CN108315480B

CN108315480B - 一种检测树鼩腺病毒的实时荧光定量pcr引物、探针和试剂盒

Info

Publication number: CN108315480B
Application number: CN201810231031.6A
Authority: CN
Inventors: 孙晓梅; 宋庆凯; 李晓飞; 代解杰; 罕园园
Original assignee: Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Priority date: 2018-03-20
Filing date: 2018-03-20
Publication date: 2021-01-29
Anticipated expiration: 2038-03-20
Also published as: CN108315480A

Abstract

本发明涉及一种检测树鼩腺病毒的实时荧光定量PCR引物、探针和试剂盒，属于生物技术领域。该引物是根据本实验室分离鉴定并测序的树鼩全基因组3′端保守序列设计合成，与树鼩源及其他物种常见病毒无交叉反应，探针5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团。通过本发明试剂盒检测，所得结果更加准确、可靠、稳定性好、重复性好。灵敏度高、定量快速准确、检测范围广。也可以应用于树鼩腺病毒引起的流行病学调查，还可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。

Description

一种检测树鼩腺病毒的实时荧光定量PCR引物、探针和试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测树鼩腺病毒的实时荧光定量PCR引物、探针和试剂盒，更具体涉及一种检测树鼩腺病毒的TaqMan实时荧光定量PCR引物和探针，同时还涉及树鼩腺病毒的TaqMan实时荧光定量PCR 检测试剂盒，该TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒可高效方便的对各种生物材料的树鼩源腺病毒进行定量检测和质量监控，也可以进行树鼩腺病毒的流行病学调查，还可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。

背景技术

树鼩腺病毒 (Tree Shrew Adenovirus，TAV)属于腺病毒科，哺乳动物腺病毒属。腺病毒无囊膜，病毒粒子为二十面体，直径为80～110nm，由252个壳粒组成。一般感染哺乳动物的腺病毒相对分子质量为20～25×10⁶，G+C含量为48%～61%。迄今，已发现有100多种腺病毒能感染人、哺乳动物和禽类。腺病毒分布十分广泛，一般对于人体没有致癌性，但是腺病毒感染会引起急性上呼吸道感染、急性眼结膜炎、急性出血性膀胱炎、腹泻等疾病。前期开展的相关研究表明，野生来源树鼩中腺病毒携带率较高，并有疑似病例发生，被列为树鼩实验动物微生物质量控制的检测指标之一。因此，建立一种高效、快速，可反应个体病毒载量的实时荧光定量PCR方法势在必行。

目前检测技术一般来说有血清学诊断技术、生物学试验、分子生物学诊断技术三类：a）血清学诊断技术包括免疫荧光技术（IFA）、双抗体夹心ELISA检测等。但由于所有实验均用到抗血清和抗原免疫反应，所以反应时间长、材料多、准备周期长，而且检测具有明显的滞后性，只能定性不能定量，而且重复性差。b)生物学试验包括动物实验和细胞培养。这种检测方法存在不敏感问题，而且有些样品存在抗补体活性，影响检测效果。动物实验成本较高、检测周期长，耗费大量生物资源和人力物力。c)分子生物学诊断技术，即应用PCR技术检测树鼩腺病毒持续感染。相比之下，PCR方法特异性好，检测灵敏度高，不但可以检测活病毒核酸，也能直接检测灭活的核酸片段。但普通的PCR检测方法测定的都是PCR的终产物，而不是起始的DNA或RNA拷贝数。由于PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以无法定量起始的DNA或RNA拷贝数。

近年发展起来的实时荧光定量PCR技术(Real-time fluorescence quantitativePCR)有灵敏度高、速度快、特异性好等优点。目前使用比较多的是SYBR Green I荧光染料法和Taqman法。两种方法都具有灵敏度高、检测速度快、特异性好的优点。在基因表达水平分析、病原体的定性和定量检测等方面得到广泛应用，并且已成为当前病毒核酸定量的主要方法。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种检测树鼩腺病毒的实时荧光定量PCR引物、探针及方法和试剂盒，该方法简单方便、灵敏度高且检测时间短，同时，本发明试剂盒适用于目前市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，结果更加准确、可靠、稳定性好、重复性好。灵敏度高、定量快速准确、检测范围广。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种检测树鼩腺病毒的实时荧光定量PCR引物，核苷酸序列为：

上游引物：5′-AAAGAATGCCCACCTCCCAT-3′，

下游引物：5′-CAGTGGCAGGCCATTAAGC-3′。

本发明还提供与所述引物配合使用的探针，核苷酸序列为：

5′-Fam–CTCGCCGCCGCCGGTTTCAC-Tamra-3′。

本发明同时提供含有上述引物和/或探针的试剂盒。

进一步，优选的是，所述的试剂盒还包括：还包括：标准阳性模板、阴性对照模板和实时荧光定量PCR反应液；

所述的标准阳性模板是含有阳性TAV特异性保守序列的PUC57 载体质粒；

所述的阴性对照模板为从树鼩分离出的不同于树鼩腺病毒的其它病毒。

进一步，优选的是，所述的阴性对照模板为树鼩呼肠孤病毒。

进一步，优选的是，还包括空白对照模板，所述的空白对照模板为灭菌的双蒸水。

进一步，优选的是，所述的实时荧光定量PCR 反应液包括2×iTaq^TMUniversalProbes One-Step Reaction Mix和Easy Dilution

进一步，优选的是，其工作反应体系为：

模板 3μL，

上游引物10μM 1μL，

下游引物10μM 1μL，

探针10μM 2μL，

2×iTaq^TMUniversal Probes One-Step Reaction Mix 10μL，

Easy Dilution 3μL，

总计20μL。

进一步，优选的是，其工作程序为：95℃预变性2min，95℃变性10s，58℃退火30s，共40个循环。

进一步，优选的是，标准阳性模板的质粒拷贝数为1×10⁷copies/μL。

本发明中所述引物是根据本实验室分离鉴定并测序的树鼩全基因组3′端保守序列设计合成，与树鼩源及其他物种常见病毒无交叉反应，探针5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团。使用该引物进行PCR 扩增，可实现特异性好、灵敏度高、准确型强的定性、定量检测。

通过本发明试剂盒检测，所得结果更加准确、可靠、稳定性好、重复性好。灵敏度高、定量快速准确、检测范围广。也可以应用于树鼩腺病毒引起的流行病学调查，还可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。

本发明中所述的标准阳性DNA模板核苷酸序列为：

AAAGAATGCCCACCTCCCATGTGGTGCTACACTTACTTGCTGCGCCTAGCCAACTACTTTATGTACCACAACGACCTGGCTAGTGAAACCGGCGGCGGCGAGGGCTTAATGGCCTGCCACTG。（SEQ ID NO.4）

本发明所采用的是基于TaqMan实时荧光定量PCR检测方法，其荧光信号只来源于目标序列，即不受非特异性扩增及引物二聚体的影响。除此之外，还可以利用不同探针，在一个体系中使用不同的荧光标记同时检测多种指标，达到节省实验成本的目的，并且其特异性更强、准确性更高。在样本量比较大的情况下，成本甚至可以低于染料法。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

1.简单快速：生物学试验包括动物实验和细胞培养。这种检测方法存在不敏感问题，而且有些样品存在抗补体活性，影响检测效果。动物实验成本较高、检测周期长，耗费大量生物资源和人力物力，此实时荧光定量PCR具有高灵敏性、高特异性和高准确性的特点，直接对PCR每循环一次就收集一个数据，建立实施扩增曲线，准确的确定Ct值，从而根据Ct值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的核酸定量。

2.灵敏度高：现有检测方法是从生物学效应角度检测树鼩的潜在感染，其中血清学诊断技术包括免疫荧光技术（IFA）、双抗体夹心ELISA检测等。但由于所有实验均用到抗血清和抗原免疫反应，所以反应时间长、材料多、准备周期长，而且检测具有明显的滞后性，只能定性不能定量，而且重复性差。利用本发明中的实时荧光定量PCR检测树鼩腺病毒时，可以准确定量，目标DNA在10¹~10⁸浓度范围内，都有很好的线性关系，灵敏度高可达到3.7copies/μL。

3.重复性、准确性和特异性：本发明中的引物和探针根据本实验室分离鉴定并测序的树鼩全基因组3′端保守序列设计合成，树鼩源及其他物种常见病毒无交叉反应，检测特异性强，重复性好。初步应用中检测48份样品中有19份阳性，阳性率为39.58%，最低检出浓度为3.92 copies/μL。传统方法检测阳性率仅为25%（12/48）。

附图说明

图1为阳性定量标准品质粒的结构示意图和目的片段检测结果。其中A中：M:1kbDNA marker;1：酶切后含阳性TAV特异性保守序列的PUC57 载体质粒；B中M：500 DNAmarker，1：插入阳性定量标准品质粒中的TAV特异性保守序列。

图2为标准曲线；

图3为定量曲线；其中，1为标准阳性模板；2为标准阳性模板稀释10倍；3为标准阳性模板稀释10²倍；4为标准阳性模板稀释10³倍；5为标准阳性模板稀释10⁴倍；6为标准阳性模板稀释10⁵倍；7为标准阳性模板稀释10⁶倍；8为标准阳性模板稀释10⁷倍；9为标准阳性模板稀释10⁸倍；

图4为TaqMan实时荧光定量PCR特异性检测结果。

图5为树鼩腺病毒的TaqMan实时荧光定量PCR 检测试剂盒的应用结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，实施例中未详述的方法均为本领域常规操作。

本发明除非另有说明，否则百分号代表体积百分数。

实施例1 树鼩腺病毒专用引物和探针的设计

根据本实验室分离鉴定并测序的树鼩全基因组序列（GenBank：MF780605）3′端保守序列设计合成，扩增子大小为122bp，探针5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团。使用该引物进行PCR扩增，可实现特异性好、灵敏度高、准确型强的定性、定量检测。其中优选的引物、探针序列为：

上游引物：5′-AAAGAATGCCCACCTCCCAT-3′；（SEQ ID NO.1）

下游引物：5′-CAGTGGCAGGCCATTAAGC-3′；（SEQ ID NO.2）

探针引物: 5′- Fam –CTCGCCGCCGCCGGTTTCAC- Tamra-3′。（SEQ ID NO.3）

用设计的引物、探针进行同源性比对后发现其只对树鼩腺病毒具有高度保守型，序列比对与树鼩源及其他物种常见病毒无交叉反应，其特异性较高。

实施例2 标准阳性模板的制备

以本实验室保存的阳性树鼩腺病毒DNA作为模板，进行目的基因片段扩增。

反应体系：金牌Mix(green) 20 μL，10μM 上游引物 1μL，10μM 下游引物 1μL，50ng/μL DNA模板3 μL，终体积25 μL。

试剂盒参考退火温度为55~60℃，优化后的反应条件：98℃ 2 min；98℃10s，58℃15s，72℃15s，共35个循环；72℃ 5 min。

扩增产物用体积分数为1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定；胶回收纯化；将目的基因片段与PUC57载体进行连接；连接后产物转化DH5α感受态细胞；测序验证即为标准阳性模板。采用紫外分光光度计测定A260和A280的吸收值，比较两者A260/A280的比值，并计算质粒浓度。其中若是比值在1.8-2.0之间，则可测得dsDNA的浓度（即质粒浓度）。将质粒浓度换算为质粒拷贝数[copies/μL＝质粒浓度×（6.02×10²³）×（ng/μL×10^－9）/（DNA碱基数×660）]。

本发明中重组质粒用pvuII酶切，结果见图1（A），酶切后获得两个片段，片段长度相加大小即为载体和目的基因片段之和。对重组质粒标准品进行PCR鉴定，扩增获得一条约122bp的特异片段，结果见图1（B），与预期扩增结果相符。对目的基因片段进行测序分析，NCBI比对结果同TAV 3′保守区域（22989-23476）序列完全一致，表明目的基因片段已成功接入载体中，即得标准阳性模板。

实施例3 实时荧光定量PCR 扩增方法的建立

1.实时荧光定量PCR模板制备——样品总DNA提取：

1) 向200μL样品的待检测液（如样品为组织需研磨匀浆）中加入500μL裂解液（100mmol/L Tris-Cl pH=8.5，0.1mol/L EDTA，0.5% SDS），上下颠倒混匀，5min。

2) 加入6μL蛋白酶K，55℃水浴15min，冷却。

3) 加入700μL苯酚、氯仿和异戊醇的混合溶液(体积比为25∶24∶1)，震荡混匀。

4) 10000rpm/min 离心5min取上清。

5) 重复步骤3和4，之后合并上清。

6) 加入是合并后上清2倍体积的预冷至4℃的无水乙醇和合并后上清1/10体积的3mol/L醋酸钠溶液。

7) －20℃沉淀10min。

8) 10000rpm/min 离心5min。

9) 弃上清，加入预冷至4℃、体积分数为75％的乙醇1ml洗DNA沉淀。

10)10000rpm/min 离心2min。

11)用移液枪将上清尽量去除干净，真空干燥5～10min。

12)用100ul TE溶解沉淀，得到样品总DNA。

50mL样品总DNA中含有如下成分：5mL 100mM pH=8.5的Tris-Cl、0.5mL 0.5MEDTA、1mL 体积分数为10%SDS、2mL 5M NaCl、0.25mL 0.2mg/mL 蛋白酶K 和41.25mL 灭菌的双蒸水。

2．实时荧光定量PCR反应体系

以标准阳性模板为模板，对探针、引物的不同组合进行摸索，最终确定了探针和引物的最佳组合：20μL反应体系中10μM 探针1μl、10μM 上下游引物各1μL。

具体地，进行样品测定时，以总DNA为模板，进行实时荧光定量PCR，其中反应体系为：

反应体系(20μL)：

模板 3μL

上游引物（10μM） 1μL

下游引物（10μM） 1μL

探针（10μM） 2μL

2× iTaq^TMReaction Mix 10μL

Easy Dilution 3μL

3.实时荧光定量PCR 反应条件

以上述反应体系进行实时荧光定量PCR，对反应程序中的退火温度进行摸索，确定最佳退火温度为58℃。具体反应条件为：95℃预变性2min，95℃变性10s，58℃退火30s，共40个循环。

实施例4 方法学验证

1.标准曲线的建立及实时荧光定量PCR的灵敏度

将实施例2中标准阳性模板按10倍倍比稀释至10¹ copies/μL，得到10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹ copies/μL 8个梯度的标准品。分别用8个梯度的标准品作为模板，按照实施例3中的反应体系和反应条件进行实时荧光定量PCR反应，同时，设置空白对照（空白模板为灭菌的双蒸水，目的是检测检测环境是否异常）。

随着PCR体系的每一个循环结束后测定吸光值，就得到了以循环数为横坐标、吸光值为纵坐标的定量曲线；同时得到以反应起始时质粒拷贝数的对数值为横坐标、Ct值为纵坐标的标准曲线（图2）。其中，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。相关系数R²为0.998，扩增效率为95.7%，以反应起始时质粒拷贝数的对数值为X轴，循环数（Ct值）为Y轴做回归曲线，即标准曲线(Y=－3.430logX+37.951)，具有良好的线性关系。

本发明实时荧光定量PCR的检测低限：在40个循环内出现可信Ct值的稀释低限，当每差10倍模板量，Ct值相差3.3的Ct值被认为是可信的Ct值，由图3所示的定量曲线可得出，该实时荧光定量PCR 的灵敏度可达3.7copies/μL。

研究表明，每个梯度的Ct值与该梯度的质粒拷贝数的对数存在线性关系，质粒拷贝数越多，Ct值越小。利用已知质粒拷贝数的标准阳性模板作出标准线，其中横坐标代表反应起始时质粒拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的质粒拷贝数。

2．实时荧光定量PCR 的特异性、重复性和准确性

分别用8个梯度的标准品作为模板，

将标准阳性模板稀释至3.7×10⁵copies/μL、3.7×10⁶copies/μL和3.7×10⁷copies/μL，得到三个浓度的标准阳性模板稀释品，然后分别用这三个标准阳性模板稀释品为模板，按照实施例3中的反应体系和反应条件进行实时荧光定量PCR反应，每个标准阳性模板稀释品做3个平行管，通过计算Ct均值、变异系数（即相对标准差：指标准差除以平均值，以百分数表示）分析试验的重复性。以树鼩呼肠孤病毒、EV71、人单纯疱疹病毒1型、TAV作为样品，测定TaqMan实时荧光定量PCR特异性。

本发明通过计算Ct值的变异系数对试验重复性进行评价，结果详见表1，变异系数不足0.5%。

表1 重复性检测结果

本发明特异性试验检测结果（图4）显示，在40个反应循环内，以3.7×10⁶ copies/μL的标准阳性模板稀释品和TAV为模板的PCR反应有特异性扩增曲线。以树鼩呼肠孤病毒、EV71、人单纯疱疹病毒1型为模板的PCR反应均无扩增曲线。表明建立的基于TaqMan探针实时荧光定量PCR方法具有高度特异性。

实施例5 树鼩腺病毒的实时荧光检测试剂盒

该试剂盒含有：1）上游引物、2）下游引物、3）探针、4）标准阳性模板、5）阴性对照模板、6）实时荧光定量PCR反应液。

上游引物：5′-AAAGAATGCCCACCTCCCAT-3′；

下游引物：5′-CAGTGGCAGGCCATTAAGC-3′；

探针：5′-Fam –CTCGCCGCCGCCGGTTTCAC- Tamra-3′。

扩增子大小为122bp。

标准阳性模板是含有阳性TAV特异性保守序列的PUC57 载体质粒；具体是以的阳性TAV DNA作为模板，进行目的基因片段扩增，扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定；胶回收纯化；将目的基因片段与PUC57 载体进行连接；连接后产物转化DH5α感受态细胞；测序验证即为标准阳性模板。优选标准阳性模板的质粒拷贝数为1×10⁷copies/μL。

阴性对照模板为从树鼩分离出的不同于树鼩腺病毒的其它病毒，如树鼩呼肠孤病毒。

实时荧光定量PCR 反应液包括2×iTaq^TMUniversal Probes One-Step ReactionMix和Easy Dilution。

优选还包括空白对照模板，所述的空白对照模板为灭菌的双蒸水，以用来检查检测环境是否正常。

该试剂盒的使用方法：以按实施例3.1中的方法提取的样品总DNA，分别采用样品总DNA、梯度稀释的标准阳性模板、阴性对照模板、空白对照模板为模板，按照实施例3.2的反应体系和实施例3.3的反应程序进行实时荧光定量PCR，同时参照实施例4.1的方法制作标准曲线。

工作反应体系为：

模板 3μL，

上游引物10μM 1μL，

下游引物10μM 1μL，

探针 10μM 2μL，

2×iTaq^TMUniversal Probes One-Step Reaction Mix 10μL，

Easy Dilution 3μL，

总计20μL。

反应程序：95℃预变性2min，95℃变性10s，58℃退火30s，共40个循环。

模板、上游引物、下游引物、探针、2×iTaq^TMUniversal Probes One-StepReaction Mix和Easy Dilution一起组成iTaqTM Universal Probes一步法实时荧光定量PCR反应液。

本发明从样品细胞中提取DNA，进行荧光定量PCR反应，同时引入标准阳性模板，能够定量检测未知样品。

本发明试剂盒的应用结果如图5所示，在反应的35个循环内，48份样品中有19份阳性，阳性率为39.58%，最低检出浓度为3.92copies/μL。传统方法检测阳性率仅为25%（12/48）。因此，建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法更加灵敏且高效，可更好的运用于树鼩腺病毒的检测，为其防控提供更精准的检测方法。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 中国医学科学院医学生物学研究所

<120> 一种检测树鼩腺病毒的实时荧光定量PCR引物、探针和试剂盒

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

<210> 4

<211> 122

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

Claims

1.一种检测树鼩腺病毒的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，含有PCR引物和配合使用的探针，所述PCR引物的核苷酸序列为：

上游引物：5′-AAAGAATGCCCACCTCCCAT-3′，

下游引物：5′-CAGTGGCAGGCCATTAAGC-3′，

所述探针的核苷酸序列为：

5′-Fam–CTCGCCGCCGCCGGTTTCAC-Tamra-3′。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括：标准阳性模板、阴性对照模板和实时荧光定量PCR反应液；

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的阴性对照模板为树鼩呼肠孤病毒。

4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括空白对照模板，所述的空白对照模板为灭菌的双蒸水。

5.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的实时荧光定量PCR 反应液包括2×iTaq^TM Universal Probes One-Step Reaction Mix和Easy Dilution。

6.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，其工作反应体系为：

模板 3μL，

上游引物10μM 1μL，

下游引物10μM 1μL，

探针 10μM 2μL，

2×iTaq^TM Universal Probes One-Step Reaction Mix 10μL，

Easy Dilution 3μL，

总计20μL。

7.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，其工作程序为：95℃预变性2min，95℃变性10s，58℃退火30s，共40个循环。

8.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，标准阳性模板的质粒拷贝数为1×10⁷copies/μL。