CN110964856A - 一种同时检测sva和fmdv的多重荧光定量rt-pcr试剂盒及检测方法 - Google Patents
一种同时检测sva和fmdv的多重荧光定量rt-pcr试剂盒及检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110964856A CN110964856A CN201911336273.2A CN201911336273A CN110964856A CN 110964856 A CN110964856 A CN 110964856A CN 201911336273 A CN201911336273 A CN 201911336273A CN 110964856 A CN110964856 A CN 110964856A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fmdv
- sva
- type
- detection
- pcr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 title claims abstract description 75
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 72
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 36
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 31
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 20
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 45
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 45
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 44
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 23
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 22
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 22
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 20
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 claims description 14
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 13
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 claims description 8
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 claims description 8
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 8
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 8
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 8
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 claims description 7
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 claims description 7
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 claims description 7
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 claims description 7
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 6
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 6
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 6
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 4
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 4
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 4
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 238000004064 recycling Methods 0.000 claims description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 4
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 claims description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 19
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 7
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 5
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 5
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 208000007212 Foot-and-Mouth Disease Diseases 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 241001673669 Porcine circovirus 2 Species 0.000 description 2
- 241001135989 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Species 0.000 description 2
- 241000709710 Swine vesicular disease virus Species 0.000 description 2
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- LXWYCLOUQZZDBD-LIYNQYRNSA-N csfv Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXWYCLOUQZZDBD-LIYNQYRNSA-N 0.000 description 2
- 210000000003 hoof Anatomy 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 206010020565 Hyperaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010024264 Lethargy Diseases 0.000 description 1
- 206010060860 Neurological symptom Diseases 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 206010042434 Sudden death Diseases 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 208000022531 anorexia Diseases 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 206010061428 decreased appetite Diseases 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000011841 epidemiological investigation Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 244000144980 herd Species 0.000 description 1
- 208000021760 high fever Diseases 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000002969 morbid Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种同时检测SVA和FMDV的多重荧光定量RT‑PCR试剂盒及检测方法，该试剂盒是针对SVA，O型、A型、亚洲I型FMDV设计的四种特异性引物和四种TaqMan探针，经优化反应条件，建立了同时检测SVA，O型、A型、亚洲I型FMDV的TaqMan荧光定量RT‑PCR方法，所建立的方法与普通多重RT‑PCR方法相比，特异性更强、敏感性更高、重复性更好，并且应用该方法对临床样品的检测进一步证实其可靠性、实用性，为SVA，O型、A型、亚洲I型FMDV的临床检测和流行病学调查提供了简便、快速、高效的技术手段。
Description
技术领域
本发明属于动物病毒学和分子生物学技术领域，具体涉及一种同时检测SVA和FMDV的多重荧光定量RT-PCR试剂盒及检测方法。
背景技术
A型塞尼卡病毒(Senecavirus A,SVA)，曾用名塞尼卡谷病毒(Senaca Vallyvirus,SVV)，属于小RNA病毒科塞尼卡病毒属。2007年，位于加拿大中南部的一家猪场发生原发性水疱病(Porcine idiopathic vesicular disease,PIVD)，病猪的鼻镜及蹄冠等部位出现水疱，并伴发高热等症状。针对口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)、猪水疱病病毒(Swine vesicular disease virus,SVDV)、猪水疱性口炎病毒(Swinevesicular disease virus,VSV)及猪水疱疱疹病毒(Vesicular exanthema of swinevirus,VESV)的病原筛查结果均为阴性，最终SVA被证实是该病的病原。随后，美国、巴西、中国、哥伦比亚、泰国、越南等国家相继报道SVA感染猪群发病，在世界各国呈迅速蔓延之势。SVA的临床症状与口蹄疫(FMD)极为相似，成猪主要表现为厌食、发烧，口腔、鼻镜及蹄部出现水疱。产房仔猪，尤其是1日龄～4日龄的新生仔猪，感染后出现昏睡、皮肤充血、腹泻、神经症状及突然死亡。SVA发病率因不同生长阶段的猪群而异，断奶仔猪的发病率为0.5％～5％，育肥猪及后备猪的发病率为5％～30％，而新生仔猪的发病率可高达70％、死亡率可达15％～30％。自2015年我国首次在广东省报道SVA感染猪群后，现已蔓延至湖北、黑龙江、福建及河南等多个省份，造成巨大的经济损失，是当前国内防控的重点疫病。而SVA与FMDV感染猪群的临床症状、病理变化极为相似，临床上难以区分，需借助实验室检测才能鉴别诊断。当前，国内外已有学者建立了SVA、FMDV与其它病毒鉴别检测的多重RT-PCR和多重荧光定量RT-PCR方法。但是，迄今尚未见能够区分检测SVA与O型、A型、亚洲I型FMDV多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法的报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中存在的不足，提供一种同时检测SVA和FMDV的多重荧光定量RT-PCR试剂盒及检测方法，为SVA与O型、A型、亚洲I型FMDV的临床检测和流行病学调查提供了简便、快速、高效的技术手段。
本发明的方案是通过这样实现的：
一种同时检测SVA和FMDV的多重荧光定量RT-PCR试剂盒，包括四对引物及相应的四种TaqMan探针，它们分别针对SVA，O型、A型、亚洲I型FMDV的四种猪病毒；
所述的四对引物分别为：
用于检测SVA的引物：
SVA-Fq：5'-TTAAAGAATTTGGAAGCCATGCT-3'(SEQIDNO1)；
SVA-Rq：5'-AACAGATTGCAGCTTCTCGAGTAG-3'(SEQIDNO2)；
用于检测O型FMDV的引物：
FMDV-O-Fq：5'-AACAGCTGAGGAYTTYGTGAGC-3'(SEQIDNO4)；
FMDV-O-Rq：5'-GAATGAGTCGYTGGTGMC-3'(SEQIDNO5)；
用于检测A型FMDV的引物：
FMDV-A-Fq：5'-CATGAAGCGTGCTGAGCTCTA-3'(SEQIDNO7)；
FMDV-A-Rq：5'-GTCTTGCGCTGTCACTTCCA-3'(SEQIDNO8)；
用于检测亚洲I型FMDV的引物：
FMDV-Asia I-Fq：5'-CCTTCAACTACGGCGCAGTT-3'(SEQIDNO10)；
FMDV-Asia I-Rq：5'-TGTCTCCGCGCGTTTCAT-3'(SEQIDNO11)；
所述的四种TaqMan探针分别为：
用于检测SVA的TaqMan探针：
SVA-P：CY5-CCTACTTCAAACCAGGAAC-BHQ3(SEQIDNO3)；
用于检测O型FMDV的TaqMan探针：
FMDV-O-P：FAM-AACGGTTCTTCAAAACCCACCTGTT-BHQ1(SEQIDNO6)；
用于检测A型FMDV的TaqMan探针：
FMDV-A-P：TXR-TGCCCCAGGCCACTACTGGCA-BHQ2(SEQIDNO9)；
用于检测亚洲I型FMDV的TaqMan探针：
FMDV-Asia I-P：JOE-CGAAAACATCACTGAGCTGCTGATCCG-BHQ1(SEQIDNO12)。
一种同时检测SVA和FMDV的多重荧光定量RT-PCR的检测方法，所述的方法是同时检测SVA，O型、A型、亚洲I型FMDV的四种猪病毒的多重荧光定量RT-PCR检测方法。
同时检测SVA和FMDV的多重荧光定量RT-PCR的检测方法，具体包括以下步骤：
步骤(1)重组质粒标准品的构建：取SVA GD株、FMDV O型O/Mya98/XJ/2010株、A型AF/72株、亚洲I型JSL株病毒液200μL，采用MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction KitVer.5.0病毒核酸提取试剂盒分别提取上述病毒株的RNA，然后使用PrimeScriptⅡ1ststrand cDNA Synthesis Kit cDNA合成试剂盒反转录为cDNA，将上述得到的cDNA分别作为模板进行PCR扩增，然后使用通用型DNA纯化回收试剂盒回收、纯化得到PCR产物，连接至pMD18-T载体、转化DH5α感受态细胞，筛选阳性菌落并进行扩大培养，然后用Mini PlasmidKit质粒抽提试剂盒抽提质粒，进行PCR、酶切及测序鉴定，将经鉴定正确的重组质粒作为阳性标准品，分别命名为pSVA-3D、pO-VP1、pA-VP1、pAsia I-VP1；
步骤(2)待检测样品处理：取临床疑似样品，用灭菌剪刀将淋巴结、痂皮等组织样品剪成小块，放入灭菌离心管中，加入适量(W/V，1:4)pH 7.2PBS溶液，反复冻融3次；放置病料磨碎仪中研磨至糜状，12 000×g离心3min，取200μL上清，应用MiniBEST Viral RNA/DNAExtraction Kit Ver.5.0试剂盒提取总RNA，按照PrimeScriptⅡ1st strand cDNASynthesis Kit试剂盒说明书反转录获得cDNA，直接作为模板或置于-20℃下保存备用；
步骤(3)TaqMan荧光定量PCR扩增反应：将步骤(1)中得到的阳性标准品和步骤(2)中得到的cDNA分别作为检测模板进行TaqMan荧光定量PCR扩增反应；将同时检测SVA和FMDV的多重荧光定量RT-PCR试剂盒中的引物和TaqMan探针分别用双蒸水稀释成20pmol/μL的溶液，然后与检测模板、Premix Ex TaqTM试剂和双蒸水混合得到扩增反应体系溶液，所述的扩增反应体系溶液具体由以下体积的组分组成：Premix Ex TaqTM 10μL，SVA-Fq 0.5μL，SVA-Rq 0.5μL，SVA-P 0.4μL，FMDV-O-Fq 0.3μL，FMDV-O-Rq 0.3μL，FMDV-O-P 0.3μL，FMDV-A-Fq0.5μL，FMDV-A-Rq 0.5μL，FMDV-A-P 0.4μL，FMDV-Asia I-Fq 0.5μL，FMDV-Asia I-Rq 0.5μL，FMDV-Asia I-P 0.4μL，检测模板2.0μL，双蒸水2.9μL；接着将所得到的扩增反应体系溶液在荧光定量PCR仪中依次进行如下扩增反应程序：95℃预变性30s，95℃变性5s，58℃退火延伸34s，重复循环进行上述的变性和退火延伸程序共40次，同时收集荧光信号；
步骤(4)结果检测：通过荧光定量PCR仪自带软件绘制扩增曲线并读取相应的Ct值并进行结果判定。
作为本发明的进一步说明，所述的结果判定方法是根据扩增曲线和Ct值，当Ct值≤35个循环时可判断结果为阳性，否则即为阴性。
作为本发明的进一步说明，所述的双蒸水为灭菌双蒸水。
作为本发明的进一步说明，所述的酶切采用EcoR I内切酶和HindⅢ内切酶。
本发明具备以下良好效果：
1.本发明的多重荧光定量RT-PCR试剂盒及检测方法，能够同时检测SVA，O型、A型、亚洲I型FMDV并且特异性强，仅能特异性扩增SVA，O型、A型、亚洲I型FMDV，与其他主要猪源病毒无交叉反应。
2.本发明的多重荧光定量RT-PCR试剂盒及检测方法敏感性高，对SVA，O型、A型、亚洲I型FMDV重组质粒标准品的检出下限分别为2.50×101拷贝/μL、2.50×102拷贝/μL、2.50×102拷贝/μL及2.50×102拷贝/μL，普通的多重RT-PCR的方法中对SVA，O型、A型、亚洲I型FMDV重组质粒标准品的检出下限分别为2.50×102拷贝/μL、2.50×103拷贝/μL、2.50×102拷贝/μL及2.50×103拷贝/μL。
3.本发明的多重荧光定量RT-PCR试剂盒及检测方法重复性好，组内与组间重复性试验的变异系数均小于2％。
4.本发明的多重荧光定量RT-PCR试剂盒及检测方法应用于检测2019年来自广西省的30份临床疑似样品，SVA和O型FMDV的检出阳性率分别为20.0％和70.0％，而未能检出A型和亚洲I型FMDV，而采用普通的RT-PCR检测时SVA和O型FMDV的检出阳性率分别为16.67％和26.67％，本发明的试剂盒和检测方法准确性较高，本发明的多重荧光定量RT-PCR试剂盒及检测方法为SVA，O型、A型、亚洲I型FMDV的临床检测和流行病学调查提供了简便、快速、高效的技术手段。
附图说明
图1是实施例1中通过构建重组质粒标准品得到的pSVA-3D电泳图，图中：M为：DL1500 DNA Marker；1为：重组质粒EcoR I+HindⅢ酶切产物；2为：重组质粒PCR产物。
图2是实施例1中通过构建重组质粒标准品得到的pO-VP1电泳图，图中：M为：DL1500 DNA Marker；1为：重组质粒EcoR I+HindⅢ酶切产物；2为：重组质粒PCR产物。
图3是实施例1中通过构建重组质粒标准品得到的pA-VP1电泳图，图中：M为：DL1500 DNA Marker；1为：重组质粒EcoR I+HindⅢ酶切产物；2为：重组质粒PCR产物。
图4是实施例1中通过构建重组质粒标准品得到的pAsia I-VP1电泳图，图中：M为：DL1 500 DNA Marker；1为：重组质粒EcoR I+HindⅢ酶切产物；2为：重组质粒PCR产物。
图5是实施例1中以重组质粒标准品pSVA-3D为模板进行扩增获得的扩增曲线，图中曲线1～8分别表示pSVA-3D的浓度为：2.50×108拷贝/μL、2.50×107拷贝/μL、2.50×106拷贝/μL、2.50×105拷贝/μL、2.50×104拷贝/μL、2.50×103拷贝/μL、2.50×102拷贝/μL、2.50×101拷贝/μL。
图6是实施例1中以重组质粒标准品pO-VP1为模板进行扩增获得的扩增曲线，图中曲线1～8分别表示pO-VP1的浓度为：2.50×108拷贝/μL、2.50×107拷贝/μL、2.50×106拷贝/μL、2.50×105拷贝/μL、2.50×104拷贝/μL、2.50×103拷贝/μL、2.50×102拷贝/μL、2.50×101拷贝/μL。
图7是实施例1中以重组质粒标准品pA-VP1为模板进行扩增获得的扩增曲线，图中曲线1～8分别表示pA-VP1的浓度为：2.50×108拷贝/μL、2.50×107拷贝/μL、2.50×106拷贝/μL、2.50×105拷贝/μL、2.50×104拷贝/μL、2.50×103拷贝/μL、2.50×102拷贝/μL、2.50×101拷贝/μL。
图8是实施例1中以重组质粒标准品pAsia I-VP1为模板进行扩增获得的扩增曲线，图中曲线1～8分别表示pAsia I-VP1的浓度为：2.50×108拷贝/μL、2.50×107拷贝/μL、2.50×106拷贝/μL、2.50×105拷贝/μL、2.50×104拷贝/μL、2.50×103拷贝/μL、2.50×102拷贝/μL、2.50×101拷贝/μL。
图9是实施例1中以重组质粒标准品pSVA-3D、pO-VP1、pA-VP1和pAsiaI-VP1为模板进行扩增获得的相应标准曲线，图中曲线1为pSVA-3D的标准曲线：R2＝0.999；图中曲线2为pO-VP1的标准曲线：R2＝0.999；图中曲线3为pA-VP1的标准曲线：R2＝0.998；图中曲线4为pAsia I-VP1的标准曲线：R2＝0.999。
图10是实施例1中特异性试验所得到的扩增曲线：图中，曲线1为pO-VP1，曲线2为pSVA-3D，曲线3为pA-VP1，曲线4为pAsia I-VP1，曲线5为O型FMDV，曲线6为SVA，曲线7为A型FMDV，曲线8为亚洲I型FMDV，曲线9-14分别为：CSFV、PRRSV、PRV、PPV、PCV2、PCV3，15为阴性对照。
图11是实施例1中采用本发明方法检测pSVA-3D、pO-VP1、pA-VP1、pAsia I-VP1的敏感性试验所得到的pSVA-3D的扩增曲线，图中曲线1～9分别表示pSVA-3D的浓度为：2.50×108拷贝/μL、2.50×107拷贝/μL、2.50×106拷贝/μL、2.50×105拷贝/μL、2.50×104拷贝/μL、2.50×103拷贝/μL、2.50×102拷贝/μL、2.50×101拷贝/μL、2.50×100拷贝/μL。
图12是实施例1中采用本发明方法检测pSVA-3D、pO-VP1、pA-VP1、pAsia I-VP1的敏感性试验所得到的pO-VP1的扩增曲线，图中曲线1～9分别表示pO-VP1的浓度为：2.50×108拷贝/μL、2.50×107拷贝/μL、2.50×106拷贝/μL、2.50×105拷贝/μL、2.50×104拷贝/μL、2.50×103拷贝/μL、2.50×102拷贝/μL、2.50×101拷贝/μL、2.50×100拷贝/μL。
图13是实施例1中采用本发明方法检测pSVA-3D、pO-VP1、pA-VP1、pAsia I-VP1的敏感性试验所得到的pA-VP1的扩增曲线，图中曲线1～9分别表示pA-VP1的浓度为：2.50×108拷贝/μL、2.50×107拷贝/μL、2.50×106拷贝/μL、2.50×105拷贝/μL、2.50×104拷贝/μL、2.50×103拷贝/μL、2.50×102拷贝/μL、2.50×101拷贝/μL、2.50×100拷贝/μL。
图14是实施例1中采用本发明方法检测pSVA-3D、pO-VP1、pA-VP1、pAsia I-VP1的敏感性试验所得到的pAsia I-VP1的扩增曲线，图中曲线1～9分别表示pAsia I-VP1的浓度为：2.50×108拷贝/μL、2.50×107拷贝/μL、2.50×106拷贝/μL、2.50×105拷贝/μL、2.50×104拷贝/μL、2.50×103拷贝/μL、2.50×102拷贝/μL、2.50×101拷贝/μL、2.50×100拷贝/μL。
图15是实施例1中采用本发明方法检测部分临床样品检测结果的扩增曲线，图中曲线1为阳性对照的O型FMDV，曲线2为阳性对照的A型FMDV，曲线3为阳性对照的SVA，曲线4为阳性对照的亚洲I型FMDV，曲线5～12为O型FMDV，曲线13～17为SVA，曲线18为阴性对照。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：
一种同时检测SVA和FMDV的多重荧光定量RT-PCR试剂盒，包括四对引物及相应的四种TaqMan探针，它们分别针对SVA，O型、A型、亚洲I型FMDV的四种猪病毒；
所述的四对引物分别为：
用于检测SVA的引物：
SVA-Fq：5'-TTAAAGAATTTGGAAGCCATGCT-3'；
SVA-Rq：5'-AACAGATTGCAGCTTCTCGAGTAG-3'；
用于检测O型FMDV的引物：
FMDV-O-Fq：5'-AACAGCTGAGGAYTTYGTGAGC-3'；
FMDV-O-Rq：5'-GAATGAGTCGYTGGTGMC-3'；
用于检测A型FMDV的引物：
FMDV-A-Fq：5'-CATGAAGCGTGCTGAGCTCTA-3'；
FMDV-A-Rq：5'-GTCTTGCGCTGTCACTTCCA-3'；
用于检测亚洲I型FMDV的引物：
FMDV-Asia I-Fq：5'-CCTTCAACTACGGCGCAGTT-3'；
FMDV-Asia I-Rq：5'-TGTCTCCGCGCGTTTCAT-3'；
所述的四种TaqMan探针分别为：
用于检测SVA的TaqMan探针：
SVA-P：CY5-CCTACTTCAAACCAGGAAC-BHQ3；
用于检测O型FMDV的TaqMan探针：
FMDV-O-P：FAM-AACGGTTCTTCAAAACCCACCTGTT-BHQ1；
用于检测A型FMDV的TaqMan探针：
FMDV-A-P：TXR-TGCCCCAGGCCACTACTGGCA-BHQ2；
用于检测亚洲I型FMDV的TaqMan探针：
FMDV-Asia I-P：JOE-CGAAAACATCACTGAGCTGCTGATCCG-BHQ1。
一种同时检测SVA和FMDV的多重荧光定量RT-PCR的检测方法，所述的方法是同时检测SVA，O型、A型、亚洲I型FMDV的四种猪病毒的多重荧光定量RT-PCR检测方法。
同时检测SVA和FMDV的多重荧光定量RT-PCR的检测方法，具体包括以下步骤：
步骤(1)重组质粒标准品的构建：取SVA GD株、FMDV O型O/Mya98/XJ/2010株、A型AF/72株、亚洲I型JSL株病毒液200μL，采用MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction KitVer.5.0病毒核酸提取试剂盒分别提取上述病毒株的RNA，然后使用PrimeScriptⅡ1ststrand cDNA Synthesis Kit cDNA合成试剂盒反转录为cDNA，将上述得到的cDNA分别作为模板进行PCR扩增，然后使用通用型DNA纯化回收试剂盒回收、纯化得到PCR产物，连接至pMD18-T载体、转化DH5α感受态细胞，筛选阳性菌落并进行扩大培养，然后用Mini PlasmidKit质粒抽提试剂盒抽提质粒，进行PCR、采用EcoR I内切酶和HindⅢ内切酶进行酶切及测序鉴定；将经鉴定正确的重组质粒作为阳性标准品，分别命名为pSVA-3D、pO-VP1、pA-VP1、pAsia I-VP1；应用核酸蛋白分析仪测定浓度，分别将其换算为拷贝数；拷贝数计算公式：拷贝数(copies/ml)＝6.02×1023拷贝数/摩尔×(浓度)/(MW g/mol)；阳性标准品的构建情况如图1、图2、图3、图4所示；
步骤(2)待检测样品处理：取临床疑似样品，用灭菌剪刀将淋巴结、痂皮等组织样品剪成小块，放入灭菌离心管中，加入适量(W/V，1:4)pH 7.2PBS溶液，反复冻融3次；放置病料磨碎仪中研磨至糜状，12 000×g离心3min，取200μL上清，应用MiniBEST Viral RNA/DNAExtraction Kit Ver.5.0试剂盒提取总RNA，按照PrimeScriptⅡ1st strand cDNASynthesis Kit试剂盒说明书反转录获得cDNA，直接作为模板或置于-20℃下保存备用；
步骤(3)TaqMan荧光定量PCR扩增反应：将步骤(1)中得到的阳性标准品和步骤(2)中得到的cDNA分别作为检测模板进行TaqMan荧光定量PCR扩增反应；将同时检测SVA和FMDV的多重荧光定量RT-PCR试剂盒中的引物和TaqMan探针分别用灭菌双蒸水稀释成20pmol/μL的溶液，然后与检测模板、Premix Ex TaqTM试剂和灭菌双蒸水混合得到扩增反应体系溶液，所述的扩增反应体系溶液具体由以下体积的组分组成：Premix Ex TaqTM 10μL，SVA-Fq 0.5μL，SVA-Rq 0.5μL，SVA-P 0.4μL，FMDV-O-Fq 0.3μL，FMDV-O-Rq 0.3μL，FMDV-O-P 0.3μL，FMDV-A-Fq 0.5μL，FMDV-A-Rq 0.5μL，FMDV-A-P 0.4μL，FMDV-Asia I-Fq 0.5μL，FMDV-AsiaI-Rq 0.5μL，FMDV-Asia I-P 0.4μL，检测模板2.0μL，双蒸水2.9μL；接着将所得到的扩增反应体系溶液在荧光定量PCR仪中依次进行如下扩增反应程序：95℃预变性30s，95℃变性5s，58℃退火延伸34s，重复循环进行上述的变性和退火延伸程序共40次，同时收集荧光信号；
步骤(4)结果检测：通过荧光定量PCR仪自带软件绘制扩增曲线并读取相应的Ct值并进行结果判定；所述的结果判定方法是根据扩增曲线和Ct值，当Ct值≤35个循环时可判定结果为阳性，否则即为阴性。
对本实施例所述的SVA与O型、A型及亚洲I型FMDV多重荧光定量RT-PCR试剂盒及检测方法分别进行特异性、敏感性和重复性的试验分析，具体试验分析过程如下：
S1重组质粒标准品的标准曲线制作：将质粒阳性标准品pSVA-3D、pO-VP1、pA-VP1、pAsia I-VP1分别稀释成2.50×109拷贝/μL，将4种质粒等比例混合、调整后，进行10倍系列稀释成终浓度为2.50×108拷贝/μL～2.50×101拷贝/μL，作为检测模板，并且将常规灭菌的双蒸水作为阴性对照，按照本实施例所述的方法进行多重TaqMan荧光定量PCR扩增，获得多重TaqMan荧光定量RT-PCR扩增曲线及标准曲线，结果见图5、图6、图7、图8、图9所示；结果显示，各质粒标准品浓度与Ct值之间呈现良好的线性关系，四条标准曲线的相关系数(R2)均在0.998以上。
S2特异性试验：使用MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0病毒核酸提取试剂盒分别抽提SVA，O型、A型、亚洲I型FMDV、CSFV、PRRSV总RNA，然后使用PrimeScriptⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit cDNA合成试剂盒分别反转录为cDNA；使用MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0病毒核酸提取试剂盒分别抽提PRV、PPV、PCV2、PCV3总DNA，然后将得到的cDNA和DNA以及pSVA-3D、pO-VP1、pA-VP1、pAsia I-VP1四种重组质粒标准品为检测模板，按照本实施例所述的方法进行多重TaqMan荧光定量RT-PCR扩增。结果显示，仅有四种重组质粒标准品、SVA、O型、A型及亚洲I型FMDV的cDNA有扩增曲线，且Ct值小于35个循环，检测结果为阳性；而其他病毒检测结果均为阴性，结果见图10所示。所以表明本发明的检测方法与其它病毒没有交叉反应，具有较强的特异性。
S3敏感性试验：将质粒阳性标准品pSVA-3D、pO-VP1、pA-VP1、pAsia I-VP1分别稀释成2.50×109拷贝/μL，将4种质粒等比例混合、调整后，进行10倍系列稀释成终浓度为2.50×108拷贝/μL～2.50×100拷贝/μL，作为检测模板，按照本实施例所述的方法进行检测，用于测定多重TaqMan荧光定量RT-PCR的敏感性试验，结果如图11、图12、图13、图14所示。结果显示，Ct值在35个循环以内时，pSVA-3D、pO-VP1、pA-VP1、pAsia I-VP1的检出下限分别为2.50×101拷贝/μL、2.50×102拷贝/μL、2.50×102拷贝/μL、2.50×102拷贝/μL。结果表明该方法敏感性较高。
S4重复性试验：将质粒阳性标准品pSVA-3D、pO-VP1、pA-VP1、pAsia I-VP1分别稀释成2.50×109拷贝/μL，将4种质粒等比例混合、调整后，进行10倍系列稀释成终浓度为2.50×108拷贝/μL～2.50×101拷贝/μL，作为检测模板，分别取稀释浓度为2.05×107拷贝/μL、2.05×105拷贝/μL、2.05×103拷贝/μL的质粒标准品混合物作为检测模版，按照本实施例所述的方法进行检测，分别进行组内和组间重复性试验，组内重复性试验重复5次反应；组间重复性试验重复5次反应，间隔1周进行，具体结果见表1。结果显示，组内及组间重复性试验Ct值的变异系数均小于2％，表明该方法具有良好的重复性。
表1多重TaqMan荧光定量RT-PCR重复性试验
S5临床样品检测验证：采集自2019年广西各地猪场临床疑似病猪的淋巴结、水疱液、痂皮等30份疑似临床样品。30份临床疑似样品，用灭菌剪刀将淋巴结、痂皮等组织样品剪成小块，放入灭菌离心管中，加入(W/V，1:4)pH 7.2PBS溶液，反复冻融3次，放置病料磨碎仪中研磨至糜状，12000×g离心3min，取200μL上清用于提取总RNA，反转录成cDNA。按照本实施例所述的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法，对30份疑似临床样品进行检测，检出SVA阳性6份，阳性率为20.0％(6/30)，检出O型FMDV 21份，阳性率为70.0％(21/30)；未检出A型及亚洲I型FMDV；同时，应用普通多重RT-PCR方法对相同病料进行检测。结果，两种方法检测样品阳性结果的符合率为90％，结果如表2所示。表明本研究建立的方法可用于临床样品检测同时准确性较高。采用本发明方法检测部分临床样品检测结果的扩增曲线如图15所示。
表2临床样品检测结果
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
序列表
<110> 广西壮族自治区动物疫病预防控制中心
<120> 一种同时检测SVA和FMDV的多重荧光定量RT-PCR试剂盒及检测方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttaaagaatt tggaagccat gct 23
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aacagattgc agcttctcga gtag 24
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cctacttcaa accaggaac 19
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aacagctgag gayttygtga gc 22
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaatgagtcg ytggtgmc 18
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aacggttctt caaaacccac ctgtt 25
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
catgaagcgt gctgagctct a 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtcttgcgct gtcacttcca 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgccccaggc cactactggc a 21
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccttcaacta cggcgcagtt 20
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tgtctccgcg cgtttcat 18
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cgaaaacatc actgagctgc tgatccg 27
Claims (5)
1.一种同时检测SVA和FMDV的多重荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于：包括四对引物及相应的四种TaqMan探针，它们分别针对SVA，O型、A型、亚洲I型FMDV；
所述的四对引物分别为：
用于检测SVA的引物：
SVA-Fq：5'-TTAAAGAATTTGGAAGCCATGCT-3'；
SVA-Rq：5'-AACAGATTGCAGCTTCTCGAGTAG-3'；
用于检测O型FMDV的引物：
FMDV-O-Fq：5'-AACAGCTGAGGAYTTYGTGAGC-3'；
FMDV-O-Rq：5'-GAATGAGTCGYTGGTGMC-3'；
用于检测A型FMDV的引物：
FMDV-A-Fq：5'-CATGAAGCGTGCTGAGCTCTA-3'；
FMDV-A-Rq：5'-GTCTTGCGCTGTCACTTCCA-3'；
用于检测亚洲I型FMDV的引物：
FMDV-Asia I-Fq：5'-CCTTCAACTACGGCGCAGTT-3'；
FMDV-Asia I-Rq：5'-TGTCTCCGCGCGTTTCAT-3'；
所述的四种TaqMan探针分别为：
用于检测SVA的TaqMan探针：
SVA-P：CY5-CCTACTTCAAACCAGGAAC-BHQ3；
用于检测O型FMDV的TaqMan探针：
FMDV-O-P：FAM-AACGGTTCTTCAAAACCCACCTGTT-BHQ1；
用于检测A型FMDV的TaqMan探针：
FMDV-A-P：TXR-TGCCCCAGGCCACTACTGGCA-BHQ2；
用于检测亚洲I型FMDV的TaqMan探针：
FMDV-Asia I-P：JOE-CGAAAACATCACTGAGCTGCTGATCCG-BHQ1。
2.一种同时检测SVA和FMDV的多重荧光定量RT-PCR的检测方法，其特征在于：所述的方法是同时检测SVA，O型、A型、亚洲I型FMDV的四种猪病毒的多重荧光定量RT-PCR检测方法。
3.根据权利要求2所述的同时检测SVA和FMDV的多重荧光定量RT-PCR的检测方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
步骤(1)重组质粒标准品的构建：取SVA GD株、FMDV O型O/Mya98/XJ/2010株、A型AF/72株、亚洲I型JSL株病毒液200μL，采用MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0病毒核酸提取试剂盒分别提取上述病毒株的RNA，然后使用PrimeScriptⅡ1st strandcDNA Synthesis Kit cDNA合成试剂盒反转录为cDNA；将上述得到的cDNA分别作为模板进行PCR扩增，然后使用通用型DNA纯化回收试剂盒回收、纯化得到PCR产物，连接至pMD18-T载体、转化DH5α感受态细胞，筛选阳性菌落并进行扩大培养，然后用Mini Plasmid Kit质粒抽提试剂盒抽提质粒，进行PCR、酶切及测序鉴定，将经鉴定正确的重组质粒作为阳性标准品，分别命名为pSVA-3D、pO-VP1、pA-VP1、pAsia I-VP1；
步骤(2)待检测样品处理：取临床疑似样品，用灭菌剪刀将淋巴结、痂皮等组织样品剪成小块，放入灭菌离心管中，加入适量(W/V，1:4)pH 7.2PBS溶液，反复冻融3次；放置病料磨碎仪中研磨至糜状，12 000×g离心3min，取200μL上清，应用MiniBEST Viral RNA/DNAExtraction Kit Ver.5.0试剂盒提取总RNA，按照PrimeScriptⅡ1st strand cDNASynthesis Kit试剂盒说明书反转录获得cDNA，直接作为模板或置于-20℃下保存备用；
步骤(3)TaqMan荧光定量PCR扩增反应：将步骤(1)中得到的阳性标准品和步骤(2)中得到的cDNA分别作为检测模板进行TaqMan荧光定量PCR扩增反应；同时检测SVA和FMDV的多重荧光定量RT-PCR试剂盒中的引物和TaqMan探针分别用双蒸水稀释成20pmol/μL的溶液，然后与检测模板、Premix Ex TaqTM试剂和双蒸水混合得到扩增反应体系溶液，所述的扩增反应体系溶液具体由以下体积的组分组成：Premix Ex TaqTM 10μL，SVA-Fq 0.5μL，SVA-Rq0.5μL，SVA-P 0.4μL，FMDV-O-Fq 0.3μL，FMDV-O-Rq 0.3μL，FMDV-O-P 0.3μL，FMDV-A-Fq0.5μL，FMDV-A-Rq 0.5μL，FMDV-A-P 0.4μL，FMDV-Asia I-Fq 0.5μL，FMDV-Asia I-Rq 0.5μL，FMDV-Asia I-P 0.4μL、检测模板2.0μL、双蒸水2.9μL；接着将所得到的扩增反应体系溶液在荧光定量PCR仪中依次进行如下扩增反应程序：95℃预变性30s，95℃变性5s，58℃退火延伸34s，重复循环进行上述的变性和退火延伸程序共40次，同时收集荧光信号；
步骤(4)结果检测：通过荧光定量PCR仪自带软件绘制扩增曲线并读取相应的Ct值并进行结果判定。
4.根据权利要求3所述的同时检测SVA和FMDV的多重荧光定量RT-PCR的检测方法，其特征在于：所述的双蒸水为灭菌双蒸水。
5.根据权利要求3所述的同时检测SVA和FMDV的多重荧光定量RT-PCR的检测方法，其特征在于：所述的酶切采用EcoR I内切酶和HindⅢ内切酶。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911336273.2A CN110964856A (zh) | 2019-12-23 | 2019-12-23 | 一种同时检测sva和fmdv的多重荧光定量rt-pcr试剂盒及检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911336273.2A CN110964856A (zh) | 2019-12-23 | 2019-12-23 | 一种同时检测sva和fmdv的多重荧光定量rt-pcr试剂盒及检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110964856A true CN110964856A (zh) | 2020-04-07 |
Family
ID=70035803
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201911336273.2A Pending CN110964856A (zh) | 2019-12-23 | 2019-12-23 | 一种同时检测sva和fmdv的多重荧光定量rt-pcr试剂盒及检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110964856A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024154944A1 (ko) * | 2023-01-19 | 2024-07-25 | (주)옵토레인 | 반도체 바이오센서 기반 중합효소연쇄반응 기법을 이용한 구제역 바이러스 진단 방법 및 카트리지 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105112558A (zh) * | 2015-08-06 | 2015-12-02 | 河南省动物疫病预防控制中心 | 口蹄疫病毒O、A和AsiaⅠ型三重实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒 |
| CN108034761A (zh) * | 2017-12-14 | 2018-05-15 | 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 | 一种用于fmdv和sva鉴别的试剂、方法及应用 |
| CN110205405A (zh) * | 2017-12-25 | 2019-09-06 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种检测和鉴别塞尼卡谷病毒、口蹄疫病毒O、A和Asial型的试剂盒及引物和探针 |
| CN110305986A (zh) * | 2019-07-18 | 2019-10-08 | 金宇保灵生物药品有限公司 | Sva、o型fmdv和a型fmdv的一步法三重实时荧光定量pcr检测引物和探针 |
-
2019
- 2019-12-23 CN CN201911336273.2A patent/CN110964856A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105112558A (zh) * | 2015-08-06 | 2015-12-02 | 河南省动物疫病预防控制中心 | 口蹄疫病毒O、A和AsiaⅠ型三重实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒 |
| CN108034761A (zh) * | 2017-12-14 | 2018-05-15 | 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 | 一种用于fmdv和sva鉴别的试剂、方法及应用 |
| CN110205405A (zh) * | 2017-12-25 | 2019-09-06 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种检测和鉴别塞尼卡谷病毒、口蹄疫病毒O、A和Asial型的试剂盒及引物和探针 |
| CN110305986A (zh) * | 2019-07-18 | 2019-10-08 | 金宇保灵生物药品有限公司 | Sva、o型fmdv和a型fmdv的一步法三重实时荧光定量pcr检测引物和探针 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| GENBANK: "KR073010.1" * |
| GENBANK: "KR401154.1" * |
| GENBANK: "KT968663.1" * |
| GENBANK: "NC_011349.1" * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024154944A1 (ko) * | 2023-01-19 | 2024-07-25 | (주)옵토레인 | 반도체 바이오센서 기반 중합효소연쇄반응 기법을 이용한 구제역 바이러스 진단 방법 및 카트리지 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106957927A (zh) | 非洲猪瘟荧光pcr检测试剂、非洲猪瘟荧光pcr检测试剂盒及其应用 | |
| CN102154516B (zh) | 猪传染性胃肠炎病毒s基因荧光定量pcr检测方法及其引物 | |
| CN113755565A (zh) | 一种用于鉴别非洲猪瘟野毒与疫苗毒株的四重定量荧光探针引物组合、试剂盒及鉴别方法 | |
| CN112176105B (zh) | 病毒bvdv、brv和bcv一管多重荧光pcr检测的专用引物及其应用 | |
| CN112795706A (zh) | 非洲猪瘟病毒p72基因的荧光探针引物组、试剂盒及其应用 | |
| CN110438260B (zh) | 一种非洲猪瘟病毒核酸试纸条检测试剂盒 | |
| CN114350848B (zh) | 一种鉴别非洲猪瘟ⅰ型毒株与ⅱ型毒株的双重荧光探针引物组合、试剂盒及其应用 | |
| CN110964856A (zh) | 一种同时检测sva和fmdv的多重荧光定量rt-pcr试剂盒及检测方法 | |
| CN113136459A (zh) | 用于检测ibrv病毒的lamp引物及其方法 | |
| CN112553372A (zh) | 一种猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒3型双重荧光定量pcr检测引物和探针、试剂盒及方法 | |
| CN116790813A (zh) | 检测三种猪病毒性腹泻病原的引物组，试剂盒及方法 | |
| CN103255234B (zh) | 一种用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的试剂盒及其检测方法 | |
| CN113073147B (zh) | 鸽腺病毒b型荧光定量检测引物及试剂盒 | |
| CN111500773B (zh) | 一种流行性出血病病毒血清型鉴定荧光定量rt-pcr引物、探针和试剂盒 | |
| CN108315480B (zh) | 一种检测树鼩腺病毒的实时荧光定量pcr引物、探针和试剂盒 | |
| CN107488741B (zh) | 一种双巢式pcr检测伪狂犬病毒野毒株和基因缺失疫苗毒株的方法及其应用 | |
| CN114480737B (zh) | 一种FAdV-4 NP株特异性引物及其在重组酶介导等温核酸扩增检测中的应用 | |
| CN110607404B (zh) | 猪肠病毒g型的实时荧光定量pcr检测引物及其试剂盒 | |
| CN103882150A (zh) | 猪细环病毒ii型检测的引物、探针及实时荧光pcr检测方法 | |
| CN103882151A (zh) | 猪细环病毒i型检测的引物、探针及实时荧光pcr检测方法 | |
| CN113293235B (zh) | 一种用于蛙病毒检测的引物及其应用 | |
| CN111187859B (zh) | 用于检测丙型流感和丁型流感的双重TaqMan qPCR检测方法 | |
| CN114196789B (zh) | 一种非侵入性快速确定植物是否感染番茄黄化曲叶病毒的方法 | |
| CN112746131B (zh) | 禽偏肺病毒分型的多重荧光定量pcr检测的引物与方法 | |
| CN114672595B (zh) | 一种猪病毒性腹泻检测引物组合、检测试剂盒及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200407 |