CN110305986A

CN110305986A - Sva、o型fmdv和a型fmdv的一步法三重实时荧光定量pcr检测引物和探针

Info

Publication number: CN110305986A
Application number: CN201910649503.4A
Authority: CN
Inventors: 陈君彦; 王秀明; 魏学峰; 刘国英; 关平原; 王艳杰; 刘建奇; 武瑾贤; 谢雪岑; 陈九连
Original assignee: Jinyu Baoling Bio-pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jinyu Baoling Bio-pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2019-07-18
Filing date: 2019-07-18
Publication date: 2019-10-08

Abstract

本发明提供了能同时检测鉴别塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒的一步法三重实时荧光定量PCR检测引物和探针，属于生物检测技术领域。其中基于提供的引物和探针开发了试剂盒用于对塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒进行同时快速检测。本发明的试剂盒和检测方法可实现一次上样、一次分析定量，达到同时快速检测鉴别和准确定量塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒的目的，不仅减少了检测的工作量和成本，且能在最短的时间内完成检测。本发明将在塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒的检测和疫苗生产中发挥重要作用，应用前景广阔。

Description

SVA、O型FMDV和A型FMDV的一步法三重实时荧光定量PCR检测引物和探针

技术领域

本发明属于生物检测技术领域中的动物疫病病原检测，具体而言，涉及一种能够同时检测和鉴别塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒的一步法三重实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物和探针。

背景技术

塞内卡病毒(塞内卡病毒A，SVA或SVV)和口蹄疫病毒(FMDV)同属于微RNA病毒科，都是一种无囊膜的单股正链RNA病毒。SVA是塞内卡病毒属的典型代表，与心病毒属最接近，而FMDV属于口疮病毒属。

塞内卡病毒病是主要发生于猪的一种传染病，其临床特征为感染猪只鼻部和口腔形成溃疡、厌食、跛行，导致新生仔猪急性死亡。早期塞内卡病例主要发生于育肥猪，鼻部、口部和蹄部的冠状带部可见水疱症状，但最近发现的一些塞内卡阳性病例发生于新生仔猪，症状为腹泻，无水疱病变，这些病例主要是通过对血清、粪便和不同组织进行PCR检测发现的。 2002年在美国马里兰州的一家公司首次发现，2007年，一批从加拿大运往美国明尼苏达州的猪鼻镜出现水泡、蹄部冠状带溃烂等类似水疱病症状，经检测排除口蹄疫、水泡性口炎病和猪水疱病，最终通过PCR检测确定为塞内卡病毒阳性。2014年至今，在美国、中国、加拿大、巴西、泰国、哥伦比亚等多国均发现SVA导致的临床病例。在2007年之前，SVA主要作为溶瘤细胞被研究，可有效治疗一些神经内分泌肿瘤。

口蹄疫病毒可引起牛、猪和羊等偶蹄动物感染的一种急性、热性、高度接触性传染病，以口腔黏膜、舌面、唇、鼻镜、蹄部和乳房皮肤发生水疱和溃烂为特征。口蹄疫平均致死率仅为1％，但是被感染动物100％发病，且传播效力极高，使实际的畜产量锐减。FMDV一旦爆发将造成巨大的经济损失，因此世界各国对该病的研究极为重视。鉴于其危害之大，影响范围之广，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类烈性传染病之首。现在我国主要流行O型和A型口蹄疫。

仅从临床症状上无法区分O型FMDV和A型FMDV感染还是SVA感染，给临床确诊带来了难度，需要用实验室检测技术加以确定；另外针对疫苗生产过程中的质量监控，也无法快速区分疫苗生产原材料、半成品或成品中是何种类型的病毒以及病毒病原含量以对疫苗生产进行管理。然而，目前还没有报道有区分O型口蹄疫病毒、A型口蹄疫病毒和塞内卡病毒同时鉴别检测和准确定量的检测试剂盒。

发明内容

针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明的一个方面提供一种用于对塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒进行三重实时荧光定量PCR检测的引物和Taqman探针，包括：

用于检测塞内卡病毒的上游引物(SVA-F)和下游引物(SVA-R)，所述上游引物(SVA-F) 的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：1所示，下游引物(SVA-R)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示；

用于对塞内卡病毒进行实时荧光定量PCR检测的TaqMan探针(SVA-P)，所述TaqMan探针(SVA-P)的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：3所示；

用于检测O型口蹄疫病毒的上游引物(FMDV-O-F)和下游引物(FMDV-O-R)，所述上游引物(FMDV-O-F)的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：5所示，下游引物(FMDV-O-R) 的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：6所示；

用于对O型口蹄疫病毒进行实时荧光定量PCR检测的TaqMan探针(FMDV-O-P)，所述TaqMan探针(FMDV-O-P)的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：7所示；

用于检测A型口蹄疫病毒的上游引物(FMDV-A-F)和(FMDV-A-R)，所述上游引物(FMDV-A-F)的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：9所示，下游引物(FMDV-A-R)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：10所示；

用于对A型口蹄疫病毒进行实时荧光定量PCR检测的TaqMan探针(FMDV-A-P)，所述TaqMan探针(FMDV-A-P)的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：11所示；

所述探针为经过荧光标记的，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；且对三种病毒检测探针所标记的荧光报告基团不相同。

上述用于对塞内卡病毒进行实时荧光定量PCR检测的TaqMan探针(SVA-P)的5’端荧光报告基团为HEX，3’端荧光淬灭基团为BHQ1；用于对O型口蹄疫病毒进行实时荧光定量PCR检测的TaqMan探针(FMDV-O-P)的5’端荧光报告基团为FAM，3’端荧光淬灭基团为TAMRA；用于对A型口蹄疫病毒进行实时荧光定量PCR检测的TaqMan探针(FMDV-A-P) 的5’端荧光报告基团为ROX，3’端荧光淬灭基团为BHQ2；所述探针的3’端已经磷酸化处理。

本发明的另一方面提供一种用于对塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒进行一步法三重实时荧光定量PCR检测的试剂盒，包括上述的引物和TaqMan探针；

使用所述试剂盒时的25μL实时荧光定量PCR检测体系中所述引物和TaqMan探针的用量优选为：SVA-F(10μM)0.4μL，SVA-R(10μM)0.4μL，SVA-P(10μM)0.4μL，FMDV-O-F (10μM)0.5μL，FMDV-O-R(10μM)0.5μL，FMDV–O-P(10μM)0.5μL，FMDV-A-F (10μM)0.25μL，FMDV-A-R(10μM)0.25μL，FMDV–A-P(10μM)0.25μL。

上述试剂盒中还包括阳性对照品和阴性对照品，阳性对照品为塞内卡病毒RNA、O型口蹄疫病毒RNA和A型口蹄疫病毒RNA，各阳性对照品为单一包装或混合包装，阴性对照品为不含塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒的反应体系，如H₂O(双蒸水、无菌去离子水等)；使用所述试剂盒对塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒进行一步法三重实时荧光定量PCR检测时，将单一包装的阳性对照品混合或直接使用混合包装的阳性对照品。

上述试剂盒中还包括标准品，其为分别携带塞内卡病毒核苷酸检测基因、O型口蹄疫病毒核苷酸检测基因和A型口蹄疫病毒核苷酸检测基因的重组质粒pCR-4TOPO-SVA、pCR-4 TOPO-O-FMDV和pCR-4TOPO-A-FMDV；各标准品为单一包装或等浓度混合包装；使用所述试剂盒对塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒进行一步法三重实时荧光定量 PCR检测时，将单一包装的各标准品等浓度混合或直接使用混合包装的标准品。

上述试剂盒在对塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒进行非疾病诊断目的的一步法检测中的应用也属于本发明的内容。

上述应用为用于对塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒进行定性、定量检测，包括以下步骤：

1)建立标准曲线：将分别携带塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒的检测基因的重组质粒pCR4-TOPO-SVA、pCR4-TOPO-O-FMDV和pCR4-TOPO-A-FMDV单一包装的质控品等浓度混合或直接使用等浓度混合包装的质控品，按照10倍梯度将混合液中的各标准品浓度稀释至1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹copies/μL，以不同浓度的标准品混合液作为模板，在上述的引物和TaqMan探针的引导下进行三重实时荧光定量PCR检测，检测结束后，以各标准品的浓度Log值(X轴)对其相应Ct值(Y轴)作图，绘制标准曲线；

2)提取待测样品的基因组RNA，以提取的基因组RNA为模板，在上述的引物和TaqMan 探针的引导下进行三重实时荧光定量PCR检测；

3)用得到的各自的CT值或荧光信号的变化实现对塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒定性检测；

4)对步骤3)中确定为某病毒阳性的待测样品，再根据该病毒的荧光信号的强度和步骤1)中的相应标准曲线，得出该样品中所含的该病毒的拷贝数，实现定量检测。

上述步骤2)中的待测样品包括用于疫苗生产的原材料、半成品及成品、猪场送检样品。

上述步骤1)和步骤2)中的25μL实时荧光定量PCR检测体系包括：模板2μL，实时荧光定量一步法PCR反应液2×One Step RT-PCR Buffer III 12.5μL，TaKaRa Ex Taq HS0.5μL， PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.5μL，SVA-F(10μM)0.4μL，SVA-R(10μM)0.4μL，SVA-P (10μM)0.4μL，FMDV-O-F(10μM)0.5μL，FMDV-O-R(10μM)0.5μL，FMDV–O-P (10μM)0.5μL，FMDV-A-F(10μM)0.25μL，FMDV-A-R(10μM)0.25μL，FMDV–A-P (10μM)0.25μL，RNA-freeH₂O 6.05μL。

上述步骤1)和步骤2)中的三重实时荧光定量PCR检测条件为：先42℃反转录20min， 95℃预变性3min；然后94℃变性15s，55℃退火30s，45个循环(PCR扩增)。

上述步骤3)中的判定方法为：

若样品在FMDV-O-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道在37个循环内(不包括第37个循环)出现“S”型扩增曲线，则确认为O型口蹄疫病毒阳性(样品中含有O型口蹄疫病毒)；若样品在FMDV–A-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道在37个循环内(不包括第37个循环)出现“S”型扩增曲线，则确认为A型口蹄疫病毒阳性(样品中含有A型口蹄疫病毒)；若样品在SVA-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道在37个循环内(不包括第37个循环)出现“S”型扩增曲线，则确认为塞内卡病毒阳性(样品中含有塞内卡病毒)；若样品在任一通道在39个循环以上(包括第39个循环)未出现“S”型扩增曲线，则确认为对应病毒阴性(样品中不含有塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和/或A型口蹄疫病毒)；若样品在任一通道在37-39个循环之间(包括第37个循环且不包括第39个循环) 出现“S”型扩增曲线，判定为可疑，需重检；

优选地，若样品在FAM通道在37个循环内(不包括第37个循环)出现“S”型扩增曲线，则确认为O型口蹄疫病毒阳性(样品中含有O型口蹄疫病毒)；若样品在ROX通道在 37个循环内(不包括第37个循环)出现“S”型扩增曲线，则确认为A型口蹄疫病毒阳性(样品中含有A型口蹄疫病毒)；若样品在HEX通道在37个循环内(不包括第37个循环)出现“S”型扩增曲线，则确认为塞内卡病毒阳性(样品中含有塞内卡病毒)；若样品在任一通道在39个循环以上(包括第39个循环)未出现“S”型扩增曲线，则确认为对应病毒阴性(样品中不含有塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和/或A型口蹄疫病毒)；若样品在任一通道在37-39 个循环之间(包括第37个循环且不包括第39个循环)出现“S”型扩增曲线，则判定为可疑，需重检。

基于以上技术方案提供的能同时检测鉴别塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒的一步法三重实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物和探针可实现一次上样、一次分析定量，达到同时快速检测鉴别和准确定量塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒的目的，不仅减少了检测的工作量和成本，且能在最短的时间内完成检测。本发明将在塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒的鉴别检测和疫苗生产中发挥重要作用，应用前景广阔。

附图说明

图1为本发明使用组1的引物和探针组合对SVA、O型FMDV和A型FMDV三重实时荧光定量PCR检测的标准品的扩增曲线；

图2为本发明用于对SVA、O型FMDV和A型FMDV进行三重实时荧光定量PCR检测的标准曲线；

图3为本发明SVA、O型FMDV和A型FMDV进行三重实时荧光定量PCR检测方法的特异性检测结果；

图4为本发明SVA、O型FMDV和A型FMDV进行三重实时荧光定量PCR检测方法重复性的扩增曲线检测结果。

具体实施方式

针对现有技术中还没有能同时快速检测鉴别和准确定量塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和 A型口蹄疫病毒的试剂盒及其专用引物和TaqMan探针，本发明基于塞内卡病毒全基因组的序列、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒全基因组的序列设计并筛选出特异性和敏感性均较高的能同时并快速检测和鉴别三种病毒的引物和TaqMan探针，并基于该引物和TaqMan探针提供了检测该三种病毒的试剂盒。

通过以下具体实施方式详细说明本发明。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》Sambrook，J.，Russell，DavidW.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。

上述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/ 体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

所用引物由北京华大基因有限公司合成；所用探针由TAKARA基因公司合成。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但不应作为对本发明的限制。

生物基因组是直接反应生物基本信息的一个最客观的指标，不同的病毒所含有的基因组信息不同，通过基因组信息可将不同的病毒分类至不同的族群，利用基因组碱基互补配对的原则，可实现特异位点基因序列的大量扩增。本发明基于以上基本原理设计了多对特异性引物和多条寡核苷酸探针，利用碱基互补配对的原理，建立了一种特异性检测塞内卡病毒、O 型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒的三重实时荧光定量PCR检测方法。

实施例1：设计用实时荧光定量PCR技术检测塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒的引物和TaqMan探针

从NCBI的核酸数据库GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)检索获得塞内卡病毒全基因组的序列、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒全基因组的序列(GeneBank序号：NC_011349、 KT321458、KX173339、KX173338、KX173340、KX751943、KX751944、KY747510、KY038016、 KY747511、KY747512、KX751945、KX751946、KX377924、KY419132、DQ641257、KU051392、 KT757280、KU051391、KY486158、KY486165、KC667560、KR063109、KR063107、KY368743、 AF506822.2、KX712091.1、HQ412603.1、AJ539141.1、AY390432.1、AY304994.1、GQ406249.1、 KT968663.1、HQ632773.1、KY421683.1、KY421686.1、KY077630.2、KY421684.1、KF450794.1、 AJ131665.1)，用DNA Star软件进行比对，根据引物、TaqMan探针设计原则，选取分别在塞内卡病毒的核苷酸序列3C区域的特异性保守序列(最终确定为序列表中SED ID NO：4)、 O型口蹄疫病毒的核苷酸序列VP1区域的特异性保守序列(最终确定为序列表中SED ID NO： 8)和A型口蹄疫病毒的核苷酸序列VP1区域的特异性保守序列(最终确定为序列表中SED ID NO：12)作为检测序列来设计引物和探针。

关于塞内卡病毒的3C区域基因，Hales L M等发表的文献“Complete genomesequence analysis of Seneca Valley virus-001,a novel oncolytic picornavirus[J].Journal of General Virology, 2008,89(5):1265-1275.”中已阐述该3C基因为保守的区域；赵晓亚已发表的“猪塞内加谷病毒 (SVA)的分离鉴定及致病性研究”硕士学位论文(华南农业大学，2016硕士毕业论文(24-33)) 中已在该3C区域选取4763-4879位碱基段作为靶序列建立了Seneca Valley virus Taq Man荧光定量PCR检测方法，然而遗憾的是，该单重PCR方法敏感性仅为1×10²拷贝/μL。

本发明从塞内卡病毒的3C保守区域中优选出特异性片段作为检测序列，并最终确定该检测序列为塞内卡病毒自5′端第6564-6820位碱基(序列表中SED ID NO：4)。依据选定的检测序列，设计对塞内卡病毒进行实时荧光定量PCR检测的引物及TaqMan探针。

关于O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒的研究，马震原、吴志明、闫若潜等发表的专利及文献“鉴别口蹄疫病毒O型、A型、Asia-I型三重RT-PCR方法的建立与应用”中FMDV检测区为2B基因；李金海、李兴玉、曹三杰等发表的文献“O型、A型及Asia1型3个型口蹄疫病毒通用套式RT-PCR检测方法的建立”中FMDV检测区为VP1基因，但该方法为普通 PCR，样品稀释方法不同而敏感性无法比对。本发明从塞内卡病毒的3C保守区域中优选出特异性片段作为检测序列，并最终确定该检测序列为塞内卡病毒自5′端第6564-6820位碱基(序列表中SEDID NO：4)；从O型口蹄疫病毒的核苷酸序列VP1区域的特异性保守序列中优选特异性片段作为检测序列，并最终确定该检测序列为O型口蹄疫病毒自5′端第3126-3793 位碱基(序列表中SED ID NO：8)；从A型口蹄疫病毒的核苷酸序列VP1区域的特异性保守序列中优选特异性片段作为检测序列，并最终确定该检测序列为A型口蹄疫病毒自5′端第 3268-3829位碱基(序列表中SED ID NO：12)。

从基于以上确定的检测序列获得的众多引物及探针中，本发明设计多组组合并从中筛选出组1作为优选组，组2作为对照组，序列信息如下所示：

组1(优选组)：

SVA-F(上游引物)：5’-TATCTCAGATCCCTGGCTGTC-3’(序列位置：塞内卡病毒自5’端第6634-6654位碱基，序列表中SED ID NO：1)；

SVA-R(下游引物)：5’-CCTGATGATCACATTGTTGAGC-3’(序列位置：塞内卡病毒自5’端第6741-6762位碱基，序列表中SED ID NO：2)；

SVA-P(TaqMan探针)：5’-HEX-CACGCTTACGGCGAGCGTCGCATCAAG-BHQ1-3’ (序列位置：塞内卡病毒自5’端第6661-6687位碱基，序列表中SED ID NO：3)；

FMDV-O-F(上游引物)：5’-CTCACTGACCAACGTGAGAGGCGAT-3’(序列位置：O 型口蹄疫病毒自5’端第3699-3720位碱基，序列表中SED ID NO：5)；

FMDV-O-R(下游引物)：5’-ACAGCAGTTCTGTCACCCGAGT-3’(序列位置：O型口蹄疫病毒自5’端第3793-3814位碱基，序列表中SED ID NO：6)；

FMDV-O-P(TaqMan探针)：5’-FAM-CAAGTGCTGGCTCAGAAGGCGGCGA-TAMRA-3’ (序列位置：O型口蹄疫病毒自5’端第3727-3751位碱基，序列表中SED ID NO：7)；

FMDV-A-F(上游引物)：5’-AGCCTGTGAGCCCCACACATGTC-3’(序列位置：A型口蹄疫病毒自5’端第3411-3433位碱基，序列表中SED ID NO：9)；

FMDV-A-R(下游引物)：5’-AAGCCGYGTGAACGGYGCTTTGT-3’(序列位置：A型口蹄疫病毒自5’端第3606-3627位碱基，其中Y＝C、T，序列表中SED ID NO：10)；

FMDV-A-P(TaqMan探针)：5’-ROX-TCATGCARACACACCARCACGGGCT-BHQ2-3’ (序列位置：A型口蹄疫病毒自5’端第3441-3465位碱基，其中R＝A、G，序列表中SED ID NO：11)；

组2(对照组)：

SVA-F1(上游引物)：5’-tataagatgactcctgccaac-3’(序列位置：塞内卡病毒自5’端第 6898-6918位碱基，序列表中SED ID NO：13)；

SVA-R1(下游引物)：5’-agaatttggaagccatgctctc-3’(序列位置：塞内卡病毒自5’端第 7025-7046位碱基，序列表中SED ID NO：14)；

SVA-P1(TaqMan探针)：5’-HEX-ttctgtcttccctccgacttcctctc-BHQ1-3’(序列位置：塞内卡病毒自5’端第6924-6949位碱基，序列表中SED ID NO：15)；

FMDV-O-F1(上游引物)：5’-ACAGATTYGTGAARGTHACAC-3’(序列位置：O型口蹄疫病毒自5’端第3373-3393位碱基，其中Y＝C、T，R＝A、G，H＝A、T、C，序列表中 SED ID NO：16)；

FMDV-O-R1(下游引物)：5’-CCRTTYGGVACCCAGGTRAG-3’(序列位置：O型口蹄疫病毒自5’端第3519-3538位碱基，其中V＝G、A、C，R＝A、G，Y＝C、T，序列表中SED ID NO：17)；

FMDV-O-P1(TaqMan探针)：5’-FAM-TNYTGGACCTGATGCARAYCCCHBC-TAMRA -3’(序列位置：O型口蹄疫病毒自5’端第3412-3136位碱基，其中N＝A、G、C、T，Y＝C、 T，R＝A、G，H＝A、T、C，B＝G、T、C，序列表中SED ID NO：18)；

FMDV-A-F1(上游引物)：5’-ACCACYRCYACCGGGGART-3’(序列位置：A型口蹄疫病毒自5’端第3181-3199位碱基，其中Y＝C、T，R＝A、G，序列表中SED ID NO：19)；

FMDV-A-R1(下游引物)：5’-ARSYRAYGTCSGTGTGSTR-3’(序列位置：A型口蹄疫病毒自5’端第3262-3280位碱基，其中Y＝C、T，R＝A、G，S＝G、C，序列表中SED ID NO： 20)；

FMDV-A-P1(TaqMan探针)：5’-ROX-CAGACCCBGTCACMACCACYGTBGAR -BHQ2-3’(序列位置：A型口蹄疫病毒自5’端第3203-3228位碱基，其中Y＝C、T，R＝A、 G，B＝G、T、C，M＝A、C，序列表中SED ID NO：21)；

上述两组引物和探针组合针对塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒的TaqMan 探针的报告荧光基团分别为HEX、FAM和ROX，荧光淬灭基团分别为与报告荧光基团相对应的BHQ1、TAMRA和BHQ2。

为防止PCR扩增时被延伸，上述TaqMan探针的3’端已经磷酸化处理。

使用上述两组引物和探针组合分别对SVA、O型FMDV和A型FMDV进行荧光定量PCR，结果确定以组1为代表的优选引物和探针(如图1所示，当使用组1的引物和探针组合对SVA、O型FMDV和A型FMDV进行同时PCR检测时，可以检测至SVA为1×10²copies/μL、O 型FMDV为1×10¹copies/μL、A型FMDV为1×10²copies/μL)，其具有相对于组2(检测至SVA为1×10⁴copies/μL、O型FMDV为1×10³copies/μL、A型FMDV为 1×10⁴copies/μL)在同时鉴别检测塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒时较高的敏感性。另外使用组2的引物和探针分别对SVA、O型FMDV和A型FMDV进行PCR检测时，针对SVA的引物和探针的敏感性为1×10³copies/μL、针对O型FMDV的引物和探针的敏感性为1×10²copies/μL、针对A型FMDV的引物和探针的敏感性为1×10²copies/μL，可见当将组2的引物和探针进行组合(即将单重PCR检测的引物和探针进行组合)同时对塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒进行PCR检测时，可能会由于三种引物和探针之间存在相互干扰而是敏感性有所下降。

相较于现有技术相比，本发明的优势在于：

现有发明中SVA单重荧光定量PCR检测方法有，如：赵晓亚发明的“一种塞内加谷病毒荧光定量PCR检测引物及试剂盒”专利、Alais Maria Dall Agnol等人发表的“A TaqMan-based qRT-PCR assay for Senecavirus A detection in 1tissue samples ofneonatal piglets”文献、樊晓旭等人发表的“塞尼卡谷病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立”文献等；现有发明中FMDV 相关有单重和多重荧光定量PCR检测方法，如：王乃福等人发表的“口蹄疫、水泡性口炎和猪水泡病多重荧光定量RT-PCR检测方法的建立”文献；胡骑等发表的“O型口蹄疫病毒 Real-time PCR检测方法的建立”文献，李金海等人发表的“O型、A型及Asia1型3个型口蹄疫病毒通用套式RT-PCR检测方法的建立”文献，闫若潜人发明的“口蹄疫和塞尼卡谷病毒二重实时荧光定量PCR检测试剂盒”等，但是目前还没有研究发表过能同时检测鉴别“塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒”一步法三重实时荧光定量PCR的检测方法，为此，本发明特别优化了相关引物和探针，建立了一种塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒三重实时荧光定量PCR检测方法，可快速同时检测鉴别和准确定量塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒，将在塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒的鉴别检测和疫苗生产中发挥重要作用。

实施例2：塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒的三重实时荧光定量PCR检测

一、提取塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒的基因组RNA

将塞内卡病毒细胞培养物(金宇保灵公司疫苗毒株，用于获得标准品和阳性对照品)、 O型口蹄疫病毒细胞培养物(金宇保灵公司疫苗毒株，用于获得标准品和阳性对照品)和A 型口蹄疫病毒细胞培养物(金宇保灵公司疫苗毒株，用于获得标准品和阳性对照品)以及待测样品作为待提取样品，提取待提取样品的基因组RNA，具体提取方法参照AXYGEN试剂盒(AxyprepTMBody Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit，AXYGEN公司)的介绍，包括以下步骤：

(1)按试剂盒说明书，预先配制含1％冰乙酸的异丙醇和在试剂Buffer W1A和Buffer W2 中添加指定浓度的无水乙醇；

(2)在1.5mL离心管中加入200μL的待提取样品，并加入200μL Buffer V-L，漩涡震荡混匀后，静置5min；

(3)在步骤(2)的混合有样品及试剂的1.5mL离心管中加75μL Buffer V-N，漩涡震荡混匀，12000g离心5min；

(4)将上清转移至2mL离心管(试剂盒内提供)中，加300μL异丙醇(1％冰乙酸)，上下倒置6-8次，混合均匀；

(5)将制备管(试剂盒内提供)置于另一2mL离心管中，取步骤(4)的混合液移入制备管中，6000g离心1min；

(6)弃滤液，将制备管置回至步骤(5)的2mL离心管中，加500μL Buffer W1A，室温静置1min，12000g离心1min；

(7)弃滤液，将制备管置回至步骤(5)的2mL离心管中，加800μL Buffer W2，12000g离心1min；

(8)弃滤液，将制备管置回到步骤(5)的2mL离心管中，直接以12000g离心1min；

(9)将制备管置于另一洁净的1.5mL离心管(试剂盒内提供)中，在制备管膜中央加40μL无酶水，室温静置1min，12000g离心1min，洗脱得到RNA。

将利用以上方法从待测样品中提取的RNA作为检测样；从塞内卡病毒细胞培养中提取的 RNA作为塞内卡病毒阳性对照品；从O型口蹄疫病毒细胞培养中提取的RNA作为O型口蹄疫病毒阳性对照品；从A型口蹄疫病毒细胞培养中提取的RNA作为A型口蹄疫病毒阳性对照品；按照下述二的方法将分别从塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒细胞培养中提取的RNA(即阳性对照品)制备得到标准品。

二、建立塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒的实时荧光定量PCR检测的标准曲线

1、PCR扩增塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒检测基因

以步骤一提取的塞内卡病毒的基因组RNA、O型和A型口蹄疫病毒基因组RNA(即阳性对照品)为模板，在引物SVA-standard-F和SVA-standard-R的引导下按照下表1的PCR扩增体系PCR扩增塞内卡病毒核苷酸检测序列，引物FMDV-standard-O-F和FMDV-standard-O-R 的引导下按照下表2的PCR扩增体系PCR扩增O型口蹄疫病毒核苷酸检测序列，引物 FMDV-standard-A-F和FMDV-standard-A-R的引导下按照下表3的PCR扩增体系PCR扩增A 型口蹄疫病毒核苷酸检测序列，25μL PCR扩增体系如下表1所示，PCR扩增条件为：先42℃反转录20min，95℃预变性3min；然后94℃变性15s、55℃退火30s、72℃延伸45s，45 个循环(PCR扩增)。扩增结束后，回收、纯化PCR扩增产物，得到塞内卡病毒检测基因(序列表中序列SED IDNO：4)、O型口蹄疫病毒检测基因(序列表中序列SED ID NO：8)和 A型口蹄疫病毒检测基因(序列表中序列SED ID NO：12)。

表1塞内卡病毒核苷酸检测基因的PCR扩增体系

表2 O型口蹄疫病毒核苷酸检测基因的PCR扩增体系

表3 A型口蹄疫病毒核苷酸检测基因的PCR扩增体系

2、制备标准品

将上述步骤1获得的塞内卡病毒核苷酸检测基因、O型口蹄疫病毒核苷酸检测基因和A 型口蹄疫病毒核苷酸检测基因分别克隆至pCR-4TOPO载体(购自Invitrogen公司)中，筛选阳性重组质粒送华大基因公司测序。测序结果表明获得了序列正确的分别携带塞内卡病毒核苷酸检测基因(序列表中序列SED ID NO：4)、O型口蹄疫病毒核苷酸检测基因(序列表中序列SED ID NO：8)和A型口蹄疫病毒核苷酸检测基因(序列表中序列SED ID NO：12)的重组质粒，分别命名为pCR-4TOPO-SVA和pCR-4TOPO-O-FMDV，pCR-4TOPO-A-FMDV，即标准品，各标准品单一包装或等浓度混合包装即为质控品。

3、建立实时荧光定量PCR标准曲线

以测序正确的携带塞内卡病毒核苷酸检测基因、O型和A型口蹄疫病毒核苷酸检测基因的重组质粒pCR-4TOPO-SVA、pCR-4TOPO-O-FMDV和pCR-4TOPO-A-FMDV作为标准品，用Qubit3.0测定浓度，并计算各标准品的拷贝(copies)数，将各标准品按照10倍梯度稀释至3×10⁸、3×10⁷、3×10⁶、3×10⁵、3×10⁴、3×10³、3×10²、3×10¹copies/μL后进行混合，得到各标准品均为1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹copies/μL的10倍梯度混合液；分别以不同浓度的标准品混合液作为模板，在引物SVA-F、SVA-R、FMDV-O-F、FMDV-O-R、FMDV-A-F、FMDV-A-R及TaqMan探针SVA-P、FMDV-O-P、FMDV-A-P的引导下进行三重实时荧光定量PCR检测，25μL实时荧光定量PCR的检测体系如表4所示，实时荧光定量PCR检测条件为(定量PCR仪型号CFX96，购自美国伯乐)：先42℃反转录20min， 95℃预变性3min；然后94℃变性15s，55℃退火30s，45个循环(PCR扩增)。

表4塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒三重实时荧光定量PCR检测体系

标准品的实时荧光定量PCR扩增曲线如图1所示，标准品扩增曲线为平滑的“S”形曲线(阳性)，图1中八组线条从左向右对应的标准品浓度分别为：1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、 1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹copies/μL。检测结束后，以各标准品的浓度Log值(X轴)对其相应Ct值(Y轴)作图，绘制标准曲线，标准曲线如图2所示，相关系数分别为R²＝0.993 (SVA)、R²＝1.000(O型FMDV)和R²＝1.000(A型FMDV)，误差较小，标准曲线可用，由标准曲线得到的线性方程为：y＝-3.140x+40.445(SVA)；y＝-3.442x+39.929(O型FMDV)； y＝-3.532x+41.593(A型FMDV)。

三、对塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒的实时荧光定量PCR检测

用一步法三重实时荧光定量PCR检测方法对从疫苗毒株(待测样品，例如疫苗生产的原材料、半成品及成品)中提取的基因组RNA(检测样)进行检测，以塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒的基因组RNA为阳性对照品(参见步骤一)，以无酶水为阴性对照品，根据实时荧光定量PCR检测结果，对检测样品中是否含有塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒进行定性判定，并依据标准曲线对病毒的拷贝数进行定量。

具体检测方法包括以下步骤：

1)提取待测样品的基因组RNA，以提取的基因组RNA为模板，在引物SVA-F、SVA-R、FMDV-O-F、FMDV-O-R、FMDV-A-F、FMDV-A-R及TaqMan探针SVA-P、FMDV-O-P、 FMDV-A-P的引导下进行三重实时荧光定量PCR检测，25μL实时荧光定量PCR的检测体系包括：模板2μL，实时荧光定量一步法PCR反应液2×One Step RT-PCR Buffer III 12.5μL(购于TaKaRa公司)，TaKaRa Ex Taq HS 0.5μL(购于TaKaRa公司)，PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.5μL(购于TaKaRa公司)，SVA-F(10μM)0.4μL，SVA-R(10μM)0.4μL，SVA-P(10μM) 0.4μL，FMDV-O-F(10μM)0.5μL，FMDV-O-R(10μM)0.5μL，FMDV–O-P(10μM)0.5μL， FMDV-A-F(10μM)0.25μL，FMDV-A-R(10μM)0.25μL，FMDV–A-P(10μM)0.25μL， RNA-free H₂O 6.05μL。实时荧光定量PCR反应条件为：先42℃反转录20min，95℃预变性 3min；然后94℃变性15s，55℃退火30s，45个循环(PCR扩增)。在每个循环的退火结束时进行荧光信号检测。

2)用得到的CT值或荧光信号的变化实现对塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒的定性检测，若样品在FAM通道在37个循环内(不包括第37个循环)出现“S”型扩增曲线，则确认为O型口蹄疫病毒阳性(样品中含有O型口蹄疫病毒)；若样品在ROX 通道在37个循环内(不包括第37个循环)出现“S”型扩增曲线，则确认为A型口蹄疫病毒阳性(样品中含有A型口蹄疫病毒)；若样品在HEX通道在37个循环内(不包括第37 个循环)出现“S”型扩增曲线，则确认为塞内卡病毒阳性(样品中含有塞内卡病毒)。

3)对步骤2)中确定为某病毒阳性的待测样品，再根据该荧光信号的强度和之前确定的相应标准曲线，得出待测样品中所含的对应病毒的拷贝数，实现该病毒定量检测。

若步骤2)中在若样品在任一通道在39个循环以上(包括第39个循环)未出现“S”型扩增曲线，则确认为对应病毒阴性(样品中不含有塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和/或A型口蹄疫病毒)；若样品在任一通道在37-39个循环之间(包括第37个循环且不包括第39个循环)出现“S”型扩增曲线，则判定为可疑，需重检。

检测结果如表5所示，7-9号样品的检测结果为SVA阳性；6号样品的检测结果为SVA可疑，需重复检测；1-2、5、10号样品的检测结果为O型FMDV阳性；3号样品的检测结果为A型FMDV阳性；4号样品O型和A型FMDV阳性；表明7-9号样品中含塞内卡病毒， 1-2、5、10号样品中含O型口蹄疫病毒，3号样品中A型口蹄疫病毒，4号样品中含O型和 A型FMDV。

表5 10份塞内卡病毒、O型和A型口蹄疫病毒样品三重实时荧光定量PCR检测结果

实施例3、本发明塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒三重实时荧光定量PCR 检测方法的敏感性、特异性和重复性

3.1、敏感性检测

将分别携带塞内卡病毒核苷酸检测基因、O型口蹄疫病毒核苷酸检测基因和A型口蹄疫病毒核苷酸检测基因的重组质粒pCR-4TOPO-SVA、pCR-4TOPO-O-FMDV和pCR-4 TOPO-A-FMDV作为标准品(参见实施例2)，按照10倍梯度稀释至3×10⁸、3×10⁷、3×10⁶、 3×10⁵、3×10⁴、3×10³、3×10²、3×10¹copies/μL进行混合，得到各标准品浓度均为1×10⁸、1×10⁷、 1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹copies/μL的10倍梯度混合液；以不同浓度的标准品作为模板，在引物SVA-F、SVA-R、FMDV-O-F、FMDV-O-R、FMDV-A-F、FMDV-A-R 及TaqMan探针SVA-P和TaqMan探针FMDV-O-P、FMDV-A-P的引导下进行三重实时荧光定量PCR检测，PCR检测体系及检测条件参照建立实时荧光定量PCR标准曲线步骤，检测本发明塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒三重实时荧光定量PCR检测方法的敏感性。

如图1所示，本发明使用组1的引物和探针组合对塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒进行三重实时荧光定量PCR检测，其可以检测至SVA为1×10²copies/μL、O型FMDV为1×10¹copies/μL、A型FMDV为1×10²copies/μL(敏感性)，并且扩增曲线为特定的“S”型曲线，说明本发明的引物和TaqMan探针与塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒RNA结合适宜。

3.2、特异性检测

对牛病毒性腹泻粘膜病病毒(BVDV)、猪瘟病毒(CSFV)、牛副流感病毒(BPIV)和牛流行热病毒(BEFV)提取RNA，对猪伪狂犬(PRV)、传染性牛鼻气管炎病毒(IBRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、细小病毒(PPV)提取DNA，以正常PK-15细胞的RNA为阴性对照品，同时以塞内卡病毒培养物的RNA、O型口蹄疫病毒(O型FMDV)的RNA、A型口蹄疫病毒(A型FMDV)的RNA为阳性对照品(参见实施例2)，以无酶水为空白对照，在引物SVA-F、SVA-R、FMDV-O-F、FMDV-O-R、FMDV-A-F、FMDV-A-R及TaqMan探针 SVA-P、FMDV-O-P、FMDV-A-P(参见实施例1)的引导下进行三重实时荧光定量PCR检测， PCR检测体系及检测条件参照建立实时荧光定量PCR标准曲线步骤，检测本发明塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒三重实时荧光定量PCR检测方法的特异性。

检测结果如图3所示，仅塞内卡病毒(SVA)、O型口蹄疫病毒(O型FMDV)、A型口蹄疫病毒(A型FMDV)出现特定的“S”型扩增曲线(结果阳性)，其它样品未出现特定的“S”型扩增曲线(结果阴性)，检测结果表明用本发明的方法可特异性地检测出塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒、A型口蹄疫病毒。

3.3、重复性检测

按照10倍梯度将各标准品(参见实施例2)稀释至3×10⁸、3×10⁷、3×10⁶、3×10⁵、3×10⁴、 3×10³、3×10²、3×10¹copies/μL进行混合，得到各标准品浓度均为1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、 1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹copies/μL的标准品10倍梯度混合液，并作为模板，每个梯度2 个重复，在引物SVA-F、SVA-R、FMDV-O-F、FMDV-O-R、FMDV-A-F、FMDV-A-R及TaqMan 探针SVA-P、FMDV-O-P、TaqMan探针FMDV-A-P的引导下进行三重实时荧光定量PCR检测，PCR检测体系及检测条件参照建立实时荧光定量PCR标准曲线步骤，检测本发明塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒三重实时荧光定量PCR检测方法的重复性。

检测结果如图4和表6所示，从图中可见每个浓度梯度的扩增曲线较聚拢，循环数无明显差距，表明本发明塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒三重实时荧光定量PCR 检测方法的重复性较好，循环数标准偏差相差最高仅为0.50。

表6本发明塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒三重实时荧光定量PCR检测方法的重复性试验结果

实施例4、制备塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒三重的实时荧光定量PCR 检测试剂盒

基于实施例1和实施例2，本发明塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒三重实时荧光定量PCR检测试剂盒包括用于对塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒进行三重实时荧光定量PCR检测的引物(SVA-F、SVA-R、FMDV-O-F、FMDV-O-R、FMDV-A-F 和FMDV-A-R)和TaqMan探针(SVA-P、FMDV-O-P和FMDV-A-P)。

具体来讲，使用该试剂盒时的25μL三重实时荧光定量PCR检测体系为：实时荧光定量一步法PCR反应液2×One Step RT-PCR Buffer III 12.5μL(购于TaKaRa公司)，TaKaRaEx Taq HS 0.5μL(购于TaKaRa公司)，PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.5μL(购于TaKaRa公司)， SVA-F(10μM)0.4μL，SVA-R(10μM)0.4μL，SVA-P(10μM)0.4μL，FMDV-O-F(10μM) 0.5μL，FMDV-O-R(10μM)0.5μL，FMDV–O-P(10μM)0.5μL，FMDV-A-F(10μM)0.25μL， FMDV-A-R(10μM)0.25μL，FMDV–A-P(10μM)0.25μL，RNA-free H₂O 6.05μL，模板 RNA2.0μL。

为方便检测，试剂盒中还可包括阳性对照品和阴性对照品，阳性对照品为塞内卡病毒 RNA、O型口蹄疫病毒RNA和A型口蹄疫病毒RNA，各阳性对照品为单一包装或混合包装，阴性对照品为不含塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒的反应体系，如H₂O(双蒸水、无菌去离子水等)。使用所述试剂盒对塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒进行一步法三重实时荧光定量PCR检测时，将单一包装的阳性对照品混合或直接使用混合包装的阳性对照品。

为方便检测，试剂盒中还可包括标准品，其为分别携带塞内卡病毒核苷酸检测基因、O 型口蹄疫病毒核苷酸检测基因和A型口蹄疫病毒核苷酸检测基因的重组质粒pCR-4TOPO-SVA、pCR-4TOPO-O-FMDV和pCR-4TOPO-A-FMDV(参见实施例2)；各标准品为单一包装或等浓度混合包装；使用所述试剂盒对塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒进行一步法三重实时荧光定量PCR检测时，将单一包装的各标准品等浓度混合或直接使用混合包装的标准品。

为方便检测，试剂盒中还可包括描述各试剂的使用方法、实施例2获得的标准曲线以及对结果进行评判的说明书(参照实施例2中所述内容)。

实施例5、临床样本检测

用实施例4中的塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒三重实时荧光定量PCR 检测试剂盒对收集的14份猪场疑似塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒样品(血清，作为待测样品)中提取的基因组RNA(检测样)进行检测，以塞内卡病毒基因组RNA、 O型口蹄疫病毒基因组和A型口蹄疫病毒基因组RNA为阳性对照品，以无酶水为阴性对照品，根据三重实时荧光定量PCR检测结果，对检测样品中是否含有塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒进行定性判定，并对病毒的拷贝数进行定量。

具体检测方法与实施例2相同。

检测结果如表7所示，7-9号样品的检测结果为SVA阳性(感染塞内卡病毒)；1-6号和 10-12号样品的检测结果为O型FMDV阳性(感染O型口蹄疫病毒)；13号样品的检测结果为A型FMDV阳性(感染A型口蹄疫病毒)；14号样品SVA病毒和FMDV病毒阴性；表明7-9号样品中含塞内卡病毒，1-6号和10-12号样品中含O型口蹄疫病毒，13号样品中含A型口蹄疫病毒，14号样品中不含SVA和FMDV。

表7 14份猪场疑似塞内卡病毒和O型和A型口蹄疫病毒样品三重实时荧光定量PCR检测结果

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 金宇保灵生物药品有限公司

<120> SVA、O型FMDV和A型FMDV的一步法三重实时荧光定量PCR检测引物和探针

<160> 27

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tatctcagat ccctggctgt c 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cctgatgatc acattgttga gc 22

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cacgcttacg gcgagcgtcg catcaag 27

<210> 4

<211> 257

<212> DNA

<213> 塞内卡病毒(Seneca Virus A)

<400> 4

tggctccttc gaggctctca tctctcactt tttcaccgtg gacaatggtt ttagccctgc 60

gctgggaccg tatctcagat ccctggctgt ctcggtgcac gcttacggcg agcgtcgcat 120

caagattacc ggtggcctcc cctccggttg tgccgcgacc agcctgctga acacagtgct 180

caacaatgtg atcatcagga ctgctctggc attgacttac aaggaatttg aatatgacat 240

ggttgatatc atcgcct 257

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctcactgacc aacgtgagag gcgat 25

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acagcagttc tgtcacccga gt 22

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caagtgctgg ctcagaaggc ggcga 25

<210> 8

<211> 668

<212> DNA

<213> O型口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus O Type)

<400> 8

atggagcacc tgaagcagcc ttggacaaca ccaccaaccc aacggcgtac cataaggcgc 60

cgcttacccg gcttgcattg ccctacacgg caccacaccg tgttttggcc accgtttaca 120

acgggaactg caaatacgcc gggggctcac tgaccaacgt gagaggcgat ctccaagtgc 180

tggctcagaa ggcggcgagg ccgctgccta cttctttcaa ctacggtgcc atcaaagcca 240

ctcgggtgac agaactgctg taccgcatga agagggccga gacgtactgt cctcggcccc 300

tcttggctgt tcacccgagt gcggctagac acaaacagaa aatagtggca cctgcaaagc 360

agtccttgaa ctttgatctg ctcaagttgg caggggacgt ggagtccaac cctgggccct 420

tcttcttctc tgacgtcagg tcaaacttca ccaaactggt ggaaaccatc aaccagatgc 480

aagaggacat gtcaacaaaa cacggacccg actttaaccg gttggtatcc gcgtttgagg 540

aattggccac tggggtgaaa gccatcagga ccggcctcga cgaggccaaa ccctggtaca 600

agctcatcaa gctcctgagc cgcttgtcat gcatggccgc tgtagcagca cggtccaagg 660

acccagtc 668

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agcctgtgag ccccacacat gtc 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aagccgygtg aacggygctt tgt 23

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tcatgcarac acaccarcac gggct 25

<210> 12

<211> 562

<212> DNA

<213> A型口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus A Type)

<400> 12

tgacccccgt gcgcaaacca ccgccaccgg ggaatcagca gaccctgtca caaccgccgt 60

tgagaactac ggtggtgaga cacaagcaca gcgacgtcac cacaccgacg tcggcttctt 120

aatggacagg ttcgtgcaga tcaagcctgt gagccccaca catgtcattg acctcatgca 180

gacacaccag cacgggctgg tgggcgccac gttgcgcgcg gctacctact acttttctga 240

tcttgagatt gtggtgagcc acacgggtaa cctaacgtgg gtacccaatg gagcacccga 300

ggcagcactg aacaacacga gcaaccccac tgcttaccac aaagcgccgt tcacgaggct 360

tgcgctcccc tacaccgcgc cacaccgcgt gctggcgact gtgtacagcg ggacgagcaa 420

gtactccaca cctcaaacac ggcgaggtga cctgggtcct ctcgcggcga ggctcgctgc 480

gcagctccct gcctccttca acttcggtgc aattcgagcc acggagatcc aagaactcct 540

tgtgcgcatg aagcgtgccg ag 562

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tataagatga ctcctgccaa c 21

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

agaatttgga agccatgctc tc 22

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ttctgtcttc cctccgactt cctctc 26

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

acagattygt gaargthaca c 21

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ccrttyggva cccaggtrag 20

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tnytggacct gatgcarayc cchbc 25

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

accacyrcya ccggggart 19

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

arsyraygtc sgtgtgstr 19

<210> 21

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cagacccbgt cacmaccacy gtbgar 26

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tggctccttc gaggctctca tc 22

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

aggcgatgat atcaaccatg tc 22

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

atggagcacc tgaagcagcc t 21

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

agcacggtcc aaggacccag tc 22

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tgacccccgt gcgcaaacca c 21

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ctcggcacgc ttcatgcgca c 21

Claims

1.用于对塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒进行三重实时荧光定量PCR检测的引物和Taqman探针，其特征在于，包括：

用于检测塞内卡病毒的上游引物(SVA-F)和下游引物(SVA-R)，所述上游引物(SVA-F)的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：1所示，下游引物(SVA-R)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示；

用于检测O型口蹄疫病毒的上游引物(FMDV-O-F)和下游引物(FMDV-O-R)，所述上游引物(FMDV-O-F)的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：5所示，下游引物(FMDV-O-R)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：6所示；

2.根据权利要求1所述的引物和TaqMan探针，其特征在于：

用于对塞内卡病毒进行实时荧光定量PCR检测的TaqMan探针(SVA-P)的5’端荧光报告基团为HEX，3’端荧光淬灭基团为BHQ1；

用于对O型口蹄疫病毒进行实时荧光定量PCR检测的TaqMan探针(FMDV-O-P)的5’端荧光报告基团为FAM，3’端荧光淬灭基团为TAMRA；

用于对A型口蹄疫病毒进行实时荧光定量PCR检测的TaqMan探针(FMDV-A-P)的5’端荧光报告基团为ROX，3’端荧光淬灭基团为BHQ2；

所述探针的3’端已经磷酸化处理。

3.用于对塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒进行一步法三重实时荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于：

包括权利要求1或2所述的引物和TaqMan探针；

使用所述试剂盒时的25μL实时荧光定量PCR检测体系中所述引物和TaqMan探针的用量优选为：SVA-F(10μM) 0.4μL，SVA-R(10μM) 0.4μL，SVA-P(10μM) 0.4μL，FMDV-O-F(10μM)0.5μL，FMDV-O-R(10μM) 0.5μL，FMDV–O-P(10μM) 0.5μL，FMDV-A-F(10μM) 0.25μL，FMDV-A-R(10μM) 0.25μL，FMDV–A-P(10μM) 0.25μL。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：试剂盒中还包括阳性对照品和阴性对照品，阳性对照品为塞内卡病毒RNA、O型口蹄疫病毒RNA和A型口蹄疫病毒RNA，各阳性对照品为单一包装或混合包装，阴性对照品为不含塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒的反应体系，如H₂O(双蒸水、无菌去离子水等)；

使用所述试剂盒对塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒进行一步法三重实时荧光定量PCR检测时，将单一包装的阳性对照品混合或直接使用混合包装的阳性对照品。

5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于：试剂盒中还包括标准品，其为分别携带塞内卡病毒核苷酸检测基因、O型口蹄疫病毒核苷酸检测基因和A型口蹄疫病毒核苷酸检测基因的重组质粒pCR-4 TOPO-SVA、pCR-4 TOPO-O-FMDV和pCR-4 TOPO-A-FMDV；各标准品为单一包装或等浓度混合包装；

使用所述试剂盒对塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒进行一步法三重实时荧光定量PCR检测时，将单一包装的各标准品等浓度混合或直接使用混合包装的标准品。

6.权利要求3或4或5所述的试剂盒在对塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒进行非疾病诊断目的的一步法检测中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：

用于对塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒进行定性、定量检测，包括以下步骤：

1)建立标准曲线：将分别携带塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒的检测基因的重组质粒pCR4-TOPO-SVA、pCR4-TOPO-O-FMDV和pCR4-TOPO-A-FMDV的单一包装的标准品等浓度混合或直接使用等浓度混合包装的标准品，按照10倍梯度将混合液中的各标准品浓度稀释至1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹copies/μL，以不同浓度的标准品混合液作为模板，在权利要求1或2所述的引物和TaqMan探针的引导下进行三重实时荧光定量PCR检测，检测结束后，以各标准品的浓度Log值(X轴)对其相应Ct值(Y轴)作图，绘制标准曲线；

2)提取待测样品的基因组RNA，以提取的基因组RNA为模板，在权利要求1或2所述的引物和TaqMan探针的引导下进行三重实时荧光定量PCR检测；

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：

所述步骤2)中的待测样品包括用于疫苗生产的原材料、半成品及成品、猪场送检样品。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于：

所述步骤1)和步骤2)中的25μL实时荧光定量PCR检测体系包括：模板2μL，实时荧光定量一步法PCR反应液2×One Step RT-PCR Buffer III 12.5μL，TaKaRa Ex Taq HS 0.5μL，PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.5μL，SVA-F(10μM) 0.4μL，SVA-R(10μM) 0.4μL，SVA-P(10μM) 0.4μL，FMDV-O-F(10μM) 0.5μL，FMDV-O-R(10μM) 0.5μL，FMDV–O-P(10μM) 0.5μL，FMDV-A-F(10μM) 0.25μL，FMDV-A-R(10μM) 0.25μL，FMDV–A-P(10μM) 0.25μL，RNA-freeH₂O 6.05μL；

所述步骤1)和步骤2)中的三重实时荧光定量PCR检测条件为：先42℃反转录20min，95℃预变性3min；然后94℃变性15s，55℃退火30s，45个循环(PCR扩增)。

10.根据权利要求7-9任一所述的应用，其特征在于：

所述步骤3)中的判定方法为：

若样品在FMDV-O-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道在37个循环内(不包括第37个循环)出现“S”型扩增曲线，则确认为O型口蹄疫病毒阳性(样品中含有O型口蹄疫病毒)；若样品在FMDV–A-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道在37个循环内(不包括第37个循环)出现“S”型扩增曲线，则确认为A型口蹄疫病毒阳性(样品中含有A型口蹄疫病毒)；若样品在SVA-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道在37个循环内(不包括第37个循环)出现“S”型扩增曲线，则确认为塞内卡病毒阳性(样品中含有塞内卡病毒)；若样品在任一通道在39个循环以上(包括第39个循环)未出现“S”型扩增曲线，则确认为对应病毒阴性(样品中不含有塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和/或A型口蹄疫病毒)；若样品在任一通道在37-39个循环之间(包括第37个循环且不包括第39个循环)出现“S”型扩增曲线，判定为可疑，需重检；

优选地，若样品在FAM通道在37个循环内(不包括第37个循环)出现“S”型扩增曲线，则确认为O型口蹄疫病毒阳性(样品中含有O型口蹄疫病毒)；若样品在ROX通道在37个循环内(不包括第37个循环)出现“S”型扩增曲线，则确认为A型口蹄疫病毒阳性(样品中含有A型口蹄疫病毒)；若样品在HEX通道在37个循环内(不包括第37个循环)出现“S”型扩增曲线，则确认为塞内卡病毒阳性(样品中含有塞内卡病毒)；若样品在任一通道在39个循环以上(包括第39个循环)未出现“S”型扩增曲线，则确认为对应病毒阴性(样品中不含有塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和/或A型口蹄疫病毒)；若样品在任一通道在37-39个循环之间(包括第37个循环且不包括第39个循环)出现“S”型扩增曲线，则判定为可疑，需重检。