CN117721249A - 犬呼吸道病毒三重实时荧光rt-pcr引物探针组合 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种犬呼吸道病毒三重实时荧光RT‑PCR引物探针组合，所述三重实时荧光RT‑PCR引物探针组合包括用于扩增犬瘟热病毒的引物探针组合、用于扩增犬腺病毒的引物探针组合和用于扩增犬副流感病毒的引物探针组合，基于该试剂盒的RT‑PCR方法可特异性的检测目前全世界各地流行的各种类型的犬瘟热病毒、犬腺病毒以及犬副流感病毒，且灵敏度普遍高于世面上的检测试剂盒，具有灵敏度好、特异性高、用时短、稳定性高等特点。从而为检测犬呼吸道传染病病原提供重要工具，为犬呼吸道传染病诊断提供技术支持，对犬呼吸道传染病防控具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及兽医领域中的动物病毒检测技术领域，具体涉及一种犬呼吸道病毒三重实时荧光RT-PCR引物探针组合。
背景技术
犬呼吸道传染病在兽医临床诊疗中较为常见，常见引起犬呼吸道疾病的病毒性病原常见为犬瘟热病毒(Canine Distemper Virus，CDV)、犬腺病毒(Canine Adenovirustype II，CAV-II)和犬副流感病毒(Canine Parainfluenza Virus，CPIV)。犬呼吸道传染病致死率不高，但传染性强，传播迅速。随着犬群密度增加犬只越易发展、表现出传染性呼吸道疾病症状。
犬瘟热病毒感染通常引起急性或亚急性呼吸道、胃肠道甚至神经系统等多系统症状，感染还可引起全身性免疫抑制，患病动物病死率高。犬腺病毒可引起轻度呼吸道感染以及肠炎等临床症状。犬副流感病毒感染后症状轻微或无明显临床症状。单独犬腺病毒或犬副流感病毒感染引起的呼吸道症状较轻微，通常经适当的治疗和护理大部分犬只可康复。犬瘟热病毒、犬腺病毒以及犬副流感病毒单独感染皆引起的呼吸道疾病且症状相似，发生混合感染时可发展成支气管肺炎，严重威胁患犬生命健康。
临床上已发展出可有效检测的犬呼吸道病原检抗原测试剂盒，常见有胶体金免疫层析试纸条与普通PCR检测方法。胶体金免疫层析试纸条检测速度快，检测结果直观易于判定，但单次试验只能检测1种病原，多病原检测时需要使用不同检测试纸条，增加检测成本。普通PCR检测方法特异性较好、灵敏度较高、操作简单，但需通过琼脂糖凝胶电泳判定检测结果，检测耗时较长。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中存在问题的一个或多个，提供一种犬呼吸道病毒三重实时荧光RT-PCR引物探针组合，该三重实时荧光RT-PCR引物探针组合及其试剂盒能够同时检测犬瘟热病毒、犬腺病毒以及犬副流感病毒，本发明探针组合及试剂盒具有操作简单、特异性强、灵敏度高、重复性好的特点，能够能快速鉴别检测犬瘟热病毒、犬腺病毒以及犬副流感病毒。
为实现上述目的，本发明所设计的技术方案如下：
本发明提供了一种犬呼吸道病毒三重实时荧光RT-PCR引物探针组合，，所述三重实时荧光RT-PCR引物探针组合包括用于扩增犬瘟热病毒的引物探针组合、用于扩增犬腺病毒的引物探针组合和用于扩增犬副流感病毒的引物探针组合，其中，所述用于扩增犬瘟热病毒的引物探针组合包括荧光PCR特异性引物对CDV-F/R和荧光PCR TaqMan探针CDV-P，所述荧光PCR特异性引物对CDV-F/R：
上游引物CDV-F：GGTGRTGAAC TTGAAAACTC CAT，其如SEQ ID NO.1所示，
下游引物CDV-R：CTGAGCRTCR TCRTTGGTGAT，其如SEQ ID NO.2所示；
所述荧光PCR TaqMan探针CDV-P：TTCAGYCTCG GYCAAGAAAT GGT，其如SEQ ID NO.3所示；
所述用于扩增犬腺病毒的引物探针组合包括荧光PCR特异性引物对CAV-F/R和荧光PCR TaqMan探针CAV-P，所述荧光PCR特异性引物对CAV-F/R：
上游引物CAV-F：CTCAACGAGATGCCTCTTCM CA，其如SEQ ID NO.4所示，
下游引物CAV-R：CCTCCGCTTC TGACTTTAGAGA，其如SEQ ID NO.5所示；
所述荧光PCR TaqMan探针CAV-P：CATAAATGCT TCCCTCTTCT ATCCCGC，其如SEQ IDNO.6所示；
所述用于扩增犬副流感病毒的引物探针组合包括荧光PCR特异性引物对CPIV-F/R和荧光PCR TaqMan探针CPIV-P，所述荧光PCR特异性引物对CPIV-F/R：
上游引物CPIV-F：TCATTCCGCT TAATCCCCA，其如SEQ ID NO.7所示，
下游引物CPIV-R：AAGAAAGTCT CAATCTCATC CCA，其如SEQ ID NO.8所示，
所述荧光PCR TaqMan探针CPIV-P：CGTTCAGGTA TGAGCCGTGG AGAGA，其如SEQ IDNO.9所示；
上述探针CDV-P、探针CAV-P和探针CPIV-P核苷酸序列的5’端均结合有荧光报告基团，3’端均结合有荧光淬灭基团。
所述荧光PCR TaqMan探针的核苷酸序列的5’端结合有荧光报告基团，3’端结合有荧光淬灭基团。
进一步地，所述荧光PCR TaqMan探针CDV-P的5’端结合荧光报告基团为FAM，3’端结合荧光淬灭基团为BHQ1；
所述荧光PCR TaqMan探针CAV-P的5’端结合荧光报告基团为HEX，3’端结合荧光淬灭基团为BHQ1；
所述荧光PCR TaqMan探针CPIV-P的5’端结合荧光报告基团为ROX，3’端结合荧光淬灭基团为BHQ2。
本发明还提供了一种上述的三重实时荧光RT-PCR引物探针组合在制备试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种上述的三重实时荧光RT-PCR引物探针组合在同时检测犬瘟热病毒、犬腺病毒以及犬副流感病毒中的应用。
本发明还提供了一种检测犬瘟热病毒、犬腺病毒以及犬副流感病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述的三重实时荧光RT-PCR引物探针组合。
以及犬副流感病毒的荧光PCR特异性引物和荧光PCR TaqMan探针，且所述用于扩增犬瘟热病毒、犬腺病毒以及犬副流感病毒的荧光PCR特异性引物包括用于检测犬瘟热病毒的荧光PCR特异性引物、
进一步地，所述试剂盒包括qPCR Mix。
利用上述的试剂盒检测犬瘟热病毒、犬腺病毒以及犬副流感病毒的三重实时荧光RT-PCR方法，包括以下步骤：
1)建立标准曲线
a.标准品的制备：
以犬瘟热病毒基因组RNA为模板，使用下述引物：
上游引物：5’-GTTATGCTATGGGAGTTGGTGTTG-3’，
下游引物：5’-TCACTGGTTCCAGGTTGACTGAG-3’，
以上游引物反转录获得的cDNA为模板，进行PCR扩增，得到PCR产物，该PCR产物的序列如SEQ ID NO.10所示，再将PCR产物与pMD18-T载体连接，构建阳性质粒pMD18T-CDV-N，即为CDV标准品；
以犬腺病毒基因组DNA为模板，使用下述引物：
上游引物：5’-CGCGCTGAACATTACTACCTTGT-3’，
下游引物：5’-CCTAGAGCACTTCGTGTCCGCTT-3’，
进行PCR扩增，得到PCR产物，该PCR产物的序列如SEQ ID NO.11所示，再将PCR产物与pMD18-T载体连接，构建阳性质粒pMD18T-CAV-E3，即为CAV标准品；
以犬副流感病毒基因组RNA为模板，使用下述引物：
上游引物：5’-CTATTCTGCCTACGGATTGTTCTC-3’，
下游引物：5’-GATTATTCGTCGAGCCTCCG-3’，
以上游引物反转录获得的cDNA为模板，进行PCR扩增，得到PCR产物，该PCR产物的序列如SEQ ID NO.12所示，再将PCR产物与pMD18-T载体连接，构建阳性质粒pMD18T-CPIV-N，即为CPIV标准品；
b.标准曲线的建立
将上述CDV标准品、CAV标准品、CPIV标准品分别测定浓度，并计算各标准品的拷贝数，将3种标准品等浓度混合，按照10倍比将标准品混合液梯度稀释至2×106、2×105、2×104、2×103、2×102、2×101、2×100copies/μL梯度浓度作为标准样品，以不同浓度的标准样品作为模板，使用权利要求5中的引物和TaqMan探针进行荧光PCR检测，确定该试剂盒的灵敏度：
犬瘟热病毒扩增结果为最低检出限为10个拷贝；
犬腺病毒扩增结果为最低检出限为1个拷贝；
犬副流感病毒扩增结果为最低检出限为1个拷贝。
并利用基因组拷贝数的Lg值与检测的Ct值的函数关系，建立标准曲线：
犬瘟热病毒由标准曲线得到的线性方程为：
Lg(gene copies/μL)＝-3.4747x+43.980，R2＝0.9811，其中，
Y为Lg值；x为Ct值；
犬腺病毒由标准曲线得到的线性方程为：
Lg(gene copies/μL)＝-3.6903x+42.352，R2＝0.9942，其中，
Y为Lg值；x为Ct值；
犬副流感病毒由标准曲线得到的线性方程为：
Lg(gene copies/μL)＝-3.9030x+45.385，R2＝0.9967，其中，
Y为Lg值；x为Ct值；
2)待检测样品检测
a.荧光RT-PCR
收集待检测样品并提取其基因组DNA/RNA；使用权利要求5中的引物和TaqMan探针进行荧光RT-PCR扩增，采集荧光信号得到Ct值；
b.检测结果判定
若待检测样品在CDV-P的5’端结合的荧光报告基团所对应的通道中的扩增曲线为标准的S型曲线，且Ct<40时为阳性，表明该待检测样品中含有犬瘟热病毒毒株；
或，若Ct>＝40或无扩增曲线时，表明该带检测样品中不含有犬瘟热病毒毒株或犬瘟热病毒毒株含量低至无法检测到；
若待检测样品在CAV-P的5’端结合的荧光报告基团所对应的通道中的扩增曲线为标准的S型曲线，且Ct<40时为阳性，表明该待检测样品中含有犬腺病毒毒株；
或，若Ct>＝40或无扩增曲线时，表明该带检测样品中不含有犬腺病毒毒株或犬腺病毒毒株含量低至无法检测到；
若待检测样品在CPIV-P的5’端结合的荧光报告基团所对应的通道中的扩增曲线为标准的S型曲线，且Ct<40时为阳性，表明该待检测样品中含有犬副流感病毒毒株；
或，若Ct>＝40或无扩增曲线时，表明该带检测样品中不含有犬副流感病毒毒株或犬副流感病毒毒株含量低至无法检测到。
本发明的有益效果：
本发明提供的检测犬呼吸道传染病病原，包含犬瘟热病毒、犬腺病毒以及犬副流感病毒的三重实时荧光RT-PCR引物探针组合可实现一个反应同时对3种病毒实施快速鉴别诊断，可在1-2h内完成。具有操作简单、特异性强、灵敏度高于市面上其他检测试剂盒、重复性好等优点，能满足临床大批量、快速鉴别检测犬瘟热病毒、犬腺病毒以及犬副流感病毒的要求。基于该试剂盒的RT-PCR方法可特异性的检测目前全世界各地流行的各种类型的犬瘟热病毒、犬腺病毒以及犬副流感病毒，且灵敏度普遍高于世面上的检测试剂盒，具有灵敏度好、特异性高、用时短、稳定性高等特点。从而为检测犬呼吸道传染病病原提供重要工具，为犬呼吸道传染病诊断提供技术支持，对犬呼吸道传染病防控具有重要意义。
附图说明
图1为实施例5中标准品各稀释度样品进行三重实时荧光RT-PCR检测后，灵敏度实验结果图；
图中，A为CDV灵敏度扩增曲线图；
B为CAV灵敏度扩增曲线图；
C为CPIV灵敏度扩增曲线图；
图2为实施例5中标准品各稀释度样品进行三重实时荧光RT-PCR检测后，绘制的质粒基因拷贝数的Log值和荧光RT-PCR检测的Ct值之间的线性关系图，
图中，A为CDV的线性关系图，
B为CPIV的线性关系图，
C为CAV的线性关系图，
标准品拷贝数分别为2×106、2×105、2×104、2×103、2×102、2×101、2×100拷贝/μL；
图3为实施例6中使用检测犬瘟热病毒、犬腺病毒以及犬副流感病毒的三重实时荧光RT-PCR方法的特异性检测结果；
图4为实施例7中使用检测犬瘟热病毒、犬腺病毒以及犬副流感病毒的三重实时荧光RT-PCR方法的重复性检测结果；
图5为实施例9中检测犬瘟热病毒、犬腺病毒以及犬副流感病毒的三重实时荧光RT-PCR方法的流程框图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
实施例1
检测犬瘟热病毒的实时荧光RT-PCR引物探针组合的筛选
从NCBI GenBank数据库检索获得犬瘟热病毒N基因序列(截止至2023年10月1日，共720条序列)，使用PrimerPremier5软件设计引物和探针，以能对犬瘟热病毒进行检测为目标，考虑到引物的错配、Tm值以及保证使用一步法在1.5h完成检测等因素，将设计的引物和探针分别通过MEGA6软件以及Blast软件在NCBI数据库中进行比对分析，要求引物和探针序列必须覆盖所有数据库已知犬瘟热病毒序列，且与其他序列无明显配对。通过分析发现：
序列5’-GGTGTTGAACTTGAAAACTCCAT-3’、5’-CTGAGCCTCTTCCTTGGTGAT-3’和5’-TTCAGGCTCGGGCAAGAAATGGT-3’可匹配绝大部分犬瘟热病毒的序列，可作为检测犬瘟热病毒的引物探针组合，即引物对(上游引物：5’-GGTGTTGAACTTGAAAACTCCAT-3’和下游引物：5’-CTGAGCCTCTTCCTTGGTGAT-3’，以及探针5’-TTCAGGCTCGGGCAAGAAATGGT-3’)。
进一步分析发现引物和犬瘟热病毒序列匹配时，上游引物处的5位碱基，部分病毒序列为C，为了覆盖所有犬瘟热病毒，将上游引物修订为5'-GGTGRTGAACTTGAAAACTCCAT-3'；下游引物处的7位碱基，部分病毒序列为T，下游引物处的10位碱基，部分病毒序列为C，下游引物处的13位碱基，部分病毒序列为T，为了覆盖所有犬瘟热病毒，将下游引物修订为5’-CTGAGCRTCRTCRTTGGTGAT-3’；探针序列6位碱基，部分病毒序列为A，探针序列12位碱基，部分病毒序列为A；为了覆盖所有犬瘟热病毒，将探针序列修订为5’-TTCAGYCTCGGYCAAGAAATGGT-3’。
因此，建立了犬瘟热病毒的荧光RT-PCR检测方法的引物探针组合：即荧光RT-PCR引物为：
上游引物：5’-GGTGRTGAACTTGAAAACTCCAT-3’，如SEQID NO.1所示；
下游引物：5’-CTGAGCRTCRTCRTTGGTGAT-3’，如SEQ IDNO.2所示；
荧光RT-PCR探针的核苷酸序列为：5’-TTCAGYCTCGGYCAAGAAATGGT-3’，如SEQ IDNO.3所示,
R为C/T，Y为A/G。
且该荧光RT-PCR探针的核苷酸序列的5’端结合有FAM荧光报告基团，3’端结合有BHQ1荧光淬灭基团。
之后，将犬瘟热病毒cDNA作为模板，采用qPCR试剂盒进行扩增，反应体系为：Mix10μL、10μM引物各0.8μL、10μM探针0.8μL、cDNA模板5μL、补水至20μL；阴性对照以去离子水代替待检测样品，同时设置犬细小病毒、犬腺病毒、犬副流感病毒的基因组作为非特异性对照；
荧光RT-PCR反应条件：42℃10min，95℃10sec；95℃5sec，60℃40sec共45个循环，于60℃时收集荧光信号；
荧光RT-PCR检测结果显示，经过100次试验验证，该靶序列可被检出，且Ct值均小于30。而且其他病毒(例如犬细小病毒、犬腺病毒、犬副流感病毒)的基因组作为模板无检测信号、阴性对照无检测信号，表明该荧光RT-PCR可作为检测犬瘟热病毒的方法：其中：
上游引物：5’-GGTGRTGAACTTGAAAACTCCAT-3’；
下游引物：5’-CTGAGCRTCRTCRTTGGTGAT-3’；
荧光RT-PCR探针的核苷酸序列为：5’-TTCAGYCTCGGYCAAGAAATGGT-3’；
R为C/T，Y为A/G。
且该荧光RT-PCR探针的核苷酸序列的5’端结合有FAM荧光报告基团，3’端结合有BHQ1荧光淬灭基团。
实施例2
检测犬腺病毒的实时荧光PCR引物探针组合的筛选
从NCBI GenBank数据库检索获得犬腺病毒E3基因序列(截止至2023年10月1日，共102条序列)，使用PrimerPremier5软件设计引物和探针，以能对犬腺病毒进行检测为目标，考虑到引物的错配、Tm值以及保证使用一步法在1.5h完成检测等因素，将设计的引物和探针分别通过MEGA 6软件以及Blast软件在NCBI数据库中进行比对分析，要求引物和探针序列必须覆盖所有数据库已知犬腺病毒序列，且与其他序列无明显配对。通过分析发现：
序列5’-CTCAACGAGATGCCTCTTCACA-3’、5’-CCTCCG CTTCTGACTTTAGAGA -3’和5’-CATAAATGCTTCCCTCTTCTA TCCCGC-3’可匹配绝大部分犬腺病毒的序列，可作为检测犬腺病毒的引物探针组合，即引物对(上游引物：5’-CTCAACGAGATG CCTCTTCACA-3’和下游引物：5’-CCTCCGCTTCTGACTTTAGA GA-3’，以及探针5’-CATAAATGCTTCCCTCTTCTATCCCGC-3’)。
进一步分析发现引物和犬腺病毒序列匹配时，上游引物处的20位碱基，部分病毒序列为C，为了覆盖到所有犬腺病毒，将上游引物修订为5’-CTCAACGAGATGCCTCTTCMCA-3’。
因此，建立了犬腺病毒的荧光PCR检测方法的引物探针组合：即荧光PCR引物为：
上游引物：5’-CTCAACGAGATGCCTCTTCMCA-3’，如SEQ ID NO.4所示；
下游引物：5’-CCTCCGCTTCTGACTTTAGAGA-3’，如SEQ ID NO.5所示；
M为A/C；
荧光PCR探针的核苷酸序列为：5’-CATAAATGCTTCCCTCTTCTATCCCGC-3’，如SEQ IDNO.6所示。且该荧光PCR探针的核苷酸序列的5’端结合有HEX荧光报告基团，3’端结合有BHQ1荧光淬灭基团。
之后，将犬腺病毒基因组DNA作为模板，采用qPCR试剂盒进行扩增，反应体系为：Mix 10μL、10μM引物各0.4μL、10μM探针0.8μL、DNA模板5μL、补水至20μL；阴性对照以去离子水代替待检测样品，同时设置犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒的基因组作为非特异性对照；
荧光PCR反应条件：42℃10min，95℃10sec；95℃5sec，60℃40sec共45个循环，于60℃时收集荧光信号；
荧光PCR检测结果显示，经过100次试验验证，该靶序列可被检出，且Ct值均小于30。而且其他病毒(例如犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒)的基因组作为模板无检测信号、阴性对照无检测信号，表明该荧光PCR可作为检测犬腺病毒的方法：其中：
上游引物：5’-CTCAACGAGATGCCTCTTCMCA-3’，
下游引物：5’-CCTCCGCTTCTGACTTTAGAGA-3’，
荧光PCR探针的核苷酸序列为：5’-CATAAATGCTTCCCTCTTCTATCCCGC-3’，且该荧光PCR探针的核苷酸序列的5’端结合有HEX荧光报告基团，3’端结合有BHQ1荧光淬灭基团。
实施例3
检测犬副流感病毒的实时荧光RT-PCR引物探针组合的筛选
从NCBI数据库检索获得犬副流感病毒N基因序列(截止至2023年10月1日，共24条序列)，使用PrimerPremier5软件设计引物和探针，以能对犬副流感病毒进行检测为目标，考虑到引物的错配以及Tm值以及保证使用一步法在1.5h完成检测等因素，将设计的引物和探针分别通过MEGA 6软件以及Blast软件在NCBI数据库中进行分析，要求引物和探针序列必须覆盖所有数据库已知犬副流感病毒序列，且与其他序列无明显配对。通过分析发现：
序列5’-TCATTCCGCTTAATCCCCA-3’、5’-AAGAAAGTCTCAATCTCATCCCA-3’和5’-CGTTCAGGTATGAGCCGTGGAGAGA-3’可匹配绝大部分犬副流感病毒的序列，可作为检测犬副流感病毒的引物探针组合，即引物对(上游引物：5’-TCATTCCGCTTAATCCCCA-3’和下游引物：5’-AAGAAAGTCTCAATCTCATCCCA-3’，以及探针5’-CGTTCAGGTATGAGCCGTGGAGAGA-3’)。
因此，建立了犬副流感病毒的荧光RT-PCR检测方法的引物探针组合：即荧光RT-PCR引物为：
上游引物：5’-TCATTCCGCTTAATCCCCA-3’，如SEQ IDNO.7所示；
下游引物：5’-AAGAAAGTCTCAATCTCATCCCA-3’，如SEQID NO.8所示；
荧光RT-PCR探针的核苷酸序列为：5’-CGTTCAGGTATGAGCCGTGGAGAGA-3’，如SEQ IDNO.9所示。且该荧光PCR探针的核苷酸序列的5’端结合有ROX荧光报告基团，3’端结合有BHQ2荧光淬灭基团。
之后，将犬副流感病毒cDNA作为模板，采用qPCR试剂盒进行扩增，反应体系为：Mix10μL、10μM引物各0.8μL、10μM探针0.8μL、cDNA模板5μL、补水至20μL；阴性对照以去离子水代替待检测样品，同时设置犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬腺病毒的基因组作为非特异性对照；
荧光RT-PCR反应条件：42℃10min，95℃10sec；95℃5sec，60℃40sec共45个循环，于60℃时收集荧光信号；
荧光RT-PCR检测结果显示，经过100次试验验证，该靶序列可被检出，且Ct值均小于30。而且其他病毒(例如犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬腺病毒)的基因组作为模板无检测信号、阴性对照无检测信号，表明该荧光RT-PCR可作为检测犬副流感病毒的方法：其中：
上游引物：5’-TCATTCCGCTTAATCCCCA-3’；
下游引物：5’-AAGAAAGTCTCAATCTCATCCCA-3’；
荧光RT-PCR探针的核苷酸序列为：5’-CGTTCAGGTATGAGCCGTGGAGAGA-3’，且该荧光RT-PCR探针的核苷酸序列的5’端结合有ROX荧光报告基团，3’端结合有BHQ2荧光淬灭基团。
实施例4
检测犬瘟热病毒、犬腺病毒以及犬副流感病毒的三重实时荧光RT-PCR引物探针组合
基于上述实施例1～3筛选得到引物，得到检测犬瘟热病毒、犬腺病毒以及犬副流感病毒的三重实时荧光RT-PCR引物探针组合，它包括用于扩增犬瘟热病毒的引物探针组合、用于扩增犬腺病毒的引物探针组合和用于扩增犬副流感病毒的引物探针组合，其中，上述用于扩增犬瘟热病毒的引物探针组合包括荧光PCR特异性引物对CDV-F/R和荧光PCRTaqMan探针CDV-P，上述荧光PCR特异性引物对CDV-F/R：
上游引物CDV-F：GGTGRTGAAC TTGAAAACTC CAT，其如SEQ ID NO.1所示，
下游引物CDV-R：CTGAGCRTCR TCRTTGGTGA T，其如SEQ ID NO.2所示；
上述荧光PCR TaqMan探针CDV-P：TTCAGYCTCG GYCAAGAAAT GGT，其如SEQ ID NO.3所示；
上述用于扩增犬腺病毒的引物探针组合包括荧光PCR特异性引物对CAV-F/R和荧光PCR TaqMan探针CAV-P，上述荧光PCR特异性引物对CAV-F/R：
上游引物CAV-F：CTCAACGAGA TGCCTCTTCM CA，其如SEQ ID NO.4所示，
下游引物CAV-R：CCTCCGCTTC TGACTTTAGA GA，其如SEQ ID NO.5所示；
上述荧光PCR TaqMan探针CAV-P：CATAAATGCT TCCCTCTTCT ATCCCGC，其如SEQ IDNO.6所示；
上述用于扩增犬副流感病毒的引物探针组合包括荧光PCR特异性引物对CPIV-F/R和荧光PCR TaqMan探针CPIV-P，上述荧光PCR特异性引物对CPIV-F/R：
上游引物CPIV-F：TCATTCCGCT TAATCCCCA，其如SEQ ID NO.7所示，
下游引物CPIV-R：AAGAAAGTCT CAATCTCATC CCA，其如SEQ ID NO.8所示，
上述荧光PCR TaqMan探针CPIV-P：CGTTCAGGTA TGAGCCGTGG AGAGA，其如SEQ IDNO.9所示；
上述探针CDV-P、探针CAV-P和探针CPIV-P核苷酸序列的5’端均结合有荧光报告基团，3’端均结合有荧光淬灭基团。
CDV-P的荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ1；
CAV-P的荧光报告基团为HEX，荧光淬灭基团为BHQ1；
CPIV-P的荧光报告基团为ROX，荧光淬灭基团为BHQ2。
Y为C/T；M为A/C，H为A/T/C。
上述三重实时荧光RT-PCR引物探针组合的使用方法如下：
将犬瘟热病毒、犬腺病毒以及犬副流感病毒cDNA/DNA作为模板，采用qPCR试剂盒进行扩增，反应体系为：荧光RT-PCR体系包括：Mix 10μL、CDV-F(100μM)0.08μL、CDV-R(100μM)0.08μL、CAV-F(100μM)0.04μL、CAV-R(100μM)0.04μL、CPIV-F(100μM)0.08μL、CPIV-F(100μM)0.08μL、CDV-P(100μM)0.08μL、CAV-P(100μM)0.08μL、CPIV-P(100μM)0.08μL、核酸模板5μL、补水至20μL；阴性对照以去离子水代替待检测样品，同时设置犬细小病毒基因组作为非特异性对照；
荧光RT-PCR反应程序为：42℃10min，95℃10sec；95℃5sec，60℃40sec共45个循环，于60℃时收集荧光信号。
荧光RT-PCR检测结果显示，经过100次试验验证，靶序列可被检出，且Ct值均小于30。而犬细小病毒基因组作为模板无检测信号、阴性对照无检测信号。
实施例5
检测犬瘟热病毒、犬腺病毒以及犬副流感病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒包括实施例4的三重实时荧光RT-PCR引物探针组合和qPCR Mix；其具体试剂用量如下：
20μL荧光RT-PCR体系包括：Mix(购自宝生物工程(大连)有限公司)10μL、CDV-F(100μM)0.08μL、CDV-R(100μM)0.08μL、CAV-F(100μM)0.04μL、CAV-R(100μM)0.04μL、CPIV-F(100μM)0.08μL、CPIV-F(100μM)0.08μL、CDV-P(100μM)0.08μL、CAV-P(100μM)0.08μL、CPIV-P(100μM)0.08μL、核酸模板5μL、补水至20μL；
为方便检测，犬瘟热病毒、犬腺病毒以及犬副流感病毒的实时荧光PCR检测试剂盒中还包括阳性对照和阴性对照。阳性对照为犬瘟热病毒、犬腺病毒以及犬副流感病毒标准品混合物。阴性对照为不含犬瘟热病毒、犬腺病毒以及犬副流感病毒的去离子水。
为方便检测，犬瘟热病毒、犬腺病毒以及犬副流感病毒的实时荧光RT-PCR检测试剂盒中还包括实施例获得的标准曲线和说明书。说明书内容包括荧光RT-PCR反应程序为：42℃10min，95℃10sec；95℃5sec，60℃40sec共45个循环，于60℃时收集荧光信号。
上述试剂盒的三重实时荧光RT-PCR标准曲线建立
1)基因组提取
使用杭州倍沃医学科技有限公司血液病毒DNA/RNA小提试剂盒提取对犬瘟热病毒、犬腺病毒以及全副流感病毒细胞培养物以及待检测样品进行基因组DNA/RNA提取，具体方法见以下步骤：
(1)向500μL含有RNA Carrier的PLY Buffer中加入200μL细胞培养物上清，涡旋混匀，室温孵育15min；
(2)加入350μL无水乙醇，颠倒混匀；
(3)将液体转移至吸附柱中，12000r/min离心60sec，弃滤液；
(4)加入500μL PHB Buffer，12000r/min离心60sec，弃滤液；
(5)加入500μL Wash Buffer，12000r/min离心60sec，弃滤液；
(6)重复(5)；
(7)将吸附柱放回收集管中，12000r/min离心2min，弃滤液；
(8)将吸附柱室温静置数分钟，去除残留乙醇；
(9)将吸附柱放入干净新管中，加入50μL DEPC水，室温放置2min，12000r/min离心60sec，收集病毒DNA/RNA溶液。
以犬瘟热病毒、犬腺病毒以及犬副流感病毒细胞培养物中提取DNA/RNA作为阳性对照构建标准品；以待检测样品中提取DNA/RNA为待检测样品。
2)标准品制备
以犬瘟热病毒基因组RNA为模板，使用下述引物：
上游引物：5’-GTTATGCTATGGGAGTTGGTGTTG-3’，
下游引物：5’-TCACTGGTTCCAGGTTGACTGAG-3’，
以上游引物反转录获得的cDNA为模板，进行PCR扩增，得到PCR产物，该PCR产物的序列如SEQ ID NO.10所示，再将PCR产物与pMD18-T载体连接，构建阳性质粒pMD18T-CDV-N，即为标准品；
以犬腺病毒基因组DNA为模板，使用下述引物：
上游引物：5’-CGCGCTGAACATTACTACCTTGT-3’，
下游引物：5’-CCTAGAGCACTTCGTGTCCGCTT-3’，
进行PCR扩增，得到PCR产物，该PCR产物的序列如SEQ ID NO.11所示，再将PCR产物与pMD18-T载体连接，构建阳性质粒pMD18T-CAV-E3，即为标准品；
以犬副流感病毒基因组RNA为模板，使用下述引物：
上游引物：5’-CTATTCTGCCTACGGATTGTTCTC-3’，
下游引物：5’-GATTATTCGTCGAGCCTCCG-3’，
以上游引物反转录获得的cDNA为模板，进行PCR扩增，得到PCR产物，该PCR产物的序列如SEQ ID NO.12所示，再将PCR产物与pMD18-T载体连接，构建阳性质粒pMD18T-CPIV-N，即为标准品；
3)标准曲线建立
利用Qubit 2.0对上述犬瘟热病毒标准品、犬腺病毒标准品以及犬副流感病病毒标准品进行浓度测定，并计算拷贝数。将犬瘟热病毒标准品、犬腺病毒标准品以及犬副流感病毒标准品等浓度混合，10倍比梯度稀释至2×106、2×105、2×104、2×103、2×102、2×101、2×100copies/μL，以不同浓度的标准品混合物作为模板，利用实施例4提供的引物和探针进行荧光PCR检测，PCR反应体系及反应条件参照实施例4，以确定检测犬瘟热病毒、犬腺病毒以及犬副流感病毒的实时荧光RT-PCR的灵敏度并验证建立检测犬瘟热病毒、犬腺病毒以及犬副流感病毒的实时荧光RT-PCR的标准曲线。
不同浓度的标准品荧光PCR扩增曲线为平滑的S型扩增曲线，如图1所示。扩增结果显示犬瘟热病毒扩增结果为最低检出限为10个拷贝；犬腺病毒扩增结果为最低检出限为1个拷贝；犬副流感病毒扩增结果为最低检出限为1个拷贝。以各标准品浓度的Log值作为X轴，以其对应Ct值作为Y轴绘制标准曲线。标准曲线如图2所示。其中检测犬瘟热病毒标准曲线相关系数R2＝0.9811，由标准曲线得到的线性方程为：Lg(gene copies/μL)y＝3.4747x+43.98；检测犬腺病毒标准曲线相关系数R2＝0.9942，由标准曲线得到的线性方程为：Lg(gene copies/μL)y＝-3.6903x+42.352；检测犬副流感病毒标准曲线相关系数R2＝0.9967，由标准曲线得到的线性方程为：Lg(gene copies/μL)y＝-3.9030x+45.385。
上述试剂盒检测检测犬瘟热病毒、犬腺病毒以及犬副流感病毒的方法，包括以下步骤：
a.荧光RT-PCR
收集待检测样品并提取其基因组DNA/RNA；使用权利要求5中的引物和TaqMan探针进行荧光RT-PCR扩增，采集荧光信号得到Ct值；
b.检测结果判定
若待检测样品在CDV-P的5’端结合的荧光报告基团所对应的通道中的扩增曲线为标准的S型曲线，且Ct<40时为阳性，表明该待检测样品中含有犬瘟热病毒毒株；
或，若Ct>＝40或无扩增曲线时，表明该带检测样品中不含有犬瘟热病毒毒株或犬瘟热病毒毒株含量低至无法检测到；
若待检测样品在CAV-P的5’端结合的荧光报告基团所对应的通道中的扩增曲线为标准的S型曲线，且Ct<40时为阳性，表明该待检测样品中含有犬腺病毒毒株；
或，若Ct>＝40或无扩增曲线时，表明该带检测样品中不含有犬腺病毒毒株或犬腺病毒毒株含量低至无法检测到；
若待检测样品在CPIV-P的5’端结合的荧光报告基团所对应的通道中的扩增曲线为标准的S型曲线，且Ct<40时为阳性，表明该待检测样品中含有犬副流感病毒毒株；
或，若Ct>＝40或无扩增曲线时，表明该带检测样品中不含有犬副流感病毒毒株或犬副流感病毒毒株含量低至无法检测到。
实施例6
检测犬瘟热病毒、犬腺病毒以及犬副流感病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒的特异性检测
按照实施例2所述方法利用杭州倍沃医学科技有限公司血液病毒DNA/RNA小提试剂盒提取犬瘟热病毒、犬副流感病毒基因组RNA，提取犬腺病毒、犬细小病毒基因组DNA，以去离子水为阴性对照。利用实施例4提供的引物和探针进行荧光RT-PCR检测，荧光RT-PCR反应体系及反应条件参照实施例4，以验证该方法的特异性。
检测结果如图3所示，仅犬瘟热病毒、犬腺病毒以及犬副流感病毒出现特定的S型扩增曲线、Ct值<40且彼此能鉴别区分，扩增结果为阳性，其他样品未出现特定的S型扩增曲线，扩增结果为阴性。检测结果表明本发明的方法可特异性地检测出犬瘟热病毒、犬腺病毒以及犬副流感病毒。
实施例7
检测犬瘟热病毒、犬腺病毒以及犬副流感病毒的三重实时荧光RT-PCR试剂盒的重复性
按照实施例4所述方法，分别将犬瘟热病毒标准品、犬腺病毒标准品以及犬副流感病毒标准品等浓度混合，稀释至2×106、2×104、2×102copies/μL，每个梯度重复3次，以不同浓度的标准品混合物作为模板，利用实施例4提供的引物和探针进行荧光RT-PCR检测，RT-PCR反应体系及反应条件参照实施例4，通过组内和组间的Ct值变异系数评估该方法的重复性。
检测结果如图4所示：每一个浓度梯度的扩增曲线较聚拢，Ct值无明显差距，组内及组间变异系数均小于5％，表明本发明的方法具有较好的重复性。
实施例8
犬瘟热病毒、犬腺病毒以及犬副流感病毒的三重实时荧光RT-PCR检测试剂盒应用于临床样品的检测
使用实施例8中的试剂盒对57份感染临床眼鼻拭子样品基因组应用荧光RT-PCR进行检测。
该荧光RT-PCR体系包括：Mix 10μL、CDV-F(100μM)0.08μL、CDV-R(100μM)0.08μL、CAV-F(100μM)0.04μL、CAV-R(100μM)0.04μL、CPIV-F(100μM)0.08μL、CPIV-F(100μM)0.08μL、CDV-P(100μM)0.08μL、CAV-P(100μM)0.08μL、CPIV-P(100μM)0.08μL、核酸模板5μL、补水至20μL；
荧光RT-PCR反应程序为：42℃10min，95℃10sec；95℃5sec，60℃40sec共45个循环，于60℃时收集荧光信号。
应用本荧光RT-PCR的检测结果表明，16份样品检测犬瘟热病毒扩增曲线呈S型且Ct均<40，14份样品检测犬腺病毒扩增曲线呈S型且Ct<40，5份样品检测犬副流感病毒扩增曲线呈S型且Ct<40。其中，2份样品检测犬瘟热病毒与犬腺病毒阳性，3份样品检测犬瘟热病毒、犬腺病毒与犬副流感病毒阳性。表明该方法可用于犬瘟热病毒、犬腺病毒以及犬副流感病的检测。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (7)
1.一种犬呼吸道病毒三重实时荧光RT-PCR引物探针组合，其特征在于，所述三重实时荧光RT-PCR引物探针组合包括用于扩增犬瘟热病毒的引物探针组合、用于扩增犬腺病毒的引物探针组合和用于扩增犬副流感病毒的引物探针组合，其中，所述用于扩增犬瘟热病毒的引物探针组合包括荧光PCR特异性引物对CDV-F/R和荧光PCR TaqMan探针CDV-P，所述荧光PCR特异性引物对CDV-F/R：
上游引物CDV-F：GGTGRTGAAC TTGAAAACTC CAT，其如SEQ ID NO.1所示，
下游引物CDV-R：CTGAGCRTCR TCRTTGGTGA T，其如SEQ ID NO.2所示；
所述荧光PCR TaqMan探针CDV-P：TTCAGYCTCG GYCAAGAAAT GGT，其如SEQ ID NO.3所示；
所述用于扩增犬腺病毒的引物探针组合包括荧光PCR特异性引物对CAV-F/R和荧光PCRTaqMan探针CAV-P，所述荧光PCR特异性引物对CAV-F/R：
上游引物CAV-F：CTCAACGAGA TGCCTCTTCM CA，其如SEQ ID NO.4所示，
下游引物CAV-R：CCTCCGCTTC TGACTTTAGA GA，其如SEQ ID NO.5所示；
所述荧光PCR TaqMan探针CAV-P：CATAAATGCT TCCCTCTTCT ATCCCGC，其如SEQ ID NO.6所示；
所述用于扩增犬副流感病毒的引物探针组合包括荧光PCR特异性引物对CPIV-F/R和荧光PCR TaqMan探针CPIV-P，所述荧光PCR特异性引物对CPIV-F/R：
上游引物CPIV-F：TCATTCCGCT TAATCCCCA，其如SEQ ID NO.7所示，
下游引物CPIV-R：AAGAAAGTCT CAATCTCATC CCA，其如SEQ ID NO.8所示，
所述荧光PCR TaqMan探针CPIV-P：CGTTCAGGTA TGAGCCGTGG AGAGA，其如SEQ ID NO.9所示；
上述探针CDV-P、探针CAV-P和探针CPIV-P核苷酸序列的5’端均结合有荧光报告基团，3’端均结合有荧光淬灭基团；
所述荧光PCR TaqMan探针的核苷酸序列的5’端结合有荧光报告基团，3’端结合有荧光淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的三重实时荧光RT-PCR引物探针组合，其特征在于，
所述荧光PCR TaqMan探针CDV-P的5’端结合荧光报告基团为FAM，3’端结合荧光淬灭基团为BHQ1；
所述荧光PCR TaqMan探针CAV-P的5’端结合荧光报告基团为HEX，3’端结合荧光淬灭基团为BHQ1；
所述荧光PCR TaqMan探针CPIV-P的5’端结合荧光报告基团为ROX，3’端结合荧光淬灭基团为BHQ2。
3.一种权利要求1所述的三重实时荧光RT-PCR引物探针组合在制备试剂盒中的应用。
4.一种权利要求1所述的三重实时荧光RT-PCR引物探针组合在同时检测犬瘟热病毒、犬腺病毒以及犬副流感病毒中的应用。
5.一种检测犬瘟热病毒、犬腺病毒以及犬副流感病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1或2所述的三重实时荧光RT-PCR引物探针组合。
以及犬副流感病毒的荧光PCR特异性引物和荧光PCR TaqMan探针，且所述用于扩增犬瘟热病毒、犬腺病毒以及犬副流感病毒的荧光PCR特异性引物包括用于检测犬瘟热病毒的荧光PCR特异性引物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括qPCR Mix。
7.利用权利要求5所述的试剂盒检测犬瘟热病毒、犬腺病毒以及犬副流感病毒的三重实时荧光RT-PCR方法，其特征在于：包括以下步骤：
待检测样品检测
a.荧光RT-PCR
收集待检测样品并提取其基因组DNA/RNA；使用权利要求5中的引物和TaqMan探针进行荧光RT-PCR扩增，采集荧光信号得到Ct值；
b.检测结果判定
若待检测样品在CDV-P的5’端结合的荧光报告基团所对应的通道中的扩增曲线为标准的S型曲线，且Ct<40时为阳性，表明该待检测样品中含有犬瘟热病毒毒株；
或，若Ct>＝40或无扩增曲线时，表明该带检测样品中不含有犬瘟热病毒毒株或犬瘟热病毒毒株含量低至无法检测到；
若待检测样品在CAV-P的5’端结合的荧光报告基团所对应的通道中的扩增曲线为标准的S型曲线，且Ct<40时为阳性，表明该待检测样品中含有犬腺病毒毒株；
或，若Ct>＝40或无扩增曲线时，表明该带检测样品中不含有犬腺病毒毒株或犬腺病毒毒株含量低至无法检测到；
若待检测样品在CPIV-P的5’端结合的荧光报告基团所对应的通道中的扩增曲线为标准的S型曲线，且Ct<40时为阳性，表明该待检测样品中含有犬副流感病毒毒株；
或，若Ct>＝40或无扩增曲线时，表明该带检测样品中不含有犬副流感病毒毒株或犬副流感病毒毒株含量低至无法检测到。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311669696.2A CN117721249A (zh) | 2023-12-07 | 2023-12-07 | 犬呼吸道病毒三重实时荧光rt-pcr引物探针组合 |
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| CN202311669696.2A CN117721249A (zh) | 2023-12-07 | 2023-12-07 | 犬呼吸道病毒三重实时荧光rt-pcr引物探针组合 |
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|---|---|
| CN117721249A true CN117721249A (zh) | 2024-03-19 |
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| CN202311669696.2A Pending CN117721249A (zh) | 2023-12-07 | 2023-12-07 | 犬呼吸道病毒三重实时荧光rt-pcr引物探针组合 |
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| Country | Link |
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| CN (1) | CN117721249A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117385100A (zh) * | 2023-10-09 | 2024-01-12 | 华中农业大学 | 一种犬呼吸道冠状病毒的荧光定量pcr检测试剂盒 |
-
2023
- 2023-12-07 CN CN202311669696.2A patent/CN117721249A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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