CN116814852A

CN116814852A - 一种检测犬细小病毒的多重核酸组合物、试剂盒开发方法及其应用

Info

Publication number: CN116814852A
Application number: CN202310646040.2A
Authority: CN
Inventors: 杜永飞
Original assignee: Beijing Youji Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Youji Technology Co ltd
Priority date: 2023-06-01
Filing date: 2023-06-01
Publication date: 2023-09-29

Abstract

本发明公开了一种检测犬细小病毒的多重核酸组合物，其包括用于检测犬细小病毒的多重核酸组合物，所述多重核酸组合物包括两对引物和两条探针，所述引物对1和2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑2和SEQ ID NO.4‑5所示，所述探针1和2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示。本发明一种可以高效准确检测犬细小病毒的多重核酸组合物，可以用于犬细小病毒实时荧光定量PCR的检测，经发明人验证该核酸组合物检测病原体的准确度显著高于市面上的单重引物核酸检测试剂盒，且灵敏度高，对于病原体的最低检测限均达到1×10³copies/mL，有利于患犬的早期诊断或治疗。

Description

一种检测犬细小病毒的多重核酸组合物、试剂盒开发方法及其应用

技术领域

本发明涉及病原体检测技术领域，具体而言，涉及一种检测犬细小病毒的多重核酸组合物、试剂盒开发方法及其应用。

背景技术

犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV)能引起犬的细小病毒病，属于急性传染病，常见临床表现为剧烈呕吐、出血性肠炎、心肌炎、白细胞骤减、出血型肠炎等特征。幼犬CPV发病率高、传染性强、致死率高，是影响养犬业最主要的烈性传染性疾病之一。快速、准确地鉴定引起犬消化道疾病的病原体种类，对于患犬的临床鉴别诊断及治疗有着重要的意义。

目前临床中最常用诊断方法为胶体金检测、琼脂糖凝胶电泳检测和各类实时荧光PCR检测。例如专利CN 111500793 A和CN 111471798 A提供了犬细小病毒的琼脂糖凝胶电泳检测方法，琼脂糖凝胶电泳法成本虽低，但存在气溶胶污染问题，对检测结果的准确性影响较高；胶体金法存在检测灵敏度低的问题。因此，利用实时荧光PCR技术开发出高效、准确的鉴定体系是犬细小病毒临床鉴别的重要途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测犬细小病毒的多重核酸组合物、试剂盒开发方法及其应用以解决上述技术问题。

本发明提供了一种检测犬细小病毒的多重核酸组合物，其包括用于检测犬细小病毒的多重核酸组合物，所述多重核酸组合物包括两对引物和两条探针，所述引物对1和2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-2和SEQ ID NO.4-5所示，所述探针1和2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。上述荧光报告基团为HEX、FAM、TET、CF532、JOE、TAMRA、ROX、CY3、CY5、Texas Red、NED、Alexa Flour或VIC，淬灭基团为MGB、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3或QSY。

本发明提供了一种检测试剂盒，其包括上述的多重核酸组合物。

本发明提供了一种上述多重核酸组合物在制备检测试剂盒中的应用。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒为冻干试剂或液体试剂。

上述多重核酸组合物或上述试剂在鉴定或辅助鉴定犬细小病毒中的应用；应用为非疾病诊断或治疗为目的的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种可以高效准确检测犬细小病毒的多重核酸组合物，该多重组合物可以用于犬细小病毒实时荧光定量PCR的检测，经发明人验证该核酸组合物检测病原体的准确度显著高于市面上的单重引物核酸检测试剂盒，且灵敏度高，对于病原体的最低检测限均达到1×10³copies/mL，有利于患犬的早期诊断或治疗。基于上述多重核酸组合物可以制备相应的检测试剂盒以及检测试剂。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1是本发明试剂盒荧光PCR测试结果；

图2是本发明核酸组合物的克隆测序比对结果；

图3是本发明试剂盒特异性测试扩增图；a)为犬冠状病毒，b)为犬细小病毒，c)为犬瘟热病毒，d)为犬腺病毒2型；

图4是本发明试剂盒灵敏度测试扩增图；a)病原体浓度为1×10⁵copies/mL，b)病原体浓度为1×10⁴copies/mL，c)病原体浓度为1×10³copies/mL，d)病原体浓度为1×10²copies/mL；

图5是本发明试剂盒临床样本荧光PCR检测结果。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

上述核酸组合物是基于犬细小病毒的全基因组序列设计的，犬细小病毒的全基因组序列参照NCBI序列号NC_001539.1。

在一种实施方式中，引物对的核苷酸序列具有与SEQ ID NO.1-2所示的序列90％、95％、99％或100％的一致性；探针的核苷酸序列具有与SEQ ID NO.3所示的序列90％、95％、99％或100％的一致性。

在本发明应用较佳的实施方式中，

上述引物对1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述探针1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。上述引物对2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，所述探针2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。所述荧光报告基团为HEX、FAM、TET、CF532、JOE、TAMRA、ROX、CY3、CY5、Texas Red、NED、Alexa Flour或VIC，所述淬灭基团为MGB、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3或QSY。

此外，在其他实施方式中，上述荧光报告基团以及猝灭基团可以根据需要进行自适应调整，并不限于上述限定的几种类型，只要能满足荧光的激发和猝灭均可行，在一种可选的实施方式中，在检测CPV的探针标记不同最大激发波长的荧光报告基因。

在一种实施方式中，上述检测试剂盒还包括检测缓冲液，酶，水和dNTP。上述缓冲液用于荧光定量PCR检测用，可选自市售的常规荧光定量PCR时的缓冲液。

本发明提供了一种上述核酸组合物在制备检测试剂盒中的应用。可选的，在试剂盒中设置引物对的上下游引物单独分装，在一种可选的实施方式中，上述试剂盒中带有用于稀释引物的水(超纯水)。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒为冻干试剂或液体试剂。可选的，将上述引物对中的上下游引物单独冻干制粉，分装于试剂保存管中作为单独的产品或者成套的产品。

可选的，将上述核酸组合物制备为液体试剂，将相应的引物对或探针溶于水中。

上述核酸组合物或上述试剂在鉴定或辅助鉴定犬细小病毒中的应用；应用为非疾病诊断或治疗为目的的应用。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了一种检测犬细小病毒(CPV)的多重核酸组合物，其包括用于检测犬细小病毒的多重核酸组合物。其中，核酸组合物包括两对引物对和两条探针。上述引物对1和2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-2和SEQ ID NO.4-5所示，所述探针1和2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示。

首先通过查询NCBI基因组数据库获得犬细小病毒基因组数据(NCBI ReferenceSequence:NC_001539.1)。使用引物探针设计软件Oligo7.5选择合适的序列，即尽量避免引物间形成二聚体和发卡结构，且其引物退火温度在60℃左右，产物长度不高于150bp。获得犬细小病毒的多重核酸组合物，引物探针组1如SEQ ID NO.1-3所示，引物探针组2如SEQ IDNO.4-6所示。

实施例2

本实施例提供了一种犬细小病毒多重核酸检测试剂盒，其包括核酸组合物和PCR反应所需的缓冲液、酶、水和dNTPs。所述核酸组合物为实施例1提供的2组引物探针组合；所述PCR反应体系为25μL体系，包括12.5μL的PCR反应液(包括逆转录酶、Taq DNA聚合酶、dNTP、MgCl ₂)，犬细小病毒的引物探针组：0.15μL的CPV-a-F，0.15μL的CPV-a-R，0.2μL的CPV-a-P，0.15μL的CPV-b-F，0.15μL的CPV-b-R，0.2μL的CPV-b-P 3，3.2μL的DEPC处理水，5μL的核酸模板。其中，核酸组合物由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成，并按照说明书进行稀释；PCR反应液购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。

对犬细小病毒的临床样本进行核酸提取，提取后的病毒核酸先使用市场成品试剂盒进行检测(购于广州华峰生物科技有限公司)，以确认样本中确实含有犬细小病毒。然后，使用本发明试剂盒对临床样本进行检测扩增，PCR反应条件为：(1)50℃逆转录10min；(2)95℃预变性3min；(3)95℃变性15s；(4)60℃退火30s，并采集荧光。其中(3)-(4)共进行45个循环。荧光定量扩增结果如图1所示。本实验例中，CPV-a荧光报告基团为FAM，淬灭基团为BHQ1；CPV-b荧光报告基团为VIC，淬灭基团为BHQ1。

为确认核酸组合物的特异性，将PCR的扩增产物进行克隆测序，克隆测序委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行。将测序结果与犬细小病毒参考基因组NC_001539.1对比(图2)，对比结果显示两个引物探针组合的扩增产物确实为CPV的片段，符合预期。

实施例3

本实施例提供了试剂盒特异性测试、重复性测试和灵敏度测试。

所述特异性测试：按照上述犬细小病毒多重核酸检测试剂盒的组分及比例进行配制，然后分别加入目标病毒和其它干扰病原体进行测试，包括犬冠状病毒、犬瘟热病毒、犬腺病毒2型。按照优化后的PCR反应条件进行扩增反应。图3为CPV_a和CPV_b检测通道扩增图，图3中有扩增曲线的为CPV病毒，其余病原体均未扩增。

所述重复性测试：本实验对CPV临床样本进行扩增，每种样本重复扩增10次，对数据进行分析，结果显示，本发明试剂盒检测CPV_a的平均Ct值在30.07，变异系数(CV，％)为0.42％；CPV_b的平均Ct值在33.15，变异系数(CV，％)为0.36％。

所述灵敏度测试：将各病原体的质粒分别稀释至1×10 ²copies/mL、1×10³copies/mL、1×10 ⁴copies/mL后进行扩增，选择检出率在95％以上的最低浓度即为检测检浓度。最终确认CPV的检测限为1×10 ³copies/mL。图4是CPV在最低检测限(1×10 ³copies/mL)时的扩增图，图4中病原体浓度在1×10 ³copies/mL、1×10 ⁴copies/mL、1×10⁵copies/mL时，均可准确检出，病原体浓度1×10 ²copies/mL时，仅部分样本可检出。采集的荧光信号结果生成荧光曲线，双位点曲线明显呈S型且Ct值≤36即可判定对应荧光检测通道的病原体为阳性，单位点曲线明显呈S型且Ct值≤36建议进行复测。

实施例4

本实施例提供了一种犬细小病毒核酸检测试剂盒的应用，所述应用为鉴定或辅助鉴定犬细小病毒。测试方法如实施例2所述，对36份临床拭子样本进行检测，其中2份为阳性样本，1份为建议复测样本，33份为阴性样本(如图5所示)。同时，采用购买市面的单基因试剂盒作为对照，其中建议复测样本未在单基因试剂盒中检出(见表1)。表明，本试剂盒通过多重检测技术提高了病毒鉴定的准确性，可有效用于犬细小病毒的鉴定或辅助鉴定。

表1本发明试剂盒与对照试剂盒的检测结果

序列信息：

1)序列一

名称：SEQ ID NO.1

5’-CGCAAACATATGAAAATCAAGCA-3’

2)序列二

名称：SEQ ID NO.2

5’-GTGGTAGTTTTTTGACCATGTTG-3’

3)序列三

名称：SEQ ID NO.3

5’-Fam-ATGGTGATCCAAGATATGCATTTGG-BHQ1-3’

4)序列四

名称：SEQ ID NO.4

5’-CAACTAAAGTTTATAATAATGAT-3’

5)序列五

名称：SEQ ID NO.5

5’-GATCTCATAGCTGCTGGAGTAAATG-3’

6)序列六

名称：SEQ ID NO.6

5’-Vic-TAACTGCATCATTGATGGTTGCATTAGATA-BHQ1-3’

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种检测犬细小病毒的多重核酸组合物，其特征在于，其包括用于检测犬细小病毒的多重核酸组合物，所述多重核酸组合物包括两对引物和两条探针，所述引物对1和2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-2和SEQ ID NO.4-5所示，所述探针1和2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示。

2.根据权利要求1所述的多重核酸组合物，其特征在于，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，所述荧光报告基团为HEX、FAM、TET、CF532、JOE、TAMRA、ROX、CY3、CY5、Texas Red、NED、Alexa Flour或VIC，所述淬灭基团为MGB、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3或QSY。

3.一种检测试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1-2任一项所述的多重核酸组合物。

4.一种根据权利要求1-2任一项所述的多重核酸组合物在制备检测试剂盒中的应用。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂为冻干试剂或液体试剂。

6.根据权利要求1-2任一项所述的多重核酸组合物或权利要求3-5所述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定犬细小病毒中的应用；所述应用为非疾病诊断或治疗为目的的应用。