CN111226805A

CN111226805A - 一种非洲猪瘟疫情下对我国猪种种质资源活体保种的方法及系统

Info

Publication number: CN111226805A
Application number: CN202010127887.6A
Authority: CN
Inventors: 周波; 郜思源
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2019-11-20
Filing date: 2020-02-28
Publication date: 2020-06-05

Abstract

本发明公开了一种非洲猪瘟疫情下对我国猪种种质资源活体保种的方法及系统。该方法包括利用多个废旧集装箱改造成的猪舍多点分散饲养种猪，所有集装箱猪舍单独管理；每周定期对猪只及周围环境进行一次抽样，检测其中是否有非洲猪瘟病毒基因，如果发现有阳性样本，再经过二次检测确认，后立即将被污染的集装箱中的猪只清空，清理猪舍，排出粪尿，然后利用将集装箱猪舍整体高温消毒，如果该集装箱猪舍周围环境也被污染难以彻底消毒，将集装箱进行高温消毒处理后，将集装箱转移到安全的区域，再次整体高温消毒后用于再次进猪复养。本发明可将种猪群分散在多个不同的集装箱猪舍中，减少中小规模猪场的非洲猪瘟防控风险。

Description

一种非洲猪瘟疫情下对我国猪种种质资源活体保种的方法及系统

技术领域

本发明属于饲养设备及模式领域，涉及一种非洲猪瘟疫情下对我国猪种种质资源活体保种的系统及方法。

背景技术

自从2018年8月3日非洲猪瘟疫情首次在我国被公布以来，该病毒在短短的不到一年时间内传遍我国除台湾省之外的32个省/自治区/直辖市/特别行政区，农业部官方公布有150多起疫情，有些省份还有多波次疫情发生。非洲猪瘟疫情导致发病猪场损失惨重，目前不论是现代化的大规模、条件一般的中等规模或简易的小型猪场，还是个体散养户，都有疫情报道。这说明该病防控难，风险因素多。由于该病暂时还没有可用的商业疫苗，防控只能靠生物安全措施。由于非洲猪瘟是一类传染病，一旦猪群感染该病，只有以扑杀的方式来消灭疫情。

我国是世界上地方猪种资源最多的国家，这些地方猪种是我国劳动人员长期选育形成的宝贵遗传资源，是我们养猪业可持续发展的基石。但是在当前非洲猪瘟情下，很多地方猪种保种场人人自危，虽然在积极做好生物安全的防控工作，但是由于很多地方猪场的抗打击能力极低，生物安全防控条件非常有限，一旦被非洲猪瘟疫情所拖累，一个地方猪种极有可能从此消亡。虽然，有些猪场也采取了一些生物技术措施(例如冷冻精液、卵子、胚胎或细胞等)来防止品种的灭门之灾，但这些生物技术由于各种技术限制和技术的普及程度等，还不能完全替代活体保种。因此，在当前形势下，急需研究一种能防控非洲猪瘟并成功进行活体保种的集成技术。

目前，规模猪场的非洲猪瘟防控难，一方面因为非洲猪瘟没有真正有效的商用疫苗可用，且非洲猪瘟病毒结构复杂，生存能力强，不易灭活，传染途径多，生物安全防控难度大；另一方面也是因为我国人口密集地区的猪场多不具有良好的生物安全防控条件，特别是一些位于华南、华东、华中的规模猪场，周边环境条件复杂，防控风险大。最后，一些国家级遗传资源保种场很多都没有分场，只有一个场，所有“鸡蛋在一个篮子里”，一旦在非洲猪瘟防控上失守，容易导致“全军覆没”，导致一个猪种的灭绝。

发明内容

本发明的目的是提供一种非洲猪瘟疫情下对我国猪种种质资源活体保种的系统及方法。

本发明的另一目的是提供一种非洲猪瘟疫情下能有效防控疫情减少损失，并能快速复产的系统及方法。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种非洲猪瘟疫情下对我国猪种种质资源活体保种的方法，包括利用多个废旧集装箱改造成的猪舍多点分散饲养种猪，所有集装箱猪舍单独管理，互不交叉，平时按非洲猪瘟防控要求做好各项生物安全防疫工作；每周定期对猪只及周围环境进行一次抽样，LAMP检测其中是否有非洲猪瘟病毒基因，如果发现有阳性样本，再经过二次检测确认，后立即将被污染的集装箱中的猪只清空，清理猪舍，排出粪尿，然后利用将集装箱猪舍整体高温消毒，如果该集装箱猪舍周围环境也被污染难以彻底消毒，将集装箱进行高温消毒处理后，将集装箱转移到安全的区域，再次整体高温消毒后用于再次进猪复养；其中LAMP检测非洲猪瘟病毒基因的引物如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示。

作为本发明方法的优选，所述的利用废旧集装箱改造成的猪舍设置有水泡粪池、全漏缝地板、风机，窗、门、自动饲料线管道、智能水料混合饲喂器、碗式节水型饮水器、猪栏、保温或降温设备、WIFI无线摄像头，保温层。所述的旧集装箱改造的猪舍，内部全部用耐高温内部材料，可以高温烘烤消毒，理论上60℃、30分钟以上就可以一步到位灭活非洲猪瘟病毒。多个旧集装箱猪舍，如果其中一个饲养的猪被非洲猪瘟感染，可以将猪只处理清空，清洗干净后，采用高温烘烤消毒，将猪舍转移到安全区域后，再次进行高温烘烤消毒后，就可以再次进猪复养。由于集装箱的面积相对于一般猪舍更小，可饲养的猪的头数不多(种猪8-12头/间；保育猪50-80头/间；育肥猪30-50头/间)，每个集装箱之间又是相互独立隔开，即使有一个集装箱中的猪被传染非洲猪瘟也不会在短期内扩散，易于控制。

所述的旧集装箱猪舍内部改造重在通风换气系统(风机+通风管道)和料线，夏天高温可以给集装箱上面搭遮荫棚，安装空调。由于吸血的蚊蝇等昆虫也可能传染非洲猪瘟，集装箱的所有门窗和出口要装上沙窗防蚊蝇等昆虫进入。集装箱用来养保育猪或育肥猪可实现全程不用人进入，采用自动喂料的料线+水料一体饲喂器、全漏缝地板+水泡粪池系统。除非设备损坏，一般不用人进入。对于母猪或公猪需要技术人员配种或采精操作的，可以集装箱为单位进行生产管理，防止交叉污染。如果要维修，先将猪转移到其他安全的集装箱后再进入维修。猪转移时要注意对转移用的车辆进行彻底消毒，对周围环境进行监测(采样后进行病毒检测)为阴性后才能转猪。集装箱与集装箱之间的道路用水泥浇制，要利于冲洗消毒。非洲猪瘟主要为猪只的接触传染，若无媒介非洲猪瘟病毒的直线传染距离在3米内，因此每个集装箱之间的距离最好要有5米以上，所有集装箱的进气口和出气口要一致，防止非温病毒在气溶胶中发生交叉污染。漏缝地板下面尽量采用水泡粪池，直接将粪尿导出。减少漏缝地板以下深度和基建的建造成本，方便转移，有条件的尽量多点分散安置集装箱猪舍。由于很多猪场的周边环境已被污染，还要做好非洲猪瘟传入猪舍的处置预案。由于地方猪种饲养在多个单独管理的集装箱猪舍中，非洲猪瘟病毒不可能同时将所有猪只感染。

所述的非洲猪瘟病毒检测设备及试剂可以提取样本中的DNA，然后使用本发明所提供的方法检测样本DNA中是否有非洲猪瘟病毒基因。定期对集装箱猪舍中的种猪进行口腔液样本和周围的环境(水源、地面灰土、蚊蝇等)样本进行非洲猪瘟病毒检测检测，为猪种活体保种增加一道保险。定期的疫情监控做到早发现早处置，可有效控制损失仅是一两个集装箱猪舍，将疫情消灭在萌芽状态。本发明方法检测非洲猪瘟病毒的灵敏度极高，可检出低至5个拷贝的病毒。

本发明所述的LMAP检测反应体系(25μL)为：引物1～2各5pmol；引物3～4各50pmol，dNTP 10pmol；Betaine 1M；MgSO4,6mM；Bst酶8-16U及Buffer；DNA模板2μL,将PCR小管在60-65℃，反应1小时，终止反应,离心后肉眼观察,管底有白色沉淀即为阳性，否则为阴性。

一种非洲猪瘟疫情下对我国猪种种质资源活体保种的系统，主要由多个废旧集装箱改造成的猪舍及猪舍类的饲养设备、大功率热风机、非洲猪瘟病毒设备及车辆用具的清洗消毒设备组成。

所述的集装箱猪舍由二手旧集装箱改造成而，包括耐高温的栏位、电动通风与防蚊蝇系统、降温/取暖系统、自动料线和饮水系统、漏缝板、地沟水泡粪系统等；所述的大功率热风机可用柴油或交流电，能将集装猪猪舍内部整体加温到80℃以上维持30分钟以上；所述的非洲猪瘟病毒水浴锅恒温检测试剂及方法可以采用更廉价设备(水浴锅)恒温扩增的方法可将低至5个拷贝的非洲猪瘟病毒的基因扩增出来进行检测，用于每周的定期抽样检测早期发现疫情，及时处置减小损失；所述的人员及车辆用具的清洗消毒设备可用于人员的洗澡更衣、车辆用具的清洗和整体消毒。

所述的人员洗澡消毒设施包括一个单向流动的淋浴间，人员洗澡后更换干净的衣物，所有衣物洗干净后经开水浸泡消毒30分钟。人员进入不同集装箱猪舍时都要重新更衣、消毒，禁止人员在集装箱之间未经更衣消毒交叉流动。工作服洗干净后每天用开水浸泡消毒再烘干或晒干，工作胶靴采用清净后采用可灭活非洲猪瘟病毒的消毒液浸泡过液。

所述的车辆用具的清洗消毒设备为一间隔热性较好的密闭单间，将要消毒的运猪车或用具等清洗干净晾干后，置于消毒设备内，用前述的热风机将消毒间内的温度加热到70℃持续40分钟，以确保能灭活非洲猪瘟病毒。

本发明提供的一种非洲猪瘟疫情下对我国猪种种质资源活体保种的系统及方法，具有以下有益效果：

(1)集装箱猪舍为金属制品，可耐高温，且内部空间相对传统猪舍更小，密封性好，方便高温消毒操作，能彻底灭活非洲猪瘟病毒，易于快速复产，可异地重复使用；

(2)旧集装箱猪舍相对传统房屋的猪舍更小，每间可饲养的猪只更少(种猪8-12头/间；保育猪50-80头/间；育肥猪30-50头/间)，集装箱猪舍相互之间独立，多个集装箱猪舍组合使用可现实多点分散猪群，即使单个集装箱被感染非洲猪瘟病毒也不容易传给其他猪舍，抗风险能力大大增强；

(3)旧集装箱易购买，改造成本较低，且结实耐用，搭建方便，将来不养猪也可以二次转卖或出租收回部分投资；

(4)旧集装箱猪舍利于异地快速复养，如果某个地块及周围环境(周边水源、地表土壤等)被非洲猪瘟病毒污染后，一般很难彻底消毒周围环境，这些集装箱猪舍可以经清洗消毒后转移到一个安全的区域，经二次整体高温消毒后可快速复养。

(5)每周一次定期的非洲猪瘟病毒检测利于及早发现非洲猪瘟病毒的入侵，及时查找漏洞，尽量消灭疫情于萌芽状态，减少损失。

(6)非洲猪瘟病毒水浴锅恒温(LAMP)检测试剂及方法，灵敏度比传统的PCR法高，理论上可检出低至5个拷贝的非洲猪瘟病毒，且成本更低，所需的仪器设备简单便宜，所有仪器耗材几千元即可购置，容易操作，DNA提取完成后，反应1小时即可用肉眼看出结果；采用非洲猪瘟病毒水浴锅恒温检测试剂及方法有利于场内建立非洲猪瘟病毒的检测体系，实现场内快速自检。

本发明可将种猪群分散在多个不同的集装箱猪舍中，减少中小规模猪场的非洲猪瘟防控风险。另外，集装箱猪舍具有密闭性和耐高温特性，能使用高温来消毒，使得消毒的成本更低，简单易行，效果更有保证。再配合定期非洲猪瘟病毒抽检，随时掌握非洲猪瘟防控动态，化被动为主动。即使万一某一两个集装箱猪舍没有防住，集装箱猪舍经过清理消毒后，可以转移到安全区域，重新整体加热消毒后快速复养。这些特点可保证种猪企业在非洲猪瘟疫情下可以长期生存，猪群的整体生产规模受影响小。

附图说明

图1为本发明提供的集装箱猪舍示意图；

其中，1为浅水泡粪池，2为全漏缝地板，3为电动风机，4为窗(含沙窗)，5为智能水料混合饲喂器，6为门，7为自动饲料管线，8为空调挂机，9为碗式饮水器，10为猪栏，11为WIFI无线摄像头，12集装箱外的保温层。

图2为本发明提供的在非洲猪瘟疫情下对我国猪种种质资源活体保种的系统及方法的技术路线示意图。

图3本发明非洲猪瘟病毒检测方法阳性照片。

图4LAMP产物和PCR产物电泳照片

图中左边为PCR扩增结果，其中泳道1，2,3为阳性样本，4为阴性样本；右边为LAMP扩增阳性样本的电泳图,其中5,6,7,8号泳道分别与1,2,3,4号泳道为相同的模板DNA扩增。

具体实施方式

实施例1

本实施例提供的一种非洲猪瘟疫情下对我国猪种种质资源活体保种的方法，如图2所示，多个(10个以上)集装箱猪舍(图1)被用来多点分散饲养种猪，舍内有猪栏10，自动饲料管线7，智能水料混合饲喂器(可根据猪群数量增加)5，碗式节水型饮水器(可根据猪群数量增加)9，全漏缝地板2，水泡粪池(深40-50cm)1，对于保育猪和育成猪平时没事可以不用人进入猪舍，通过WIFI无线摄像机11来观察室内猪只的情况。舍内装有风机3和窗4可用于通风换气，门6和窗4在同一面。舍内如果要饲养妊娠母猪或哺乳母猪也可以安全限位栏或产床。夏天或冬天可以利用空调8来降温或取暖，也可以安装一体式的湿帘风机和电暖风机来替代空调8，依据各地实际气候温度情况来处理。虽然集装箱内体积不大，但由于集装箱猪舍是金属的，保温性能不好，可以在外层加装耐高温的保温层12。

所述的旧集装箱猪舍内部改造重在通风换气系统(风机+通风管道)和料线，夏天高温可以给集装箱上面搭遮荫棚，安装空调。由于吸血的蚊蝇等昆虫也可能传染非洲猪瘟，集装箱的所有门窗和出口要装上沙窗防蚊蝇等昆虫进入。

所有集装箱猪舍单独管理，互不交叉，平时按非洲猪瘟防控要求做好各项生物安全防疫工作。每周定期进行一次抽样，包括集装箱猪舍周围水源、主要道路地面灰土、舍外蚊蝇样本、舍内猪只混合的口腔液样本等，购买商业化DNA提取试剂盒提取DNA后按照以下方法检测样本中非洲猪瘟病毒是否为阳性：

检测方法分为两步：1)采用专业的商业化DNA提取试剂盒提取样本DNA，如果是血样或唾液样，请用适用血样或唾液样的DNA提取试剂盒，如果是土壤样本，请用土壤DNA提取试剂盒。DNA提取的质量很重要，如果提取不合格，可能会影响检测效果；2)采用水浴锅恒温扩增(LAMP)检测非洲猪瘟病毒基因。具体来说，所需的仪器设备有：小离心机1台(可离心PCR管)，可恒温加热的水浴锅1台，移液器1套(1000μL、200μL、20μL、10μL各1支)，温度计1支。样本的DNA的提取可参考相关商业DNA提取试剂盒说明书。非洲猪瘟的检测，依据非洲猪瘟病毒基因组全序列(NCBI：AY261361.1)，采用Primer Explorer设计引物，采用以下反应体系(25μL)：DNA模板2μL，引物1 5’-cggcgcaaaattttagccgg-3’，(seq d no.1)和引物25’-gagccgaagcttcctatgcc-3’(seq d no.2)，各5pmol；引物3

5’-cgcaacgtagcccccgaactggaaatgcttcgcytccaaca-3’(seq d no.3)和引物4

5’-tcaccatggcgacatgtcgtggatagaggtgggaggagc-3’(SEQ D NO.4)，各50pmol；dNTP 10pmol；Betaine 1M；MgSO₄，6mM；Bst酶8-16U及相应Buffer至25μL总体积(按Bst酶的商业说明书操作)；。反应体系配好以后，将PCR小管放在水浴锅中，水浴锅水温恒定60-65℃(最在水浴锅中插入一个温度计以校准水温)1小时，然后拿出PCR小管，用小离心机离心3min，用肉眼可见管底有白色沉淀(Mg₂P₂O₇)即为阳性(图3)，否则为阴性。利用该方法检测一系列样本。为了验证该方法的可行性，先用专业试剂盒提取猪血液样本的DNA，采用非洲猪瘟病毒基因组的PCR引物(P72F：5'-atggataccgagggaatagc-3'(SEQ D NO.5)；P72R：5'-cttaccgatgaaaatgatac-3'(SEQ D NO.6))进行常规PCR扩增：17.375μL灭菌水、2.5μL 10×PCR Buffer II、2μL MgCl2(25mmol/L)、0.5μL dNTP混合液(10mmol/L)、0.25μL引物P72F和P72R(20pmol/μL)、2.0μL DNA样品、0.125μL Taq Gold DNA聚合酶(5U/μL)。同时，将相同的处理后的血液样本采用上述非洲猪瘟病毒水浴锅恒温(LAMP)检测试剂及方法检测。然后将LAMP的产物和PCR产物都进行电泳检测，检测所得结果表明LAMP产物和PCR产物结果一致(图4)，这证明了本方法可行。

对于发现的阳性样本，再经过二次检测确认，后立即将被污染的集装箱中的猪只清空，清理猪舍，排出粪尿，然后利用2台大功率热风机将集装箱猪舍整体高温消毒(70℃以上，持续30分钟)。如果该集装箱猪舍周围环境也被污染(如水源、土壤、蚊蝇等检测到非洲猪瘟阳性)难以彻底消毒，将集装箱进行高温消毒处理后，用吊车将集装箱转移到安全的区域，再次整体高温消毒后就马上可以再次进猪复养了。由于种猪被多点分散到不同的集装箱猪舍饲养，相互不交叉，增加了抗风险能力，再加上定期的非洲猪瘟检测，查漏补缺，认真做好生物安全防控工作，可将疫情消灭在萌芽状态。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种非洲猪瘟疫情下对我国猪种种质资源活体保种的方法及系统

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cggcgcaaaa ttttagccgg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gagccgaagc ttcctatgcc 20

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgcaacgtag cccccgaact ggaaatgctt cgcytccaac a 41

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcaccatggc gacatgtcgt ggatagaggt gggaggagc 39

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggataccg agggaatagc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cttaccgatg aaaatgatac 20

Claims

1.一种非洲猪瘟疫情下对我国猪种种质资源活体保种的方法，其特征在于利用多个废旧集装箱改造成的猪舍多点分散饲养种猪，所有集装箱猪舍单独管理，互不交叉，平时按非洲猪瘟防控要求做好各项生物安全防疫工作；每周定期对猪只口腔液及周围环境进行一次抽样，LAMP检测其中是否有非洲猪瘟病毒基因，如果发现有阳性样本，经过二次检测确认后立即将被污染的集装箱中的猪只清空，清理猪舍，排出粪尿，然后将集装箱猪舍整体高温消毒，如果该集装箱猪舍周围环境未被污染,则再次进猪复养；如果该集装箱猪舍周围环境也被污染难以彻底消毒，将集装箱进行高温消毒处理后，将集装箱转移到安全的区域，再次整体高温消毒后用于再次进猪复养；其中LAMP检测引物如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的利用废旧集装箱改造成的猪舍设置有水泡粪池(1)、全漏缝地板(2)、风机(3)，窗(4)、门(6)、自动饲料线管道(7)、智能水料混合饲喂器(5)、碗式节水型饮水器(9)、猪栏(10)、保温或降温设备(8)、WIFI无线摄像头(11)，保温层(12)。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的多个旧集装箱改造的猪舍要单独管理，距离5米以上，舍内用具、衣物等互不交叉使用，人员未经洗澡、更衣换鞋洗手消毒不得进入舍内，从一间猪舍到别一间猪舍需经过再次的洗澡、更衣换鞋洗手消毒后才可进入，工作服洗干净后每天用开水浸泡消毒再烘干或晒干，工作胶靴采用清净后采用可灭活非洲猪瘟病毒的消毒液浸泡过液。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的多个旧集装箱改造的猪舍及内部饲养设备选用可耐100℃高温的材料制成，使用1-2台大功率热风机将集装箱内部整体温度升到70℃并维持30分钟以上的方式进行消毒灭活非洲猪瘟病毒。

5.一种非洲猪瘟疫情下对我国猪种种质资源活体保种的系统，其特征在于主要由多个废旧集装箱改造成的猪舍及猪舍类的饲养设备、大功率热风机、非洲猪瘟病毒设备及车辆用具的清洗消毒设备组成。

6.根据权利要求5所述的系统，其特征在于所述的利用废旧集装箱改造成的猪舍设置有水泡粪池(1)、全漏缝地板(2)、风机(3)，窗(4)、门(6)、自动饲料线管道(7)、智能水料混合饲喂器(5)、碗式节水型饮水器(9)、猪栏(10)、保温或降温设备(8)、WIFI无线摄像头(11)，保温层(12)；集装箱的所有门窗和出口设有防蚊蝇的沙窗。

7.根据权利要求5所述的系统，其特征在于每个集装箱之间的距离在5米以上。

8.根据权利要求5所述的系统，其特征在于所述的非洲猪瘟病毒设备为能控温60-65℃的水浴锅，所述的人员洗澡消毒设施包括一个单向流动的淋浴间，所述的车辆用具的清洗消毒设备为一间隔热性较好的密闭单间。

9.一种非洲猪瘟病毒检测的引物组合物，其特征在于由SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示的引物P1～P4组成。

10.权利要求9所述的引物组合物在制备非洲猪瘟病毒检测试剂中的应用。