CN106947838B

CN106947838B - 非洲猪瘟病毒非结构基因实时荧光lamp检测引物组、试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN106947838B
Application number: CN201710398290.3A
Authority: CN
Inventors: 林志雄; 田纯见; 杨舒展; 段喻燕; 刘志玲; 罗琼; 陈茹
Original assignee: Guangzhou Customs Technology Center
Current assignee: Guangzhou Customs Technology Center
Priority date: 2017-05-31
Filing date: 2017-05-31
Publication date: 2020-12-01
Anticipated expiration: 2037-05-31
Also published as: CN106947838A

Abstract

本发明提供用于非洲猪瘟病毒(ASFV)非结构基因实时荧光LAMP检测的引物组、试剂盒及检测方法。该引物组引物组基于非结构DNA聚合酶G1211R基因设计，包括：FIP引物、BIP引物、F3引物、B3引物。检测结果出现典型的S形核酸扩增曲线，扩增产物具有特异的熔解曲线。以ASFVE70株病毒核酸为模板，LAMP检测灵敏度优于荧光PCR方法。重复性试验LAMP检测批内和间变异系数均小于5％。以ASFVArm07株制备各种临床模拟样品，检出阳性率达到17.31％。本检测方法可以为非洲猪瘟防控提供新的技术手段，有利于不同基因型毒株检测和出入境快速筛查。

Description

非洲猪瘟病毒非结构基因实时荧光LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种非洲猪瘟病毒非结构基因实时荧光LAMP检测的引物组、试剂盒及检测方法。

背景技术

非洲猪瘟(African Swine wine Fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASF)引起的猪烈性传染病，对生猪及肉产品国际贸易生重要影响。该病是我国一类动物疫，也是OIE(世界动物卫生组织，World Organisation for Animal Health)法定报告的动物疫病之一。目前，ASF疫情在欧洲由西向东扩散，波及俄罗斯、乌克兰及多个欧盟成员国。据OIE通报，今年第一季度俄罗斯、波兰立陶宛、乌克兰和南非等国家存在家猪和野猪持续感染。其中俄罗斯自2014年起在伏尔加格勒州等30个地区发生163起野猪和281起家猪非洲猪瘟疫情，871头野猪和10188头家猪感染。

但是，有关国家出入境检疫措施不够完善，快速诊断和早期预警措施不足。而在我国“一带一路”建设中，中欧贸易日益频繁，这对我国ASF防控提出新的严峻挑战。

由于对ASF不能进行预防接种和有效治疗，防控工作必须采取扑杀净化措施，严重干扰正常生产和活秩序，造成重大经济损失，已经成为我国养猪业的巨大威胁，其研究成果具有重大政治经济意义。

发明内容

为了解决上面的问题，本发明的目的在于提供非洲猪瘟病毒非结构基因实时荧光LAMP检测的引物组，该引物组特异性编码DNA聚合酶编码基因G1211R。

本发明的另一目的在于提供一种非洲猪瘟病毒非结构基因实时荧光LAMP检测试剂盒，该试剂盒采用环介导等温扩增技术通过对DNA聚合酶编码基因G1211R的检测，可以有效检出ASFV，为非洲猪瘟防控提供新的技术手段，有利于不同基因型毒株检测和出入境快速筛查。

本发明的第三个目的在于提供一种非洲猪瘟病毒非结构基因实时荧光LAMP检测方法，该检测方法可快速检出ASF，检测结果准确性高，重复性好。

为了实现上述目的，本发明提供非洲猪瘟病毒非结构基因实时荧光LAMP检测的引物组，所述引物组包括：FIP引物、BIP引物、F3引物、B3引物；

其中所述FIP引物序列如SEQ ID No.1所示；

BIP引物序列如SEQ ID No.2所示；

F3引物序列如SEQ ID No.3所示；

B3引物序列如SEQ ID No.4所示。

本发明另提供一种非洲猪瘟病毒非结构基因实时荧光LAMP检测试剂盒，所述试剂盒规格为48T反应体系，包含：

冻干反应管48支；

复溶液720μL；

阳性对照96μL；

阴性对照96μL；

DEPC蒸馏水384μL。

其中所述冻干反应管每支含FIP引物0.04nmols、BIP引物0.04nmols、F3引物0.005nmols、B3引物0.005nmols、BstDNA聚合酶大片段8U、dNTPs混合物35nmols和SYTO-9荧光染料0.01nmols；

所述FIP引物、BIP引物、F3引物、B3引物序列如上述所示；

所述复溶液含1mol/L甜菜碱、6mmol/LMgSO₄。

进一步地，所述阳性对照如SEQ ID No.5所示，浓度为1050ng/μL，阴性对照为DEPC蒸馏水。

阳性对照为ASFV的G1211R的CDS区，来自ASFV E70毒株核酸的G1211R的CDS区的重组质粒，也可以直接以ASFV E70毒株核酸作为阳性对照。

本发明另提供一种非洲猪瘟病毒非结构基因实时荧光LAMP检测方法，包括如下步骤：

1)提取待测样品基因组DNA，制成待检模板；

2)使用上述所述试剂盒提供的反应体系，25μL，冻干反应管1支，复溶液15μL，待检模板2μL，DEPC蒸馏水8μL；反应条件：60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃，每个温度反应10sec～30sec，65℃收集FAM荧光值，60个循环；

3)根据反应结果使用StepOne软件绘制S型核酸扩增曲线；

所述FIP引物、BIP引物、F3引物、B3引物序列如SEQ ID No.1～4所示；

所述复溶液含1mol/L甜菜碱、6mmol/LMgSO₄。

更进一步地，所述步骤2)中反应条件：60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃，每个温度反应10sec。

ASF与我国广泛流行的猪瘟、高致病性蓝耳等出血传染具有相似临床症状和病理变化，其鉴别诊断必须开展实验室检测。ASFV特异性分子生物学方法是重要的鉴别诊断工具。ASFV基因组为线状双股DNA，全长170～192kb。在其结构基因中，编码主要衣壳蛋白P72的基因B646L及与编码形态发生有关蛋白P54的基因E183L，目前常用于ASFV分子生物学诊断。但是，ASFV结构蛋白P72基因的病毒分子流行病学研究表明ASFV结构基因变异，世界各国流行毒株基因型不同，存在22个不同的基因型，如俄罗斯为基因Ⅱ型(2007～2011)、坦桑利亚为基因X型(2013)、乌干达为基因IX型(2013)等。这种结构基因分子差异和不同型出现，会影响地区ASFV毒株的分子诊断准确性。

因此，本发明提出在变异相对较少的非结构基因稳定区设计通用引物，保证针不同基因型病毒具有较高的检出率。本发明使用DNA聚合酶编码基因G1211R位于病毒基因组的中间保守区，作为ASFV检测的靶基因。

在引物设计过程中对三个ASFV分子检测靶基因进行BLAST分析，结果全部毒株完整基因序列一致(100％)的比例是DNA聚合酶基因G1211R(3636bp)26.09％、结构蛋白P72基因B646L(1940bp)18.75％及E183L基因(5526bp)9.90％。说明非结构蛋白基因稳定性较高，有利于通用型扩增引物设计。

环介导等温扩增(Loop-medmediated Isothermal Amplifycation，LAMP)方法具有快速、敏感和特异的技术特点，在动物疫病诊断中具有重要作用，值得深入研究和推广应用。本发明以ASFV非结构基因建立实时LAMP检测方法，并与荧光定量PCR进行比较。

本发明的有益效果在于：

本发明提供一种非洲猪瘟病毒非结构基因实时荧光LAMP检测的引物组、试剂盒及检测方法，通过在制备非结构基因检测标准物质的基础上，本发明建立了针对非结构基因检测的LAMP方法，通过检测变异相对较少的非结构基因，可以检测不同基因型病毒，其敏感性优于常规荧光PCR，特异性和重复性良效果良好，成功用于多种模拟样品检测。

附图说明

图1为本发明提供的非洲猪瘟病毒非结构基因实时荧光LAMP检测试剂盒的敏感性动力学曲线。

图2为本发明提供的非洲猪瘟病毒非结构基因实时荧光LAMP检测试剂盒的敏感性标准曲线。

图3为本发明提供的非洲猪瘟病毒非结构基因实时荧光LAMP检测试剂盒的敏感性实验结果图。

图4为荧光PCR的敏感性实验结果图。

图5为本发明通过荧光定量LAMP溶解曲线确定引物特异性的实验结果图。

图6为采用本发明提供的检测方法对ASFV及其他病毒的特异性试验结果图。

具体实施方式

下面以具体实施例来说明本发明的技术方案，然而，并非用于限制本发明的保护范围。

一、材料

1.ASFV E70毒株(基因I型)核酸(简称ASFV核酸)和Arm 07毒株(基因II型)灭活材料，均由ASF参考实验室CISA-INIA(西班牙)提供。

2.猪圆环病毒2型、伪狂犬病毒猪瘟及繁殖与呼吸综合征病毒由广东永顺生物制药股份有限公司惠赠。

3.蜱虫由本实验室采集和保存。

二、试剂和仪器

1.Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0plus dye)购自宝生物(大连)有限公司。

2.MagNA Pure 96高通量核酸分离纯化系统及配套核酸提取试剂购自罗氏公司。

3.引物由宝生物(大连)有限公司合成。

4.ABI StepOnePlus实时荧光定量PCR系统购自美国应用生物系统公司(ABI)，LAMP反应和荧光PCR反应均采用该系统进行，反应结果通过StepOne软件(v2.1)可自动绘制标准曲线。

本发明中未特别指出的反应试剂和仪器均为一般分子生物学实验室中常规试剂和仪器。

实施例1反应体系的建立

1.设计LAMP引物

利用在线软件BLAST进行ASFV基因序列比对，在线软件PrimerExplorer设计ASFV荧光定量LAMP的引物组，在线设计8组G1211R基因LAMP引物，利用序列保守性、结构特点和Ct值优选一组引物，如表1所示。

表1

2.设计荧光PCR引物

荧光PCR引物和探针按照OIE方法，其序列为：上游引物为SEQ ID No.6：5'-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-3'；下游引物为SEQ ID No.7：5'-GATACCACAAGATCRGCCGT-3'；探针为SEQ ID No.8：5'CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-3'，其5'端连有FAM基团，3'段连有TAMRA基团。该探针为TaqMan荧光探针，其报告荧光基团为FAM，一个淬灭荧光基团为TAMRA，采用的荧光是FAM荧光基团发出的。

3.构建ASFV E70株G1211R基因质粒

利用DNASTAR软件进行ASFV E70株G1211R基因克隆引物设计，序列为SEQ IDNo.9：(上游)5'-CGGTGATTACCCAACGAG-3'；SEQ ID No.10：(下游)5'-AGAAAGAAGGGCGACAAA-3'。

PCR反应体系为：Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0plus dye)12.5μL，ASFVE70株DNA模板2μL，上游引物(20μM)1μL，下游引物(20μM)1μL，DEPC蒸馏水8.5μL。

PCR反应条件为：98℃10s，57℃30s，72℃3min，30个循环。取电泳条带大小正确的PCR产物用于克隆测序，由宝生物(大连)有限公司完成。测序结果正确的重组质粒命名为pMD-ASFV-G1211R(1.81×10¹¹拷贝/μL)，-20℃保存备用。

实施例2

1.LAMP反应体系

制备冻干反应管：将FIP引物0.04nmols、BIP引物0.04nmols、F3引物0.005nmols、B3引物0.005nmols、BstDNA聚合酶大片段8U、dNTPs混合物35nmols和SYTO-9荧光染料0.01nmols混合后冻干制成。

LAMP反应液组成为：

冻干反应管1支，复溶液15μL，待检模板(ASFV核酸，浓度为1050ng/μL)2μL，DEPC蒸馏水8μL。60℃～65℃不同温度，每个温度反应10sec～30sec，65℃收集FAM荧光值，60个循环。

进一步优化条件60℃10sec、61℃10sec、62℃10sec、63℃10sec、64℃10sec和65℃10sec。

2.荧光PCR反应体系

荧光PCR反应参照文献方法(King等，2004)进行，其反应液组成为：PremixTaq(ExTaqVersion 2.0plus dye)12.5μL，待检模板(ASFV核酸，浓度为1050ng/μL)2μL，上游引物(50pmol)1μL，下游引物(50pmol)1μL，DEPC蒸馏水8.5μL。反应条件为：50℃2min；95℃10min；95℃15sec，58℃1min收集FAM荧光值，30个循环。

3.质粒标准品的标准曲线

将pMD-ASFV-G1211R质粒标准品进行10×连续稀释，应用LAMP反应体系按照上述条件进行检测，StepOne软件(v2.1)自动绘制标准曲线。

如图1和图2所示，图1为动力学曲线，图2为标准曲线，图1中A-E为pMD-ASFV-G1211R质粒标准品进行10×连续稀释的浓度，其中，A为1.81Х10⁹拷贝/μL、B为1.81Х10⁸拷贝/μL、C为1.81Х10⁷拷贝/μL、D为1.81Х10⁶拷贝/μL、E为1.81Х10⁵拷贝/μL。图2中1显示27.482、2显示23.259、3显示19.176、4显示17.628、5显示14.555。拟合直线方程为y＝-3.232x+30.714，相关系数(R²)为0.999，扩增效率为0.934。结果表明，所建立的实时荧光定量LAMP检测方法的Ct值与质粒标准品拷贝数以10为底的对数之间线性关系良好，所制备质粒标准品合格。

4.LAMP的敏感性试验

将ASFV E70毒株核酸(1050ng/μL)进行10×连续稀释，应用LAMP反应，体系按照上述条件进行敏感性检测，并与荧光PCR方法进行比较。结果如图3和图4所示，其中图3中A为10^-3、B为10^-4、C为10^-5；图4中D为10^-1、E为10^-2、F为10^-3，从图3和图4中可以看出，荧光定量LAMP检测ASFV核酸灵敏度达到10^-5以上，而荧光PCR的灵敏度为10^-3，说明荧光定量LAMP检测灵敏度可达荧光PCR的100倍以上。

5.通过荧光定量LAMP溶解曲线确定引物特异性

对ASFV荧光定量LAMP产物进行溶解曲线分析，确定引物特异性。溶解曲线反应程序为95℃15s，60℃1min，接着0.3℃/s升温到95℃15s，在升温过程中收集SYBR荧光值，形成荧光值随温度变化的溶解曲线。

如图5所示，在ASFV实时荧光定量LAMP熔解曲线中，82.02℃(Tm)处出现单一特异峰，无引物二聚体和非特异性产物，说明设计的引物具有特异性。

这里SYBR荧光值指仪器固定的读数通道，SYTO-9荧光染料发出的荧光可由该通道读取数值。

6.检测方法特异性实验

使用MagNA Pure 96高通量核酸分离纯化系统及配套核酸提取试剂提取猪圆环病毒2型、伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和蜱虫的核酸作为模板，与ASFV核酸一起应用LAMP反应体系分别进行检测，观察检测方法的特异性。

反应体系：冻干反应管1支，复溶液15μL，待检模板2μL，DEPC蒸馏水8μL。60℃～65℃不同温度，每个温度反应10sec，65℃收集FAM荧光值，60个循环。结果出现典型的S型核酸扩增曲线判定为阳性。

结果如图6所示，LAMP方法检测ASFV出现特异的S型扩增曲线(ASFV)，而猪圆环病毒2型、伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征和昆虫核酸均未出现特异扩增曲线(non-ASFV)。

7.检测方法的重复性试验

应用pMD-ASFV-G1211R质粒标准品进行批内和间重复性试验。以1.81×10⁶拷贝/μL、1.81×10⁷拷贝/μL和1.81×10⁸拷贝/μL三个滴度，均进行4个重复，评估批内变异情况。分别对每个稀释度连续进行4次试验，评估批间变异情况。获得数据在Excel软件计算平均Ct值、标准差(SD)和变异系数(CV)，如表2所示。

从表2中可以看出，三个滴度样品进行批内试验和批间试验结果，变异系数均小于5％，具有良好的重复性。

表2 ASFV荧光定量LAMP重复性试验

实施例3

抽取实验室保存的进出境猪血清样品30份，猪鼻拭子样品15份，猪尿液2份，猪场昆虫3份，猪饲料2份，共计52份。应用ASFV Arm 07株模拟强弱阳性样品，使用MagNA Pure96高通量核酸分离纯化系统及配套核酸提取试剂提取核酸，应用所建立的LAMP方法和荧光PCR进行检测，并以ASFV E70毒株核酸作为阳性对照，DEPC蒸馏水为阴性对照，比较两个方法的检测实用性，结果如表3所示。

LAMP方法反应体系(每个样品)：冻干反应管1支，复溶液15μL，待检模板或阳性对照或阴性对照2μL，DEPC蒸馏水8μL。60℃～65℃不同温度，每个温度反应10sec，65℃收集FAM荧光值，60个循环。结果出现典型的S型核酸扩增曲线判定为阳性。

荧光PCR反应体系(每个样品)：Premix Taq(Ex TaqVersion 2.0plusdye)12.5μL，待检核酸模板2μL，上游引物(50pmol)1μL，下游引物(50pmol)1μL，DEPC蒸馏水8.5μL。反应条件为：50℃2min；95℃10min；95℃15sec，58℃1min收集FAM荧光值，30个循环。结果出现典型的S型核酸扩增曲线判定为阳性。

表3 ASFV荧光定量LAMP对模拟样品的检测结果

从表3可以看出，LAMP检测阳性率17.31％，比荧光PCR方法高出1.93％。

从上述实施例可以看出，与常规荧光定量PCR方法比较，LAMP引物针对模板6～8个区段，其特异性更高；扩增过程无需变性与退火，所需时间更短；实时检测无需探针，成本更低。使用本发明提供的试剂盒和检测方法将体现出LAMP方法在ASF诊断中具有的技术优势，将在快速诊断和疫情防控工作中具有重大作用，为将ASFV阻挡于国门之外具有重大实践意义。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120> 非洲猪瘟病毒非结构基因实时荧光LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccccgaggat cttgtttcct 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtgccatagt gatgcacgt 19

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cggaacggtt cccttaacag ggtcaggatg atggccccac 40

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gacccaaatc aggcaaacga cggctagagg ctctgtggag t 41

<210> 5

<211> 3636

<212> DNA

<213> African swine fever virus

<400> 5

atgatatcta tcatggaccg ttctgagatt gttgcacggg agaacccggt gattacccaa 60

cgagttacaa atctcctaca aaccaatgct cctctactat tcatgcccat tgatatccat 120

gaagtacgat atggagccta cacacttttc atgtatggtt ccctcgaaaa cggttacaaa 180

gcagaagtaa ggattgaaaa catcccagtt ttctttgacg tacagattga gttcaatgat 240

acaaaccagc tttttttaaa gtcgctactg acggctgaaa atattgcgta tgaacggctg 300

gagacgctca cccagcgtcc tgtaatgggg taccgcgaga aggaaaaaga gtttgcacca 360

tacattcgaa tattttttaa aagcctgtat gagcgacgaa aagccattac ttacttgaat 420

aatatgggtt acaacaccgc cgcggacgac acaacctgtt actaccgaat ggtttcccga 480

gagctaaaac tgcctcttac aagttggata cagcttcagc actattccta cgagcctcgc 540

ggcttggtac acaggttttc cgtaaccccc gaggatcttg tttcctatca ggatgatggc 600

cccacagacc acagcatcgt tatggcctac gatatagaga cctatagccc tgttaaggga 660

accgttccgg acccaaatca ggcaaacgac gtggtgttca tgatatgcat gcgcattttt 720

tggattcact ccacagagcc tctagcgagc acgtgcatca ctatggcacc ctgcaaaaag 780

tcctcagagt ggaccaccat tctatgctcc tctgaaaaaa atttgctgtt aagctttgct 840

gaacagttca gccgctgggc tcctgatata tgcacagggt tcaatgattc tcggtacgac 900

tggcccttta tcgttgaaaa atctatgcag cacggtattc tagaagaaat ctttaacaaa 960

atgagccttt tctggcacca aaagctggat accattctaa aatgctatta tgtgaaggaa 1020

aagagagtca aaatctcggc cgaaaaatcg atcatttcct cctttttgca tacccctgga 1080

tgcctaccca ttgatgtccg caacatgtgt atgcagcttt accctaaagc cgaaaaaaca 1140

agcctaaaag cgtttttaga aaattgtggg ttagattcga aggtagacct gccctaccat 1200

ctcatgtgga agtattatga aacgcgagac agtgaaaaga tggccgacgt ggcctactac 1260

tgcattatag atgcccagcg ctgtcaggac cttctggtgc gccacaatgt tatccccgat 1320

cgcagagagg taggaatctt gtcatacacc tcgttgtatg actgtatcta ctacgcggga 1380

ggacataagg tatgtaatat gctcattgcc tatgctatcc atgatgagta cggccgtatt 1440

gcttgcagca ccattgctcg gggtaagcgg gaacacggaa aatatccggg cgcctttgtg 1500

attgaccccg ttaaagggct tgaacaggat aaacccacca ccggcctcga ttttgcgtcg 1560

ctgtacccct cactcatcat ggcctacaac ttttcgccag aaaaatttgt agcctctcgg 1620

gatgaggcaa aaagcctcat ggccaagggt gaatctcttc actacgtctc ctttcacttt 1680

aacaatcgtc tcgtggaagg atggtttgtg cgacataata acgttcctga taaaatggga 1740

ttatacccaa aagtactcat cgatctactt aacaaacgaa ccgcccttaa acaagagctt 1800

aaaaaactag gtgagaaaaa agaatgtatc catgaatccc atcctgggtt taaggaacta 1860

cagtttcgcc atgccatggt agacgcgaag caaaaggcgt tgaaaatttt catgaacacg 1920

ttttacggcg aggcaggtaa caatttgtcg cccttctttc tgcttcctct agccggagga 1980

gtcaccagtt cgggtcaata taatcttaaa ctcgtctata actttgttat caataaaggt 2040

tacggcatca agtacggtga caccgactca ttatacatta catgcccaga tagtctttat 2100

acagaggtaa cagacgcata tttaaatagc caaaaaacaa taaaacatta tgagcaactc 2160

tgccacgaaa aagtgcttct gtctatgaaa gccatgtcta cactatgcgc cgaggtgaat 2220

gaatacctgc ggcaagataa tggcaccagt tacctacgta tggcctacga ggaagtactc 2280

tttcctgtgt gctttacagg caagaaaaag tattacggta ttgctcatgt aaacacaccc 2340

aattttaata caaaagaatt attcatccgc ggaatagata tcattaagca gggtcaaaca 2400

aaactcacca aaacgatagg tacgcgaatt atggaagaat ccatgaaact gcgccgccct 2460

gaggaccatc gcccccctct tattgaaatc gttaaaacgg ttttgaagga tgctgtggtt 2520

aacatgaagc agtggaattt tgaagacttc atccaaacag atgcgtggag accggacaaa 2580

gacaacaaag cagtccaaat ctttatgtct cgcatgcacg ctcggcgtga gcaactaaaa 2640

aaacacggcg ccgcagcatc gcaatttgct gagcctgagc cgggagaacg cttctcctac 2700

gttatcgtgg aaaaacaagt acagtttgat attcagggcc accgcacaga ttcctccaga 2760

aagggggaca agatggaata cgtctctgaa gcaaaggcta aaaatcttcc aattgatata 2820

ttgttttata tcaacaacta tgttctaggc ttgtgcgcga gattcattaa tgaaaatgaa 2880

gaatttcaac cccctgacaa tgtcagcaat aaggatgaat acgctcagcg ccgagccaaa 2940

tcctacctac aaaaattcgt acaatccatt caccctaaag acaagtctgt cattaagcaa 3000

ggcattgttc atcgacagtg ctacaaatac gttcaccaag aaattaaaaa aaaaataggc 3060

atctttgccg acctttataa ggaatttttt aacaacacca caaaccccat cgaaagcttt 3120

attcaaagcg ctcggtttat gatacaatac tctgatggag aacaaaaagt aaaccattct 3180

atgaaaaaaa tggttgaaca gcgtgctact ttggcaagta agcccgctgg taagcccgct 3240

ggtaatccag ctggcaaccc agccggcaat gcgctgatgc gggctatatt tacgcagctg 3300

attacggaag aaaaaaaaat tgtacaagcc ttatacaata agggggatgc aatacacgat 3360

cttctcacct atatcattaa caatataaat tacaaaattg ccacgtttca gacgaaacag 3420

atgttgacgt tcgagttttc tagtactcat gtagaactgc tattaaagct gaataagacg 3480

tggcttattt tggctggaat tcatgtggcg aaaaaacatc tgcaagctct tttggattca 3540

tataataatg aaccaccgtc tagaacattc attcagcagg ctatagagga agaatgtggc 3600

agtattaaac catcttgcta cgactttatt tcctaa 3636

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctgctcatgg tatcaatctt atcga 25

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gataccacaa gatcrgccgt 20

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccacgggagg aataccaacc cagtg 25

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cggtgattac ccaacgag 18

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

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Claims

1.非洲猪瘟病毒非结构基因实时荧光LAMP检测的引物组，其特征在于，所述引物组基于非结构DNA聚合酶G1211R基因设计，包括：FIP引物、BIP引物、F3引物、B3引物；

其中所述FIP引物序列如SEQ ID No.1所示；

BIP引物序列如SEQ ID No.2所示；

F3引物序列如SEQ ID No.3所示；

B3引物序列如SEQ ID No.4所示。

2.一种非洲猪瘟病毒非结构基因实时荧光LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒规格为48T反应体系，包含：

冻干反应管48支；

复溶液 720μL；

阳性对照 96μL；

阴性对照 96μL；

DEPC蒸馏水 384μL；

其中所述冻干反应管每支含FIP引物0.04nmols、BIP引物0.04nmols、F3引物0.005nmols、B3引物0.005nmols、BstDNA聚合酶大片段8U、dNTPs混合物35 nmols和SYTO-9荧光染料0.01nmols；

所述FIP引物、BIP引物、F3引物、B3引物序列如权利要求1所示；

所述复溶液含1mol/L甜菜碱、6mmol/LMgSO₄；

所述阳性对照如SEQ ID No.5所示，阴性对照为DEPC蒸馏水。