGreen 荧光鉴定反应液或LAMP法SYBRGreen I荧光鉴定反应液中的一种；
LAMP法普通鉴定反应液，包括：无菌水的体积为4μl，MnCl2溶液的体积为2μl、终浓度为5mM，10×Bsm Buffer的体积为2.5μl，dNTPs mix的体积为1μl、浓度为10mM each，内引物FIP的体积为1μl，内引物BIP的体积为1μl，Bsm DNA Polymerase的体积为1μl，浓度为8U/μl；
LAMP法钙黄绿素荧光鉴定反应液，包括：钙黄绿素的体积为2.5μl、终浓度为0.25mM，MnCl2溶液的体积为2μl、浓度为5mM，10×Bsm Buffer 的体积为2.5μl，dNTPs mix的体积为1μl、浓度为10mM each，内引物FIP 的体积为1μl，内引物BIP的体积为1μl，BsmDNA Polymerase的体积为1μl，浓度为8U/μl，无菌水的体积为1.5μl；
LAMP法羟基萘酚蓝鉴定反应液，包括：羟基萘酚蓝的体积为2.5μl、 MnCl2溶液的体积为2μl、终浓度为5mM，10×Bsm Buffer的体积为2.5μl， dNTPs mix的体积为1μl、浓度为10mM each，内引物FIP的体积为1μl，内引物BIP的体积为1μl，Bsm DNA Polymerase的体积为1μl，浓度为8U/μl，无菌水的体积为1.5μl；
LAMP法PicoGreen荧光鉴定反应液，包括：PicoGreen的体积为2.5μl， MnCl2溶液的体积为2μl、终浓度为5mM，10×Bsm Buffer的体积为2.5μl， dNTPs mix的体积为1μl、浓度为10mM each，内引物FIP的体积为1μl，内引物BIP的体积为1μl，Bsm DNA Polymerase的体积为1μl，浓度为8U/μl，无菌水的体积为1.5μl；
LAMP法SYBR Green I荧光鉴定反应液，包括MnCl2溶液的体积为2μl、终浓度为5mM，10×Bsm Buffer的体积为2.5μl，dNTPs mix的体积为1μl、浓度为10mM each，内引物FIP的体积为1μl，内引物BIP的体积为1μl，Bsm DNA Polymerase的体积为1μl，浓度为8U/μl，无菌水的体积为4μl。
还包括阳性对照品和阴性对照品，阳性对照品为携带检测序列的质粒进行普通PCR得到的核苷酸序列，阴性对照品为无菌水或健康无病毒生猪血清。
本发明所采用的第三种技术方案是，一种基于LAMP引物组检测非洲猪瘟病毒的方法，利用外引物F3和外引物B3对样品粗提液进行免提取扩增得到模板DNA，再利用内引物FIP和内引物BIP进行恒温扩增，再加入LAMP 法鉴定反应液观察结果，具体按照以下步骤实施：
步骤1，采集待测个体的组织样品，组织样品包括尾、耳、脏器及脑，其中尾≤1mm，耳≤1.5mm2，脏器及脑≤1.5mm3，加入200μl溶液A在已灭菌的研钵中进行研磨，待组织样品呈匀浆状，用已灭菌离心管吸取进行保存，再加入100μl溶液A洗涤研钵，得到洗涤液，将洗涤液加入离心管中，得到样品粗提液；
步骤2，取步骤1得到的样品粗提液1μl加入无酶PCR管中，再加入免提取核酸扩增反应液，混匀，得到混合液，将混合液放入98℃水浴锅中水浴 2min；
其中免提取核酸扩增反应液包括：2×MightAmp Buffer Ver.3的体积为 6.25μl，外引物F3的体积为0.376μl，外引物B3的体积为0.374μl，MightAmp DNA Polymerase Ver.3的体积为0.25μl，浓度为1.25U/μl，无菌水的体积为 3.75μl；
2×MightAmp Buffer Ver.3中Mg2+浓度是4mM，dNTP浓度是600μM；
步骤3，将经步骤2处理的混合液依次放入98℃水浴锅中水浴30s，60℃水浴锅中水浴30s，放入68℃水浴锅中水浴60s，重复此过程3～5次；
步骤4，将经步骤3处理的混合液放入65℃水浴锅中水浴12min；
步骤5，将经步骤4处理的混合液加入LAMP法鉴定反应液，放入60℃水浴锅中水浴2h 30min后观察反应液颜色，判断是否含非洲猪瘟病毒；
其中LAMP法鉴定反应液采用LAMP法普通鉴定反应液或LAMP法钙黄绿素荧光鉴定反应液或LAMP法羟基萘酚蓝鉴定反应液或LAMP法 PicoGreen荧光鉴定反应液中的一种。
本发明的特点还在于，
步骤5中，LAMP法鉴定反应液采用LAMP法普通鉴定反应液，若反应液呈无色透明，则无非洲猪瘟病毒；若反应液出现白色浑浊，则存在非洲猪瘟病毒；
LAMP法鉴定反应液采用LAMP法钙黄绿素荧光鉴定反应液，若反应液呈橙色，则无非洲猪瘟病毒；若反应液发出黄绿色荧光，则存在非洲猪瘟病毒；
LAMP法鉴定反应液采用LAMP法羟基萘酚蓝鉴定反应液，若反应液呈紫罗兰色，则无非洲猪瘟病毒；若反应液变为天蓝色，则存在非洲猪瘟病毒；
LAMP法鉴定反应液采用LAMP法PicoGreen荧光鉴定反应液，若反应液呈橙色，则无非洲猪瘟病毒；若反应液出现黄绿色荧光，则存在非洲猪瘟病毒。
本发明所采用的第四种技术方案是，一种基于LAMP引物组检测非洲猪瘟病毒的方法，利用外引物F3和外引物B3对样品粗提液进行免提取扩增得到模板DNA，再利用内引物FIP和内引物BIP进行恒温扩增，再加入LAMP 法SYBR Green I荧光鉴定反应液观察结果，具体按照以下步骤实施：
步骤1，采集待测个体的组织样品，组织样品包括尾、耳、脏器及脑，其中尾≤1mm，耳≤1.5mm2，脏器及脑≤1.5mm3，加入200μl溶液A在已灭菌的研钵中进行研磨，待组织样品呈匀浆状，用已灭菌离心管吸取进行保存，再加入100μl溶液A洗涤研钵，得到洗涤液，将洗涤液加入离心管中，得到样品粗提液；
步骤2，取步骤1得到的样品粗提液1μl加入无酶PCR管中，再加入免提取核酸扩增反应液，混匀，得到混合液，将混合液放入98℃水浴锅中水浴 2min；
其中免提取核酸扩增反应液包括：2×MightAmp Buffer Ver.3的体积为 6.25μl，外引物F3的体积为0.376μl，外引物B3的体积为0.374μl，MightAmp DNA Polymerase Ver.3的体积为0.25μl，浓度为1.25U/μl，无菌水的体积为 3.75μl；
2×MightAmp Buffer Ver.3中Mg2+浓度是4mM，dNTP浓度是600μM；
步骤3，将经步骤2处理的混合液依次放入98℃水浴锅中水浴30s，60℃水浴锅中水浴30s，放入68℃水浴锅中水浴60s，重复此过程3～5次；
步骤4，将经步骤3处理的混合液放入65℃水浴锅中水浴12min后加入 LAMP法鉴定反应液，再放入60℃水浴锅中水浴2h 30min；
步骤5，将经步骤4处理的混合液加入2.5μl SYBR Green I后观察反应液颜色，若反应液的呈橙色，则无非洲猪瘟病毒；若反应液出现黄绿色荧光，则存在非洲猪瘟病毒。
本发明的特点还在于，
溶液A的组分为：终浓度为50mM的葡萄糖，终浓度为10mM的EDTA，终浓度为25mM的Tris-HCl，溶液A的pH＝8.0。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明基于LAMP引物组检测非洲猪瘟病毒的试剂盒中的引物组对MK333180.1基因扩增得到保守基因片段224bp，用于非洲猪瘟病毒的检测，本发明一种基于LAMP引物组检测非洲猪瘟病毒的方法，采用试剂盒结合免提取核酸扩增技术与环介导等温扩增技术，在无需PCR仪、无需提取待测动物DNA的前提下，可直接利用待测动物组织或器官研磨呈匀浆状或其唾液或尿液等物质进行免提取操作获得模板，接着恒温水浴扩增后目视判断，简便快捷，对仪器设备和人员要求低，克服了病毒检测对仪器设备和技术性人员依赖性较强的局限性，适合基层快速诊断。
附图说明
图1为本发明一种基于LAMP引物组检测非洲猪瘟病毒的方法中面提取扩增后所得的DNA模板图；
图2为为本发明一种基于LAMP引物组检测非洲猪瘟病毒的方法中检测结果与原始序列比较图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明中所涉及的材料为：
非洲猪瘟病毒MK333180.1基因通过在NCBI数据库中查找2019年所发布中国地区所感染的非洲猪瘟病毒基因，且通过保守性比对筛选得到(登录号：QBH90507.1)，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示：
SEQ ID NO：1
>MK333180.1:27747-29342African swine fever virus isolate Pig/HLJ/2018, complete genome
ATGTTCTCTCTCCAGAACTTATGTCGAAAAACATTACCTAACCGTAAACTTCCT GAATTTTTTGACGAATATATATTACAACTGCTGGGATTATACTGGGAAAACCATGGAA CTATTCAACGAGCAGGAAACAACTGTGTGCTTATACAGCAACATACCCTCATTCCCG TAAATGAAGCCCTGAGAACAGCAGCATCTGAAGAAAATTATGAGATCGTGAGCCTT TTATTAGCGTGGGAGGGGAACCTTTACTATGCTATTATAGGGGCTCTAGAGGGCAAC CGCCACGACTTAATTCGTAAATATGATGACCAAATCAAGGACCATCATGAAATTCTG CCATTCATTGACGATCCAGTCATATTTCACAAATGCCATATCATGCGGCAATGCTTTT TTGATTGTATTTTATATCAAGCTGTAAAATATAGTAAGTTTCGCGTTCTTCTTTACTTT AAACATAGATTAGAGGATGATTTGCCCTTCACTCATTTACTTATTGAAAAGGCATGTA AAGATCATAATTATGAAGTTATTAAATGGATATATGAAAACCTACATATCTACAATATG ATAGATACCTTTGAATGTGCTATTGCCCATAAGGATCTACATCTATATTGTTTGGGGTA TAGATTTATATATAACAGAATCGTACCCGATAAGTATCATCATTTAGATATTCGCATGC TTTCAAGCCTACAACTCCTACATAAGGTGGCAGCCAAAGGATACTTAGATTTTATCCT AGAAACCTTAAAGTATGATCATAATAAAGATAATATAAATATTATTCTAACACAAGCT GCAACCTATAACCATAGAAAAATTTTAATCTATTTCATTCCTCAATCAACCCACGCAC AGATAGAACAATGTTTACTAGTGGCGATAAAAGCAAAATCTTCCAGGAAAACCTTG AACTTACTACTGTCTCACCTAAACCTTTCCATCAACCTCATCAAAAAAATAAGCCATT ATGTTGCCACTTACAATTCAACAAATATAATAGGCATTCTGAGTATGCGGCGGAAAA AGAAGATATATTTAGATATCATATTGACAAAATTTGTAAAAAAAGCTATTTTTAATAA GTTTGTCGTTCGATGTATGGATACATTTTCTATAAACCCGGAAAGAATCCTTAAAATA GCCGCGCGAATAAATAGGATGATGTTAGTGAAAAAAATATCTGAACATGTTTGGAAA AATCATGCGGTTAGACTTAAATACCTTAAACATGCGGTACACACGATGAAGCATAAA GATGGGAAAAATAGACTCATGAACTTTATCTATGATCGCTGTTATTACCATATGCAAG GGGAAGAAATCTTTAGCCTCGCAAGATTTTATGCAATCCATCATGCACCAAAGTTGT TTGACGTTTTTTATGATTGTTGTATCCTAGATACGATACGATTCAAAAGCCTTCTTTTA GATTGTTCACATATCATAGGTAAAAACGCTCATGATGCTACCAATATCAACATCGTGA ACAAGTATATCGGCAACCTGTTTGTTATGGGAGTTCTTAGCAAAAAAGAAATCTTAC AGGACTATCCATCCATTTATTCTAAACAATACATGCCTTAG(同SEQ ID NO：1)
2×MightAmp Buffer Ver.3购买于TaKaRa公司；MightAmp DNA PolymeraseVer.3购买于TaKaRa公司；10×Bsm Buffer购买于赛默飞公司； dNTPs mix购买于北京索莱宝公司；Bsm DNA Polymerase购买于赛默飞公司。
本发明一种检测非洲猪瘟病毒的LAMP引物组，该LAMP引物组由外引物F3和外引物B3、内引物FIP和内引物BIP组成；
所述外引物F3的核苷酸序列为：
5’-GGTACACACGATGAAGCATAA-3’(同SEQ ID NO：3)；
所述外引物B3的核苷酸序列为：
5’-CGTTTTTACCTATGATATGTGAACA-3’同SEQ ID NO：4)；
所述内引物FIP的核苷酸序列为：
5’-GGCTAAAGATTTCTTCCCCTTGCGACTCATGAACTTTATCTATGA TCG-3’(同SEQ ID NO：5)；
所述内引物BIP的核苷酸序列为：
5’-TGCAATCCATCATGCACCAAAAGGCTTTTGAATCGTATCG-3’(同SEQ ID NO：6)。
一种基于LAMP引物组检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，包括上述检测非洲猪瘟病毒的LAMP引物组、免提取核酸扩增反应液和LAMP法鉴定反应液；
其中，非洲猪瘟病毒的LAMP引物组中外引物F3、外引物B3、内引物 FIP和内引物BIP的浓度均为10μM；
其中，免提取核酸扩增反应液包括：2×MightAmp Buffer Ver.3的体积为 6.25μl，外引物F3的体积为0.376μl，外引物B3的体积为0.374μl，MightAmp DNA PolymeraseVer.3的体积为0.25μl，浓度为1.25U/μl，无菌水的体积为 3.75μl；
2×MightAmp Buffer Ver.3中Mg2+浓度是4mM(2×)，dNTP浓度是600 μM(2×)；
其中，LAMP法鉴定反应液为LAMP法普通鉴定反应液，包括：无菌水的体积为4μl，MnCl2溶液的体积为2μl、终浓度为5mM，10×Bsm Buffer 的体积为2.5μl，dNTPs mix的体积为1μl、浓度为10mM each，内引物FIP 的体积为1μl，内引物BIP的体积为1μl，Bsm DNAPolymerase的体积为1μl，浓度为8U/μl；
或者，LAMP法鉴定反应液为LAMP法钙黄绿素荧光鉴定反应液，包括：钙黄绿素的体积为2.5μl、浓度为0.25mM，MnCl2溶液的体积为2μl、终浓度为5mM，10×Bsm Buffer的体积为2.5μl，dNTPs mix的体积为1μl、浓度为10mM each，内引物FIP的体积为1μl，内引物BIP的体积为1μl，Bsm DNA Polymerase的体积为1μl，浓度为8U/μl，无菌水的体积为1.5μl；
或者，LAMP法鉴定反应液为LAMP法羟基萘酚蓝鉴定反应液，包括：羟基萘酚蓝的体积为2.5μl、MnCl2溶液的体积为2μl、终浓度为5mM，10×Bsm Buffer的体积为2.5μl，dNTPsmix的体积为1μl、浓度为10mM each，内引物FIP的体积为1μl，内引物BIP的体积为1μl，BsmDNA Polymerase的体积为1μl，浓度为8U/μl，无菌水的体积为1.5μl；
或者，LAMP法鉴定反应液为LAMP法PicoGreen荧光鉴定反应液，包括：PicoGreen的体积为2.5μl，MnCl2溶液的体积为2μl、终浓度为5mM， 10×Bsm Buffer的体积为2.5μl，dNTPs mix的体积为1μl、浓度为10mM each，内引物FIP的体积为1μl，内引物BIP的体积为1μl，Bsm DNA Polymerase 的体积为1μl，浓度为8U/μl，无菌水的体积为1.5μl；
或者，LAMP法鉴定反应液为LAMP法SYBR Green I荧光鉴定反应液，包括MnCl2溶液的体积为2μl、终浓度为5mM，10×Bsm Buffer的体积为2.5μl， dNTPs mix的体积为1μl、浓度为10mM each，内引物FIP的体积为1μl，内引物BIP的体积为1μl，Bsm DNA Polymerase的体积为1μl，浓度为8U/μl，无菌水的体积为4μl。
试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品为携带检测序列的质粒进行普通PCR得到的核苷酸序列，所述阴性对照品为无菌水或健康无病毒生猪血清；用于加工你说的结果与阳性对照品和阴性对照品进行对比，进一步确定所的结果的可靠性。
实施例1
本发明一种基于LAMP引物组检测非洲猪瘟病毒的方法，采用 MK333180.1基因的LAMP外引物F3和外引物B3及内引物FIP和内引物 BIP对非洲猪瘟病毒基因组DNA中的MK333180.1基因先后进行扩增，即首先利用外引物F3和外引物B3对样品粗提液进行免提取扩增得到模板 DNA，之后利用内引物FIP和内引物BIP进行恒温扩增；
首先进行cDNA的筛选及引物的设计
S1.在NCBI数据库中查找2019年所发布中国地区所感染的非洲猪瘟病毒基因，且通过保守性比对筛选，得到高保守性、高特异性、可合成LAMP 引物的MK333180.1基因(登录号：QBH90507.1)，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO：1所示。
S2.利用引物设计软件PrimerExploer V4设计MK333180.1基因的LAMP 引物，筛选出稳定性高的引物组，由该引物扩增MK333180.1基因可得保守基因片段为224bp，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示：
GGTACACACGATGAAGCATAAAGATGGGAAAAATAGACTCATGAACTTTATCTA TGATCGCTGTTATTACCATATGCAAGGGGAAGAAATCTTTAGCCTCGCAAGATTTTAT GCAATCCATCATGCACCAAAGTTGTTTGACGTTTTTTATGATTGTTGTATCCTAGATA CGATACGATTCAAAAGCCTTCTTTTAGATTGTTCACATATCATAGGTAAAAACG(同 SEQ ID NO：2)
再通过扩增，获得如图1所示的cDNA模板，并采用试剂盒中的LAMP 法鉴定反应液，观察颜色变化，判断是否存在非洲猪瘟病毒，具体按照以下步骤实施：
步骤1，用灭菌后的器材采集待测个体的组织样品，组织样品包括尾、耳、脏器及脑，其中尾≤1mm，耳≤1.5mm2，脏器及脑≤1.5mm3，加入200μl 溶液A在已灭菌的研钵中进行研磨，待组织样品呈匀浆状，用已灭菌离心管吸取进行保存，再加入100μl溶液A洗涤研钵，得到洗涤液，将洗涤液加入离心管中，得到样品粗提液；
其中，溶液A的组分为：浓度为50mM的葡萄糖，浓度为10mM的EDTA，浓度为25mM的Tris-HCl，溶液A的pH＝8.0；
步骤2，取步骤1得到的样品粗提液1μl加入无酶PCR管中，再加入免提取核酸扩增反应液，混匀，得到混合液，将混合液放入98℃水浴锅中水浴 2min；
其中免提取核酸扩增反应液包括：2×MightAmp Buffer Ver.3的体积为 6.25μl，外引物F3的体积为0.376μl，外引物B3的体积为0.374μl，MightAmp DNA Polymerase Ver.3的体积为0.25μl，浓度为1.25U/μl，无菌水的体积为 3.75μl；
2×MightAmp Buffer Ver.3中Mg2+浓度是4mM，dNTP浓度是600μM；
免提取核酸扩增技术的反应体系的总体积为25μl，包括1μl的样品粗提液，6.25μl的2×MightAmp Buffer Ver.3，0.376μl的外引物F3和0.374 μl的外引物B3，0.25μl的MightAmp DNA Polymerase Ver.3，3.75μl的无菌水；
步骤3，将经步骤2处理的混合液依次放入98℃水浴锅中水浴30s，60℃水浴锅中水浴30s，放入68℃水浴锅中水浴60s，重复步骤3的过程3～5次；
步骤4，将经步骤3处理的混合液放入65℃水浴锅中水浴12min；
步骤5，将经步骤4处理的混合液加入LAMP法鉴定反应液，放入60℃水浴锅中水浴2h 30min后观察反应液颜色，判断是否含非洲猪瘟病毒；
其中，LAMP法鉴定反应液采用LAMP法普通鉴定反应液或LAMP法钙黄绿素荧光鉴定反应液或LAMP法羟基萘酚蓝鉴定反应液或LAMP法 PicoGreen荧光鉴定反应液中的一种；
LAMP法鉴定反应液采用LAMP法普通鉴定反应液，若反应液呈无色透明，则无非洲猪瘟病毒；若反应液出现白色浑浊，则存在非洲猪瘟病毒；
LAMP法普通鉴定反应液的反应体系的总体积为25μl，包括1μl模板 DNA，2μl的MnCl2，2.5μl的10×Bsm Buffer，1μl的dNTPs mix，1μl的内引物FIP和1μl内引物BIP，1μl的Bsm DNA Polymerase，4μl的无菌水；
LAMP法鉴定反应液采用LAMP法钙黄绿素荧光鉴定反应液，若反应液呈橙色，则无非洲猪瘟病毒；若反应液发出黄绿色荧光，则存在非洲猪瘟病毒；
LAMP法钙黄绿素荧光鉴定反应液的反应体系的总体积为25μl，包括 1μl模板DNA，2.5μl的钙黄绿素，2μl的MnCl2，2.5μl的10×Bsm Buffer， 1μl的dNTPs mix，1μl的内引物FIP和1μl内引物BIP,1μl的Bsm DNA Polymerase，1.5μl的无菌水；
LAMP法鉴定反应液采用LAMP法羟基萘酚蓝鉴定反应液，若反应液呈紫罗兰色，则无非洲猪瘟病毒；若反应液变为天蓝色，则存在非洲猪瘟病毒；
LAMP法羟基萘酚蓝(HNB)鉴定反应液的反应体系的总体积为25μl，包括1μl模板DNA，2.5μl的羟基萘酚蓝(HNB)，2μl的MnCl2，2.5μl 的10×Bsm Buffer，1μl的dNTPs mix，1μl的内引物FIP和1μl内引物 BIP,1μl的Bsm DNA Polymerase，1.5μl的无菌水；
LAMP法鉴定反应液采用LAMP法PicoGreen荧光鉴定反应液，若反应液呈橙色，则无非洲猪瘟病毒；若反应液出现黄绿色荧光，则存在非洲猪瘟病毒。
LAMP法PicoGreen荧光鉴定反应液的反应体系的总体积为25μl，包括 1μl模板DNA，2.5μl的PicoGreen，2μl的MnCl2，2.5μl的10×Bsm Buffer， 1μl的dNTPs mix，1μl的内引物FIP和1μl内引物BIP，1μl的Bsm DNA Polymerase，1.5μl的无菌水；
将所得测试结果与试剂盒中的阳性对照品与阴性对照品进行对比，进一步确定所得结果的可靠性，上述阳性对照的模板DNA为携带检测序列的质粒进行普通PCR得到的核酸序列；上述阴性对照的模板DNA即无菌水或健康无病毒生猪血清。
通过图2能够反映出采用设计的引物组扩增出来的无论是DNA模板还是最后的LAMP均是本发明所需的序列，能够保证其扩增的准确性。
实施例2
本发明一种基于LAMP引物组检测非洲猪瘟病毒的方法，区别是，
步骤4，将经步骤3处理的混合液放入65℃水浴锅中水浴12min后加入 LAMP法鉴定反应液，再放入60℃水浴锅中水浴2h 30min；
步骤5，将经步骤4处理的混合液加入2.5μl SYBR Green I后观察反应液颜色，LAMP法鉴定反应液采用LAMP法SYBR Green I荧光鉴定反应液，若反应液的呈橙色，则无非洲猪瘟病毒；若反应液出现黄绿色荧光，则存在非洲猪瘟病毒；
LAMP法SYBR Green I荧光鉴定反应液的反应体系的总体积为25μl，包括1μl模板DNA，2μl的MnCl2，2.5μl的10×Bsm Buffer，1μl的dNTPs mix，1μl的内引物FIP和1μl内引物BIP，1μl的Bsm DNA Polymerase， 4μl的无菌水；
其余过程与实施例1的相同。
通过图2能够反映出采用设计的引物组扩增出来的无论是DNA模板还是最后的LAMP均是本发明所需的序列，能够保证其扩增的准确性。
现有技术：免提取核酸扩增技术，是在无需提取待测动物DNA的前提下，直接利用其组织或器官研磨呈匀浆状或其唾液或尿液等物质，加入免提取核酸扩增反应液直接进行核酸扩增。但其扩增需要PCR仪来完成，涉及到PCR仪，该仪器价格国产和进口价格不一，便宜的2～3万，贵的20多万。且PCR方法操作起来较复杂，对仪器和人员要求比较高，不适合基层或现场快速诊断，因此在国内的推广速度并不是很快。
LAMP方法较其他基因诊断方法，其最大的优势就在于操作的简便性及对仪器设备和人员要求低。LAMP操作步骤少，只需按照步骤将反应液按照规定的量加入PCR管中，置于水浴锅或恒温箱就能实现反应，结果的检测也很简单，不需要像PCR那样进行凝胶电泳，LAMP反应的结果通过肉眼观察白色浑浊或荧光的生成来判断，简便快捷，适合基层快速诊断；但LAMP 方法需要提取DNA作为模板，加大的材料准备的难度。
本发明充分结合免提取核酸扩增技术与环介导等温扩增技术的优点，在无需PCR仪、无需提取待测动物DNA的前提下，可直接利用待测动物组织或器官研磨呈匀浆状或其唾液或尿液等物质进行免提取操作获得模板，接着恒温水浴扩增后目视判断，简便快捷，对仪器设备和人员要求低，克服了病毒检测对仪器设备和技术性人员依赖性较强的局限性，适合基层快速诊断。
SEQUENCE LISTING
<110> 延安大学
<120> 检测非洲猪瘟病毒的LAMP引物组、试剂盒及检测方法
<130> 2019
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1596
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
atgttctctc tccagaactt atgtcgaaaa acattaccta accgtaaact tcctgaattt 60
tttgacgaat atatattaca actgctggga ttatactggg aaaaccatgg aactattcaa 120
cgagcaggaa acaactgtgt gcttatacag caacataccc tcattcccgt aaatgaagcc 180
ctgagaacag cagcatctga agaaaattat gagatcgtga gccttttatt agcgtgggag 240
gggaaccttt actatgctat tataggggct ctagagggca accgccacga cttaattcgt 300
aaatatgatg accaaatcaa ggaccatcat gaaattctgc cattcattga cgatccagtc 360
atatttcaca aatgccatat catgcggcaa tgcttttttg attgtatttt atatcaagct 420
gtaaaatata gtaagtttcg cgttcttctt tactttaaac atagattaga ggatgatttg 480
cccttcactc atttacttat tgaaaaggca tgtaaagatc ataattatga agttattaaa 540
tggatatatg aaaacctaca tatctacaat atgatagata cctttgaatg tgctattgcc 600
cataaggatc tacatctata ttgtttgggg tatagattta tatataacag aatcgtaccc 660
gataagtatc atcatttaga tattcgcatg ctttcaagcc tacaactcct acataaggtg 720
gcagccaaag gatacttaga ttttatccta gaaaccttaa agtatgatca taataaagat 780
aatataaata ttattctaac acaagctgca acctataacc atagaaaaat tttaatctat 840
ttcattcctc aatcaaccca cgcacagata gaacaatgtt tactagtggc gataaaagca 900
aaatcttcca ggaaaacctt gaacttacta ctgtctcacc taaacctttc catcaacctc 960
atcaaaaaaa taagccatta tgttgccact tacaattcaa caaatataat aggcattctg 1020
agtatgcggc ggaaaaagaa gatatattta gatatcatat tgacaaaatt tgtaaaaaaa 1080
gctattttta ataagtttgt cgttcgatgt atggatacat tttctataaa cccggaaaga 1140
atccttaaaa tagccgcgcg aataaatagg atgatgttag tgaaaaaaat atctgaacat 1200
gtttggaaaa atcatgcggt tagacttaaa taccttaaac atgcggtaca cacgatgaag 1260
cataaagatg ggaaaaatag actcatgaac tttatctatg atcgctgtta ttaccatatg 1320
caaggggaag aaatctttag cctcgcaaga ttttatgcaa tccatcatgc accaaagttg 1380
tttgacgttt tttatgattg ttgtatccta gatacgatac gattcaaaag ccttctttta 1440
gattgttcac atatcatagg taaaaacgct catgatgcta ccaatatcaa catcgtgaac 1500
aagtatatcg gcaacctgtt tgttatggga gttcttagca aaaaagaaat cttacaggac 1560
tatccatcca tttattctaa acaatacatg ccttag 1596
<210> 2
<211> 224
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
ggtacacacg atgaagcata aagatgggaa aaatagactc atgaacttta tctatgatcg 60
ctgttattac catatgcaag gggaagaaat ctttagcctc gcaagatttt atgcaatcca 120
tcatgcacca aagttgtttg acgtttttta tgattgttgt atcctagata cgatacgatt 180
caaaagcctt cttttagatt gttcacatat cataggtaaa aacg 224
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
ggtacacacg atgaagcata a 21
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
cgtttttacc tatgatatgt gaaca 25
<210> 5
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 5
ggctaaagat ttcttcccct tgcgactcat gaactttatc tatgatcg 48
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 6
tgcaatccat catgcaccaa aaggcttttg aatcgtatcg 40
Claims (10)
1.一种检测非洲猪瘟病毒的LAMP引物组，其特征在于，该LAMP引物组由外引物F3和外引物B3、内引物FIP和内引物BIP组成；
所述外引物F3的核苷酸序列为：
5’-GGTACACACGATGAAGCATAA-3’；
所述外引物B3的核苷酸序列为：
5’-CGTTTTTACCTATGATATGTGAACA-3’；
所述内引物FIP的核苷酸序列为：
5’-GGCTAAAGATTTCTTCCCCTTGCGACTCATGAACTTTATCTATGATCG-3’；
所述内引物BIP的核苷酸序列为：
5’-TGCAATCCATCATGCACCAAAAGGCTTTTGAATCGTATCG-3’。
2.一种基于LAMP引物组检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的检测非洲猪瘟病毒的LAMP引物组、免提取核酸扩增反应液和LAMP法鉴定反应液。
3.根据权利要求2所述的一种基于LAMP引物组检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒的LAMP引物组中外引物F3、外引物B3、内引物FIP和内引物BIP的浓度均为10μM。
4.根据权利要求2所述的一种基于LAMP引物组检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，所述免提取核酸扩增反应液包括：2×MightAmp Buffer Ver.3的体积为6.25μl，外引物F3的体积为0.376μl，外引物B3的体积为0.374μl，MightAmp DNA Polymerase Ver.3的体积为0.25μl，浓度为1.25U/μl，无菌水的体积为3.75μl；
所述2×MightAmp Buffer Ver.3中Mg2+浓度是4mM，dNTP浓度是600μM。
5.根据权利要求2所述的一种基于LAMP引物组检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，所述LAMP法鉴定反应液为LAMP法普通鉴定反应液或LAMP法钙黄绿素荧光鉴定反应液或LAMP法羟基萘酚蓝鉴定反应液或LAMP法PicoGreen荧光鉴定反应液或LAMP法SYBR Green I荧光鉴定反应液中的一种；
所述LAMP法普通鉴定反应液，包括：无菌水的体积为4μl，MnCl2溶液的体积为2μl、终浓度为5mM，10×Bsm Buffer的体积为2.5μl，dNTPs mix的体积为1μl、浓度为10mM each，内引物FIP的体积为1μl，内引物BIP的体积为1μl，Bsm DNA Polymerase的体积为1μl，浓度为8U/μl；
所述LAMP法钙黄绿素荧光鉴定反应液，包括：钙黄绿素的体积为2.5μl、终浓度为0.25mM，MnCl2溶液的体积为2μl、终浓度为5mM，10×Bsm Buffer的体积为2.5μl，dNTPs mix的体积为1μl、浓度为10mM each，内引物FIP的体积为1μl，内引物BIP的体积为1μl，Bsm DNAPolymerase的体积为1μl，浓度为8U/μl，无菌水的体积为1.5μl；
所述LAMP法羟基萘酚蓝鉴定反应液，包括：羟基萘酚蓝的体积为2.5μl，MnCl2溶液的体积为2μl、终浓度为5mM，10×Bsm Buffer的体积为2.5μl，dNTPs mix的体积为1μl、浓度为10mM each，内引物FIP的体积为1μl，内引物BIP的体积为1μl，Bsm DNA Polymerase的体积为1μl，浓度为8U/μl，无菌水的体积为1.5μl；
所述LAMP法PicoGreen荧光鉴定反应液，包括：PicoGreen的体积为2.5μl，MnCl2溶液的体积为2μl、终浓度为5mM，10×Bsm Buffer的体积为2.5μl，dNTPs mix的体积为1μl、浓度为10mM each，内引物FIP的体积为1μl，内引物BIP的体积为1μl，Bsm DNA Polymerase的体积为1μl，浓度为8U/μl，无菌水的体积为1.5μl；
所述LAMP法SYBR Green I荧光鉴定反应液，包括MnCl2溶液的体积为2μl、终浓度为5mM，10×Bsm Buffer的体积为2.5μl，dNTPs mix的体积为1μl、浓度为10mM each，内引物FIP的体积为1μl，内引物BIP的体积为1μl，Bsm DNA Polymerase的体积为1μl，浓度为8U/μl，无菌水的体积为4μl。
6.根据权利要求2所述的一种基于LAMP引物组检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品为携带检测序列的质粒进行普通PCR得到的核苷酸序列，所述阴性对照品为无菌水或健康无病毒生猪血清。
7.一种基于LAMP引物组检测非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的外引物F3和外引物B3对样品粗提液进行免提取扩增得到模板DNA，再利用权利要求1所述的内引物FIP和内引物BIP进行恒温扩增，再加入LAMP法鉴定反应液观察结果，具体按照以下步骤实施：
步骤1，采集待测个体的组织样品，组织样品包括尾、耳、脏器及脑，其中尾≤1mm，耳≤1.5mm2，脏器及脑≤1.5mm3，加入200μl溶液A在已灭菌的研钵中进行研磨，待组织样品呈匀浆状，用已灭菌离心管吸取进行保存，再加入100μl溶液A洗涤研钵，得到洗涤液，将洗涤液加入离心管中，得到样品粗提液；
步骤2，取步骤1得到的样品粗提液1μl加入无酶PCR管中，再加入免提取核酸扩增反应液，混匀，得到混合液，将混合液放入98℃水浴锅中水浴2min；
其中免提取核酸扩增反应液包括：2×MightAmp Buffer Ver.3的体积为6.25μl，外引物F3的体积为0.376μl，外引物B3的体积为0.374μl，MightAmp DNA Polymerase Ver.3的体积为0.25μl，浓度为1.25U/μl，无菌水的体积为3.75μl；
所述2×MightAmp Buffer Ver.3中Mg2+浓度是4mM，dNTP浓度是600μM；
步骤3，将经步骤2处理的混合液依次放入98℃水浴锅中水浴30s，60℃水浴锅中水浴30s，放入68℃水浴锅中水浴60s，重复此过程3～5次；
步骤4，将经步骤3处理的混合液放入65℃水浴锅中水浴12min；
步骤5，将经步骤4处理的混合液加入LAMP法鉴定反应液，放入60℃水浴锅中水浴2h30min后观察反应液颜色，判断是否含非洲猪瘟病毒；
其中LAMP法鉴定反应液采用LAMP法普通鉴定反应液或LAMP法钙黄绿素荧光鉴定反应液或LAMP法羟基萘酚蓝鉴定反应液或LAMP法PicoGreen荧光鉴定反应液中的一种。
8.根据权利要求7所述的检测非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于，所述步骤5中，LAMP法鉴定反应液采用LAMP法普通鉴定反应液，若反应液呈无色透明，则无非洲猪瘟病毒；若反应液出现白色浑浊，则存在非洲猪瘟病毒；
LAMP法鉴定反应液采用LAMP法钙黄绿素荧光鉴定反应液，若反应液呈橙色，则无非洲猪瘟病毒；若反应液发出黄绿色荧光，则存在非洲猪瘟病毒；
LAMP法鉴定反应液采用LAMP法羟基萘酚蓝鉴定反应液，若反应液呈紫罗兰色，则无非洲猪瘟病毒；若反应液变为天蓝色，则存在非洲猪瘟病毒；
LAMP法鉴定反应液采用LAMP法PicoGreen荧光鉴定反应液，若反应液呈橙色，则无非洲猪瘟病毒；若反应液出现黄绿色荧光，则存在非洲猪瘟病毒。
9.一种基于LAMP引物组检测非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的外引物F3和外引物B3对样品粗提液进行免提取扩增得到模板DNA，再利用权利要求1所述的内引物FIP和内引物BIP进行恒温扩增，再加入LAMP法SYBR Green I荧光鉴定反应液观察结果，具体按照以下步骤实施：
步骤1，采集待测个体的组织样品，组织样品包括尾、耳、脏器及脑，其中尾≤1mm，耳≤1.5mm2，脏器及脑≤1.5mm3，加入200μl溶液A在已灭菌的研钵中进行研磨，待组织样品呈匀浆状，用已灭菌离心管吸取进行保存，再加入100μl溶液A洗涤研钵，得到洗涤液，将洗涤液加入离心管中，得到样品粗提液；
步骤2，取步骤1得到的样品粗提液1μl加入无酶PCR管中，再加入免提取核酸扩增反应液，混匀，得到混合液，将混合液放入98℃水浴锅中水浴2min；
其中免提取核酸扩增反应液包括：2×MightAmp Buffer Ver.3的体积为6.25μl，外引物F3的体积为0.376μl，外引物B3的体积为0.374μl，MightAmp DNA Polymerase Ver.3的体积为0.25μl，浓度为1.25U/μl，无菌水的体积为3.75μl；
所述2×MightAmp Buffer Ver.3中Mg2+浓度是4mM，dNTP浓度是600μM；
步骤3，将经步骤2处理的混合液依次放入98℃水浴锅中水浴30s，60℃水浴锅中水浴30s，放入68℃水浴锅中水浴60s，重复此过程3～5次；
步骤4，将经步骤3处理的混合液放入65℃水浴锅中水浴12min后加入LAMP法鉴定反应液，再放入60℃水浴锅中水浴2h 30min；
步骤5，将经步骤4处理的混合液加入2.5μl SYBR Green I后观察反应液颜色，若反应液的呈橙色，则无非洲猪瘟病毒；若反应液出现黄绿色荧光，则存在非洲猪瘟病毒。
10.根据权利要求7至9任一项所述的检测非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于，所述溶液A的组分为：浓度为50mM的葡萄糖，浓度为10mM的EDTA，浓度为25mM的Tris-HCl，溶液A的pH＝8.0。
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