CN110791592A - 一种快速检测非洲猪瘟病毒的引物以及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种快速检测非洲猪瘟病毒的引物以及试剂盒，所述引物具有4个，而试剂盒包括检测非洲猪瘟病毒的核酸的引物以及18μL的反应液，所述反应液具体由下列试剂组成：40mM KCl 1.8μL、100mM(NH4)2SO4 1.8μL、80mM MgSO4 1.8μL、1％Tween‑20 1.8μL、28mM dNTPs 0.9μL、8000U/mL的Bst酶1.8μL、60U特异性核酸内切酶FEN1 0.18μL、1mM SYBRGREEN荧光染料0.9μL、4.0x10‑5mol/L的金纳米颗粒1.8μL、超纯水0.22μL；与现有技术相比，本发明具有如下优点：提供了4条不同的特异性引物，故而对非洲猪瘟病毒的检测结果准确度更高，结合改良后的LAMP技术与微流控芯片技术，即可以快速给出准确的检测结果，又达到同一样品多个不同指标联检的目的。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及快速检测非洲猪瘟病毒的引物以及试剂盒。
背景技术
非洲猪瘟(African Swine fever，ASF)，是一种急性、发热传染性很高的滤过性病毒所引起的猪病，其特征是发病过程短，但死亡率高达100％，临床表现为发热，皮肤发绀，淋巴结，肾，胃肠粘膜明显出血。世界卫生组织(OIE)将其列为必须通报疾病，而非洲猪瘟的检测技术有酶联免疫(ELISA)、聚合酶链式反应(PCR)和环介导等温扩增法(LAMP)，其中，酶联免疫(ELISA)只能用于检测动物体内是否有非洲猪瘟病毒的抗体，确切的说只能检测已经感染或者接种过疫苗的猪群，而对非洲猪瘟的疫情监测起不到很好的效果；而PCR技术较为经典，但其反应要在2个不同的温度区循环，对仪器要求高，成本也相对高昂，并且PCR技术仅需1对扩增引物，易受干扰，特异性相对不足，且出结果时间较久，操作专业要求高，微量加量步骤多；环介导等温扩增法是一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶的作用下，60--65℃恒温扩增，15-60min左右即可核酸扩增，效率可达109～1010个数量级，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。
微流控(Microfluidics)芯片技术可把样品检测过程集成到一个数平方厘米的芯片上，具有集成化、样品消耗少、通量高等优势，其灵敏度及反应时间均优于PCR反应，将两者结合起来，可实现对核酸的高通量快速检测，对于发展生物分子快速诊断具有重大的意义。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种能快速检测洲猪瘟病毒的引物。
本发明所要解决的第二个技术问题是针对现有技术的现状提供一种应用有能快速检测洲猪瘟病毒的引物的试剂盒。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：该非洲猪瘟病毒的核酸，其特征在于：所述核酸的序列为SEQ NO.1。
为解决第一个技术问题，本发明还提供一种检测上述非洲猪瘟病毒的核酸的引物，其特征在于：所述引物为
AP1：GCTGTAATGGACCTCAAACC；
AP2：AAAGTCCAGGAAATTCATTCA；
AP3：TCTCGTTAAACCAAAAGCGCACCTAAATACTATCAGCCCCCT；
AP4：CGTGAACCTTGCTATTCCCTCGCAAATCCTTTTGCGATGCA。
为解决第二个技术问题，本发明还提供一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求2所述的检测非洲猪瘟病毒的核酸的引物以及18μL的反应液，所述反应液具体由下列试剂组成：
40mM KCl 6.8μL
100mM(NH4)2SO4 1.8μL
80mM MgSO4 1.8μL
1％Tween-20 1.8μL
28mM dNTPs 0.9μL
8000U/mL Bst酶 1.8μL
60U特异性核酸内切酶FEN1 0.18μL
1mM SYBRGREEN荧光染料 0.9μL
4.0x10-5 mol/L金纳米颗粒 1.8μL
超纯水 0.22μL；
而所述检测非洲猪瘟病毒的核酸的引物的浓度和体积为：90μM的AP1引物0.5μL、90μM的AP2引物0.5μL、180μM的AP3引物2μL、180μM的AP4引物2μL，其中，该试剂盒选用8样本芯片，即1个加样孔对应4个检测孔，第1检测孔和第2检测孔各包埋扩增非洲猪瘟病毒序列的引物(浓度为90μM的AP1 0.5μL，浓度为90μM的AP2 0.5μL，浓度为180μM的AP3 2μL，浓度为180μM的AP4 2μL)，第3检测孔是空白，第4检测孔包埋内参引物和内参质粒(内参序列选取与非洲猪瘟病毒序列无关的系列)，冻干。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：提供了4条不同的特异性引物，故而对非洲猪瘟病毒的检测结果准确度更高，结合改良后的LAMP技术与微流控芯片技术，改良后的LAMP技术为基因扩增反应原理，在试剂盒中加入的金纳米颗粒，可以吸附ssDNA和蛋白酶，从而抑制升温过程中的非特异性反应，达到热启动的目的，避免在升温过程中的非特异性反应；同时也加入了特异性核酸内切酶FEN1，与Bst酶共同起作用，将扩增遇到茎环结构的双链部分替换剪切掉，最终特异形成扩增产物；结合改良后的LAMP技术与微流控芯片技术，即可以快速给出准确的检测结果，又达到同一样品多个不同指标联检的目的，即可以快速给出准确的检测结果，又达到同一样品多个不同指标联检的目的，同时，反应试剂预埋于微流控芯片上，用户只需加入样品，操作简便，仪器配备锂电池，便于现场快检。
附图说明
图1为本发明实施例中微流控芯片法的检测流程；
图2为本发明实施例中带有非洲猪瘟病毒基因片段进行检测限实验的质粒105copies/μL的扩增结果图；
图3为本发明实施例中带有非洲猪瘟病毒基因片段进行检测限实验的质粒104copies/μL的扩增结果图；
图4为本发明实施例中带有非洲猪瘟病毒基因片段进行检测限实验的质粒103copies/μL的扩增结果图；
图5为本发明实施例中带有非洲猪瘟病毒基因片段进行检测限实验的质粒102copies/μL的扩增结果图；
图6为本发明实施例中带有非洲猪瘟病毒基因片段进行检测限实验的质粒101copies/μL的扩增结果图；
图7为本发明实施例中带有非洲猪瘟病毒基因片段进行检测限实验的质粒100copies/μL的扩增结果图；
图8为本发明实施例中带有非洲猪瘟病毒基因片段的阳性对照的扩增结果图；
图9为本发明实施例中阴性对照的扩增结果图；
图10为带有非洲猪瘟病毒基因片段进行重复性实验时的质粒104copies/μL的扩增结果图(扩增曲线1对应重复性实验组1、扩增曲线2对应重复性实验组2、扩增曲线3对应重复性实验组3、扩增曲线4对应重复性实验组4、扩增曲线5对应重复性实验组5、扩增曲线6对应重复性实验组6、扩增曲线7对应重复性实验组7、扩增曲线8对应重复性实验组8、扩增曲线9对应重复性实验组9、扩增曲线10对应重复性实验组10)；
图11为带有非洲猪瘟病毒基因片段进行重复性实验时的质粒104copies/μL的阴性对照结果图；
图12为带有非洲猪瘟病毒基因片段进行重复性实验时的质粒104copies/μL的阳性对照结果图；
图13为猪瘟活疫苗核酸、猪繁殖与呼吸综合征活疫苗核酸、猪伪狂犬病活疫苗核酸、猪圆环病毒2型培养液核酸、猪细小病毒细胞培养液核酸的扩增结果图；
图14为图13的阳性对照结果图；
图15为图13的阴性对照结果图。
具体实施方式
实施例
先通过NCBI GenBank寻找目标序列，并针对目标序列设计引物，并将其分别固定在微流控芯片相应位置后对微流控芯片进行封装，与从猪肉及其各种脏器、血液、排泄物、环境样本和细胞培养物中提取的核酸模板混合反应后，加入到封装好的微流控芯片中，之后放入到带有离心功能、恒温功能及实时荧光检测的微流控芯片检测仪中，利用离心力驱动样品进入微流控芯片反应孔，进行恒温扩增。若样本中含有目的片段而得到恒温扩增，扩增产物与荧光物质进行有效的结合，通过荧光检测仪实时捕获荧光信号，直观的反应扩增产物的产生，根据实时荧光信号的出现时间、强度和位置，判断样本中是否含有ASFV。其中：微流控芯片法的检测流程见附图1；
具体的操作步骤如下：
1、微流控芯片检测体系中18μL反应液的组成如下：
40mM KCl 6.8μL
100mM(NH4)2SO4 1.8μL
80mM MgSO4 1.8μL
1％Tween-20 1.8μL
28mM dNTPs 0.9μL
8000U/mL Bst酶 1.8μL
60U特异性核酸内切酶FEN1 0.18μL
1mM SYBRGREEN荧光染料 0.9μL
4.0x10-5 mol/L金纳米颗粒 1.8μL
超纯水 0.22μL
而检测非洲猪瘟病毒的核酸的引物的浓度和体积为：90μM的AP1引物0.5μL、90μM的AP2引物0.5μL、180μM的AP3引物2μL、180μM的AP4引物2μL，其中，该试剂盒选用8样本芯片，即1个加样孔对应4个检测孔，第1检测孔和第2检测孔各包埋扩增非洲猪瘟病毒序列的引物(浓度为90μM的AP1 0.5μL，浓度为90μM的AP2 0.5μL，浓度为180μM的AP3 2μL，浓度为180μM的AP4 2μL)，第3检测孔是空白，第4检测孔包埋内参引物和内参质粒(内参序列选取与非洲猪瘟病毒序列无关的系列)，冻干。
并取32μL的非洲猪瘟病毒的核酸，该核酸的序列参考SEQ NO.1；
然后将反应液18μL与模板核酸32μL混合，加入到芯片的加样孔，再将加样孔用封口膜封住，上机；
温度设定为63.5℃，反应时间设定为30min。
2、微流控芯片上机扩增：
由于本方法采用的是恒温扩增，不需要经过PCR扩增的变性、退火和延伸等变温过程，整个反应过程在恒温条件下完成，扩增程序：温度设定为63.5℃，反应时间设定为30min。运行程序：低速离心转速为1600r/min，低速离心时间为10sec，高速离心转速为4600r/min，高速离心时间为30sec。
3、微流控芯片结果判断：
3.1微流控芯片检测仪阈值线设置
阈值线一般情况设置为800(可根据实际情况进行调整，设定原则以阈值线刚好超过非典型S型扩增曲线的最高点，且Ct值显示为30)，仪器配套软件自动分析结果。
3.2质量控制
内参在Ct值<30时，出现扩增曲线，实验结果有效。(内参可以防止实验的假阴性)
3.3结果判定
3.3.1实验成立条件
阳性对照：Ct<30，阳性对照的反应孔有明显的典型S型扩增曲线。
阴性对照：Ct<30，阴性对照的反应孔无扩增曲线。
3.3.2判定标准
阳性：反应孔出现Ct<30，有明显扩增曲线，判定为阳性。
阴性：反应孔出现Ct<30，无扩增曲线，判定为阴性。
在微流控芯片检测仪上进行微流控芯片的恒温扩增，仪器会进行实时荧光检测，根据荧光检测的有效扩增曲线进行判读，任意一孔或者多孔中有标准的S型的扩增曲线，则该孔判断为阳性，即该样本中含有对应检测孔的病毒核酸；没有扩增曲线的孔为判断为阴性，即该样本不含有对应检测孔的病毒核酸。
本发明的智能可移动核酸微流控检测仪所提出的微流控芯片解决方案，相比市面上的LAMP管式恒温技术，彻底克服了LAMP等温扩增的诸多缺陷，实现了操作简便、多靶点、同步、一体化的检测效果，且出结果时间短，也可以实现1次可以测同一样品的8个不同指标。以改良后的LAMP技术为基因扩增反应原理，在反应体系里加入金纳米颗粒，可以吸附ssDNA和蛋白酶，从而抑制升温过程中的非特异性反应，达到热启动的目的，避免在升温过程中的非特异性反应；同时也加入了特异性核酸内切酶FEN1，与Bst酶共同起作用，将扩增遇到茎环结构的双链部分替换剪切掉，最终特异形成扩增产物；结合改良后的LAMP技术与微流控芯片技术，即可以快速给出准确的检测结果，又达到同一样品多个不同指标联检的目的，同时，反应试剂预埋于微流控芯片上，用户只需加入样品，操作简便，仪器配备锂电池，便于现场快检。本发明研制的智能可移动核酸微流控检测仪所提出的微流控芯片解决方案，相比市面上的LAMP管式恒温技术，彻底克服了LAMP等温扩增的诸多缺陷，实现了操作简便、多靶点、同步、一体化的检测效果。
4、检测非洲猪瘟病毒的引物的敏感性及检测限的验证：
4.1实验材料
4.1.1试剂：反应液；用无菌水分别稀释为1×105copies/μL、1×104copies/μL、1×103copies/μL、1×102copies/μL、1×101copies/μL、1×100copies/μL的带有非洲猪瘟病毒基因片段的质粒；阴性对照；阳性对照。
4.1.2仪器：恒温扩增仪；掌上离心机；移液器。
4.1.3检测体系
参照上述的检测体系进行实验操作，然后把上好样的芯片放进恒温扩增仪进行试验检测，扩增结果可如图2、3、4、5、6、7、8、9，从上面图2～9检测限的结果看，图2～图6以及图8的阳性对照的结果都出现了典型的S型扩增曲线，而图7以及图9的结果均在基线位置，说明该检测体系的最低检测限是1×101copies/μL的质粒，此时的Ct小于30min，说明灵敏度很高。
4.2检测非洲猪瘟病毒的引物的重复性的验证
4.2.1实验材料
试剂：反应液；1×104copies/μL的质粒；阴性对照；阳性对照。
仪器：恒温扩增仪；掌上离心机；移液器。
4.2.2检测体系
参照上述1中的检测体系进行实验操作，然后把芯片放进恒温扩增仪进行试验检测。
4.2.3重复性的验证的结果参照表格2
| 重复 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| Ct值 | 7.42 | 7.97 | 8.07 | 7.85 | 7.94 | 7.41 | 7.82 | 7.62 | 8.02 | 7.92 |
经计算，Ct值的变异系数(CV，％)为3.0％，重复性好，小于5％。，符合要求，同时也可参考图10、11、12中的扩增结果图，并从图10的各个扩增曲线对应的结果可看出各组曲线相差不大，应证了重复性好的结果。
4.3检测非洲猪瘟病毒的引物的特异性的验证
4.3.1实验材料
试剂：反应液；猪瘟活疫苗核酸；猪繁殖与呼吸综合征活疫苗核酸；猪伪狂犬病活疫苗核酸；猪圆环病毒2型培养液核酸；猪细小病毒细胞培养液核酸；阴性对照；阳性对照。
仪器：恒温扩增仪；掌上离心机；移液器。
4.3.2检测体系
参照上述的检测体系进行实验操作，然后把芯片放进恒温扩增仪进行试验检测。
4.3.3扩增结果
扩增结果可参考图13～15，从图13～15的结果可知，猪瘟活疫苗核酸；猪繁殖与呼吸综合征活疫苗核酸；猪伪狂犬病活疫苗核酸；猪圆环病毒2型培养液核酸；猪细小病毒细胞培养液核酸均无扩增曲线，说明该引物只能特异性地扩增检测出非洲猪瘟病毒核酸，特异性好，一般不会与其它病原菌产生交叉反应。
序列表
<110> 宁波爱基因科技有限公司
<120> 一种快速检测非洲猪瘟病毒的引物以及试剂盒
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2092
<212> DNA
<213> African Swine fever
<400> 1
ttcatttttt ttaaagatga agatttttta gatgattttt tttagttttt taaaaagacg 60
aaaaaatttt ttaaaagacg aatattctta atccccgcaa attacttttt tttaggtact 120
gtaacgcagc acagctgaac cgttctgaag aagaagaaag ttaatagcag atgccgatac 180
cacaagatca gccgtagtga tagaccccac gtaatccgtg tcccaactaa tataaaattc 240
tcttgctctg gatacgttaa tatgaccact gggttggtat tcctcccgtg gcttcaaagc 300
aaaggtaatc atcatcgcac ccggatcatc gggggtttta attgcattgc ctccgtagtg 360
gaagggtatg taagagctgc agaactttga tggaaactta tcgataagat tgataccatg 420
agcagttacg gaaatgtttt taataatagg taatgtgatc ggatacgtaa cggggctaat 480
atccgatata gatgaacatg cgtctggaag agctgtatct ctatcctgaa agcttatctc 540
tgcgtggtga gtaggctgca taatggcgtt aacaacatgt ccgaacttgt gccaatctcg 600
gtgttgatga ggattttgat cggagatgtt ccaggtaggt tttaatccta taaacatata 660
ttcaatgggc catttaagag cagacattag tttttcatcg tggtggttat tgttggtgtg 720
ggtcacctgc gttttatgga cacgtatcag ggaaaatcga acgcgtttta caaaaaggtt 780
gtgtatttca ggggttacaa acaggttatt gatgtaaagt tcattatccg tgagcgagat 840
ttcattaatg actcctggga taaaccatgg tttaaagcgt atattgcgtc tactggggcg 900
tccaggtata aaacgcgact ggcgtataaa aagtccagga aattcattca ccaaatcctt 960
ttgcgatgca agctttatgg tgataaagcg ctcgccgaag ggaatggata ccgagggaat 1020
agcaaggttc acgttctcgt taaaccaaaa gcgcagctta atccagagcg caagaggggg 1080
ctgatagtat ttaggggttt gaggtccatt acagctgtaa tgaacattac gtcttatgtc 1140
cagatacgtt gcgtccgtaa taggagtaat atcttgttta cctgctgttt ggatattgtg 1200
agagttctcg ggaaaatgtt gtgaaaggaa tttcgggttg gtatggctgc acgttcgctg 1260
cgtatcattt tcatcggtaa gaataggttt gctttggtgc ggcttgtgca aatcatgaat 1320
gttgcatagg agagggccac tagttccctc caccgatacc tcctggccga ccaagtgctt 1380
atatccagtc attttatccc ctgggatgca aaatttgcgc acaagcgttg tgacatccga 1440
actatattcg tccagggaat ttccatttac atcgaatctt acgttttcat aaagtcgttc 1500
tccggggtat tcgcagtagt aaaccaagtt tcggtacgca ttctttgtgc cgggtacaat 1560
aggtcttcca aagggatcta caagcgtgta aacggcgccc tctaaaggtg tttggttgtc 1620
ccagtcatat ccgttgcgag gaaacgtttg aagctgacca tgggccccca tctgggccgt 1680
gccctgaatc ggagcatcct gccaggacga atgacatgca cccaatatat ggtggcccac 1740
catatcatgg aaaaagtctc cgtactgggg aataccaaag gtaagcttgt ttcccaaggt 1800
gggggtaccc gtatgcgggc gtactttatt gtattcaaac cctactggaa cataaggctt 1860
aaaatgcgca ttaaaatgaa ccaaatgtgt ttcttcgatt tgactcaaag tgggttcggg 1920
gtcgggtttc ccataacttt tgttcacatt tttaatgtta gaaatcctgc tattaagcaa 1980
gtcttgggcc aatataatct tgtcggcctt cccatcgtta gcaataagac aaaaagctcc 2040
tcctgatgcc atatataatg ttataaaaat aatttattgt ttttattaaa ta 2092
Claims (3)
1.一种非洲猪瘟病毒的核酸，其特征在于：所述核酸的序列为SEQ NO.1。
2.一种检测非洲猪瘟病毒的核酸的引物，其特征在于：所述引物为
AP1：GCTGTAATGGACCTCAAACC；
AP2：AAAGTCCAGGAAATTCATTCA；
AP3：TCTCGTTAAACCAAAAGCGCACCTAAATACTATCAGCCCCCT；
AP4：CGTGAACCTTGCTATTCCCTCGCAAATCCTTTTGCGATGCA。
3.一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求2所述的检测非洲猪瘟病毒的核酸的引物以及18μL的反应液，所述反应液具体由下列试剂组成：
40mM KCl 6.8μL、100mM(NH4)2SO4 1.8μL、80mM MgSO4 1.8μL、1％Tween-201.8μL、28mMdNTPs 0.9μL、8000U/mL Bst酶1.8μL、60U特异性核酸内切酶FEN1 0.18μL、1mM SYBRGREEN荧光染料0.9μL、4.0x10-5mol/L金纳米颗粒1.8μL、超纯水0.22μL；
而所述检测非洲猪瘟病毒的核酸的引物的浓度和体积为：90μM的AP1引物0.5μL、90μM的AP2引物0.5μL、180μM的AP3引物2μL、180μM的AP4引物2μL。
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- 2019-12-04 CN CN201911226531.1A patent/CN110791592A/zh active Pending
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