CN111961755A - 一种高效检测猪细小病毒的引物以及试剂盒 - Google Patents
一种高效检测猪细小病毒的引物以及试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111961755A CN111961755A CN202010840287.4A CN202010840287A CN111961755A CN 111961755 A CN111961755 A CN 111961755A CN 202010840287 A CN202010840287 A CN 202010840287A CN 111961755 A CN111961755 A CN 111961755A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ppv
- reaction
- porcine parvovirus
- kit
- amplification
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000702619 Porcine parvovirus Species 0.000 title claims abstract description 27
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 29
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims abstract description 7
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims abstract description 7
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims abstract description 5
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims abstract description 5
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 5
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L magnesium sulphate Substances [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 9
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 5
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 25
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 abstract description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 abstract description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 abstract description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 abstract description 2
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 abstract description 2
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 abstract 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 32
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 31
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 18
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 16
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 16
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 10
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 6
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 208000005342 Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 2
- 241001673669 Porcine circovirus 2 Species 0.000 description 2
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 2
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 208000009305 pseudorabies Diseases 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 208000002254 stillbirth Diseases 0.000 description 2
- 231100000537 stillbirth Toxicity 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 208000007212 Foot-and-Mouth Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000008071 Parvoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010057343 Parvovirus infection Diseases 0.000 description 1
- 241001135549 Porcine epidemic diarrhea virus Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 1
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开本发明提供一种高效检测猪细小病毒的试剂盒,所述试剂盒包括上述引物以及反应液,所述反应液的由包括以下溶液混合而成:20mMTris‑HCl,10mMKCl,10mM(NH4)2SO4,8mMMgSO4,0.1%Tween‑20,1.4 mMdNTPs,8000U/mLBst酶,25 nM SYTO‑9荧光染料;本发明在反应体系里加入金纳米颗粒,吸附ssDNA和蛋白酶,抑制升温过程中的非特异性反应,达到热启动的目的,避免在升温过程中的非特异性反应;结合改良后的LAMP技术与微流控芯片技术,即可以快速给出准确的检测结果。
Description
技术领域
本发明属于基因检测技术领域,具体涉及一种高效检测猪细小病毒的引物以及试剂盒。
背景技术
猪细小病毒病(porcine parvovirus infection,PPI)又称猪繁殖障碍病,二类传染病、寄生虫病。是由猪细小病毒引起的一种猪的繁殖障碍病。以怀孕母猪发生流产、死产、产木乃伊为特征。猪细小病毒病是由猪细小病毒(PPV)引起的一种猪繁殖障碍病,该病主要表现为胚胎和胎儿的感染和死亡,特别是初产母猪发生死胎、畸形胎和木乃伊胎,但母猪本身无明显的症状。该病毒的检测如果采用现有的PCR技术,由于其反应要在2个不同的温度区循环,对仪器要求高,成本也相对高昂,并且PCR技术仅仅1对扩增引物,易受干扰,特异性相对不足,且出结果时间较久,操作专业要求高,微量加量步骤多。而LAMP技术共有4条不同的特异性引物,故而检测结果准确度更高,但是由于是恒温反应,缺少类似PCR的热启动酶,在设备升温阶段容易产生非特异性扩增从而影响检测结果。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的缺陷提供一种高效检测猪细小病毒的引物及试剂盒。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种高效检测猪细小病毒的引物,具体为:
PPV-F3:ACCTATCATGCACCAGAAAC;
PPV-B3:CTGTTTGTTTGCCATGAGT;
PPV-FIP:
TGTAGTCCTGTTTGTATTGAGTCTG-CTAAATCCACCAACATACACTG;
PPV-BIP:
TAAGAACAGGAGATGAATTCTCCAC-GAGTTAATTTTAGTGGTTTTGTGTC。
本发明提供一种高效检测猪细小病毒的试剂盒,所述试剂盒包括上述引物以及反应液,所述反应液的由包括以下溶液混合而成:20 mM Tris-HCl,10 mM KCl,10 mM (NH4)2SO4,8mM MgSO4,0.1% Tween-20, 1.4 mM dNTPs, 8000U/mL Bst 酶,25 nM SYTO-9荧光染料。
所述反应液的具体组成为:
20mM Tris-HCl 3.5μL;
10mM KCl 2μL;
10mM (NH4)2SO4 2μL;
8mM MgSO4 2μL;
0.1% Tween-20 2μL;
1.4mM dNTPs 2.5μL;
8000U/mL Bst酶 2μL;
25nM SYTO-9荧光染料 1μL;
纳米金颗粒 1μL。
所述引物的浓度和体积为:
PPV -F3:100μM 0.01μL;
PPV -B3:100μM 0.01μL;
PPV -FIP:100μM 0.08μL;
PPV -BIP:100μM 0.08μL。
其中,该试剂盒选用8样本芯片,即1个加样孔对应4个检测孔,第1检测孔和第2检测孔各包埋扩增猪细小病毒序列的引物,第3检测孔是空白,第4检测孔包埋内参引物和内参质粒,冻干。
所述猪细小病毒的核酸序列为SEQ NO.1:
AACCAAAATATATAATAATGATCTAACTGCAAGCTTAATGGTCGCACTAGACACCAATAACACACTTCCATACACACCAGCAGCACCTAGAAGTGAAACACTTGGTTTTTATCCATGGTTACCTACAAAACCAACTCAATACAGATATTACCTATCATGCACCAGAAACCTAAATCCACCAACATACACTGGACAATCAGAACAAATAACAGACTCAATACAAACAGGACTACACAGTGACATTATGTTCTACACAATAGAAAATGCAGTACCAATTCATCTTCTAAGAACAGGAGATGAATTCTCCACAGGAATATATCACTTTGACACAAAACCACTAAAATTAACTCACTCATGGCAAACAAACAGATCTCTAGGACTGCCTCCAAAACTACTAACTGAACCTACCACAGAAGGAGACCAACACCCAGGAACACTACCAGCAGCTAACACAAGAAAAGGTTATCACCAAACAATTAATAATAGCTACACAGAAGCA。
与现有技术相比,本发明具有如下优点:本发明以改良后的LAMP技术为基因扩增反应原理,在反应体系里加入金纳米颗粒,吸附ssDNA和蛋白酶,抑制升温过程中的非特异性反应,达到热启动的目的,避免在升温过程中的非特异性反应;结合改良后的LAMP技术与微流控芯片技术,即可以快速给出准确的检测结果,又达到同一样品多个不同指标联检的目的,同时,反应试剂预埋于微流控芯片上,用户只需加入样品,操作简便。
附图说明
图1为实施例中检出限的验证的扩增结果示意图。
图2为实施例中重复性的验证的扩增结果示意图。
图3为实施例中特异性的验证的扩增结果示意图。
具体实施方式
实施例
先通过NCBI GenBank寻找目标序列,并针对目标序列设计引物,并将其分别固定在微流控芯片相应位置后对微流控芯片进行封装,与从猪肉及其各种脏器、血液、排泄物、环境样本和细胞培养物中提取的核酸模板混合反应后,加入到封装好的微流控芯片中,之后放入到带有离心功能、恒温功能及实时荧光检测的微流控芯片检测仪中,利用离心力驱动样品进入微流控芯片反应孔,进行恒温扩增。若样本中含有目的片段而得到恒温扩增,扩增产物与荧光物质进行有效的结合,通过荧光检测仪实时捕获荧光信号,直观的反应扩增产物的产生,根据实时荧光信号的出现时间、强度和位置,判断样本中是否含有PPV。
具体的操作步骤如下:
1、微流控芯片检测体系中18μL反应液的组成如下:
20 mM Tris-HCl(pH 8.8),10 mM KCl,10 mM (NH4)2SO4,8mM MgSO4,0.1% Tween-20,1.4 mMdNTPs, 8000U/mL Bst DNA polymerase,25 nM SYTO-9荧光染料。
18μL所述反应液的具体组成为:
20mM Tris-HCl 3.5μL;
10mM KCl 2μL;
10mM (NH4)2SO4 2μL;
8mM MgSO4 2μL;
0.1% Tween-20 2μL;
1.4mM dNTPs 2.5μL;
8000U/mL Bst酶 2μL;
25nM SYTO-9荧光染料 1μL;
纳米金颗粒 1μL。
所述引物的浓度和体积为:
其中,该试剂盒选用8样本芯片,即1个加样孔对应4个检测孔,第1检测孔和第2检测孔各包埋扩增猪细小病毒序列的引物,第3检测孔是空白,第4检测孔包埋内参引物和内参质粒,冻干。
所述猪细小病毒的核酸序列为SEQ NO.1:
AACCAAAATATATAATAATGATCTAACTGCAAGCTTAATGGTCGCACTAGACACCAATAACACACTTCCATACACACCAGCAGCACCTAGAAGTGAAACACTTGGTTTTTATCCATGGTTACCTACAAAACCAACTCAATACAGATATTACCTATCATGCACCAGAAACCTAAATCCACCAACATACACTGGACAATCAGAACAAATAACAGACTCAATACAAACAGGACTACACAGTGACATTATGTTCTACACAATAGAAAATGCAGTACCAATTCATCTTCTAAGAACAGGAGATGAATTCTCCACAGGAATATATCACTTTGACACAAAACCACTAAAATTAACTCACTCATGGCAAACAAACAGATCTCTAGGACTGCCTCCAAAACTACTAACTGAACCTACCACAGAAGGAGACCAACACCCAGGAACACTACCAGCAGCTAACACAAGAAAAGGTTATCACCAAACAATTAATAATAGCTACACAGAAGCA。
然后将反应液18μL与模板核酸32μL混合,加入到芯片的加样孔,再将加样孔用封口膜封住,上机;
温度设定为63.5℃,反应时间设定为30min。
2、微流控芯片上机扩增:
由于本方法采用的是恒温扩增,不需要经过PCR扩增的变性、退火和延伸等变温过程,整个反应过程在恒温条件下完成,扩增程序:温度设定为63.5℃,反应时间设定为30min。运行程序:低速离心转速为1600r/min,低速离心时间为10sec,高速离心转速为4600r/min,高速离心时间为30sec。
3、微流控芯片结果判断:
3.1微流控芯片检测仪阈值线设置
阈值线一般情况设置为800(可根据实际情况进行调整,设定原则以阈值线刚好超过非典型S型扩增曲线的最高点,且Ct值显示为30),仪器配套软件自动分析结果。
3.2质量控制
阳性对照:Ct<30,阳性对照的反应孔有明显的典型S型扩增曲线。
阴性对照:Ct<30,阴性对照的反应孔无扩增曲线。
3.3结果判定
3.3.1实验成立条件
阳性对照:Ct 值≤30,对应检测孔有明显的典型S型扩增曲线。
阴性对照:Ct 值>30 或Ct值为0,对应检测孔无明显的典型S型扩增曲线。
3.3.2判定标准
阳性:反应孔出现Ct<30,有明显扩增曲线,判定为阳性。
阴性:反应孔出现Ct<30,无扩增曲线,判定为阴性。
在微流控芯片检测仪上进行微流控芯片的恒温扩增,仪器会进行实时荧光检测,根据荧光检测的有效扩增曲线进行判读,任意一孔或者多孔中有标准的S型的扩增曲线,则该孔判断为阳性,即该样本中含有对应检测孔的病毒核酸;没有扩增曲线的孔为判断为阴性,即该样本不含有对应检测孔的病毒核酸。
4、敏感性及检测限的验证
4.1 实验材料
试剂:反应液;1×106 copies/µL、1×105 copies/µL、1×104 copies/µL、1×103copies/µL、1×102 copies/µL、1×101 copies/µL、1×100 copies/µL的带有猪细小病毒基因片段的质粒;阴性对照;阳性对照。
仪器:恒温扩增仪;掌上离心机;移液器。
4.2 检测体系
参照上述的检测体系进行实验操作,然后把上好样的芯片放进恒温扩增仪进行试验检测,扩增结果可如图1检测限的结果看,最低检测限是1×101 copies/µL的质粒,此时的Ct小于30 min,说明灵敏度很高。
5、重复性的验证
5.1 实验材料
试剂:反应液;1×104 copies/µL的质粒;阴性对照;阳性对照。
仪器:恒温扩增仪;掌上离心机;移液器。
5.2 检测体系
参照上述检测体系进行实验操作,然后把芯片放进恒温扩增仪进行试验检测。
5.3 扩增结果
重复 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
Ct值 | 6.30 | 7.90 | 7.36 | 7.30 | 7.27 | 7.30 | 7.59 | 7.02 |
经计算,Ct值的变异系数(CV,%)为4.9%,重复性好,小于5%,符合要求。
6、特异性的验证
6.1 实验材料
试剂:反应液;猪瘟活疫苗核酸;猪繁殖与呼吸综合征活疫苗核酸;猪伪狂犬病活疫苗核酸;猪圆环病毒2型培养液核酸;猪流行性腹泻病毒疫苗核酸;阴性对照;阳性对照。
仪器:恒温扩增仪;掌上离心机;移液器。
6.2 检测体系
参照上述1中的检测体系进行实验操作,然后把芯片放进恒温扩增仪进行试验检测。
6.3 扩增结果
扩增结果可参考图2,从图2的结果可知,猪瘟活疫苗核酸;猪繁殖与呼吸综合征活疫苗核酸;猪伪狂犬病活疫苗核酸;猪圆环病毒2型培养液核酸;猪流行性腹泻疫苗核酸,猪口蹄疫疫苗核酸均无扩增曲线,说明该引物只能特异性地扩增检测出猪细小病毒细胞培养液核酸,特异性好,一般不会与其它病原菌产生交叉反应。
以上仅是本发明的特征实施范例,对本发明保护范围不构成任何限制。凡采用同等交换或者等效替换而形成的技术方案,均落在本发明权利保护范围之内。
Claims (4)
1.一种高效检测猪细小病毒的引物,其特征在于,具体为:
PPV-F3 :ACCTATCATGCACCAGAAAC;
PPV-B3 :CTGTTTGTTTGCCATGAGT;
PPV-FIP:
TGTAGTCCTGTTTGTATTGAGTCTG-CTAAATCCACCAACATACACTG;
PPV-BIP:
TAAGAACAGGAGATGAATTCTCCAC-GAGTTAATTTTAGTGGTTTTGTGTC。
2. 一种高效检测猪细小病毒的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括上述引物以及反应液,所述反应液的由包括以下溶液混合而成:20 mM Tris-HCl,10 mM KCl,10 mM (NH4)2SO4,8mM MgSO4,0.1% Tween-20, 1.4 mM dNTPs, 8000U/mL Bst 酶,25 nM SYTO-9荧光染料。
3.根据权利要求2所述的高效检测猪细小病毒的试剂盒,其特征在于,所述反应液的具体组成为:
20mM Tris-HCl 3.5μL;
10mM KCl 2μL;
10mM (NH4)2SO4 2μL;
8mM MgSO4 2μL;
0.1% Tween-20 2μL;
1.4mM dNTPs 2.5μL;
8000U/mL Bst酶 2μL;
25nM SYTO-9荧光染料 1μL;
纳米金颗粒 1μL。
4.根据权利要求2所述的高效检测猪细小病毒的试剂盒,其特征在于,所述引物的浓度和体积为:
PPV -F3:100μM 0.01μL;
PPV -B3:100μM 0.01μL;
PPV -FIP:100μM 0.08μL;
PPV -BIP:100μM 0.08μL。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010840287.4A CN111961755A (zh) | 2020-08-20 | 2020-08-20 | 一种高效检测猪细小病毒的引物以及试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010840287.4A CN111961755A (zh) | 2020-08-20 | 2020-08-20 | 一种高效检测猪细小病毒的引物以及试剂盒 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111961755A true CN111961755A (zh) | 2020-11-20 |
Family
ID=73389393
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202010840287.4A Pending CN111961755A (zh) | 2020-08-20 | 2020-08-20 | 一种高效检测猪细小病毒的引物以及试剂盒 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN111961755A (zh) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105349702A (zh) * | 2015-11-27 | 2016-02-24 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 一种猪细小病毒环介导等温扩增试剂盒及其应用 |
CN106011314A (zh) * | 2016-07-29 | 2016-10-12 | 上海佳牧生物制品有限公司 | 一种用于检测猪细小病毒的lamp引物组、试剂盒及检测方法 |
CN110791592A (zh) * | 2019-12-04 | 2020-02-14 | 宁波爱基因科技有限公司 | 一种快速检测非洲猪瘟病毒的引物以及试剂盒 |
-
2020
- 2020-08-20 CN CN202010840287.4A patent/CN111961755A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105349702A (zh) * | 2015-11-27 | 2016-02-24 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 一种猪细小病毒环介导等温扩增试剂盒及其应用 |
CN106011314A (zh) * | 2016-07-29 | 2016-10-12 | 上海佳牧生物制品有限公司 | 一种用于检测猪细小病毒的lamp引物组、试剂盒及检测方法 |
CN110791592A (zh) * | 2019-12-04 | 2020-02-14 | 宁波爱基因科技有限公司 | 一种快速检测非洲猪瘟病毒的引物以及试剂盒 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
"Porcine parvovirus isolate 37T viral protein 1 and viral protein 2 genes, complete cds" * |
HAO-TAI CHEN等: "Rapid detection of porcine parvovirus DNA by sensitive loop-mediated isothermal amplification" * |
KAI ZHAO等: "Establishment of a porcine parvovirus (PPV) LAMP visual rapid detection method" * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Yue et al. | A multiplex PCR for rapid and simultaneous detection of porcine circovirus type 2, porcine parvovirus, porcine pseudorabies virus, and porcine reproductive and respiratory syndrome virus in clinical specimens | |
WO2022057060A1 (zh) | 多重检测呼吸道病毒核酸的方法及试剂盒 | |
CN110273027B (zh) | 诺如病毒gⅰ、gⅱ和gⅳ型核酸分型检测试剂盒及检测方法 | |
CN110791592A (zh) | 一种快速检测非洲猪瘟病毒的引物以及试剂盒 | |
CN113502352B (zh) | 检测具有感染性ASFV的EMA-ddPCR引物、探针及应用 | |
CN111270007A (zh) | 猪瘟病毒检测用引物、微流控芯片、系统及其应用 | |
JP7105553B2 (ja) | ターゲット核酸検出のための二重プローブアッセイ | |
CN112029878A (zh) | 一种高效检测猪丹毒丝菌的引物以及试剂盒 | |
CN103540687B (zh) | 对虾白斑综合症病毒(wssv)的lamp检测引物组及试剂盒 | |
CN115232888A (zh) | 快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物、试剂盒及方法 | |
CN110885904B (zh) | 用于鉴别16种猪病病原冻干微芯片、试剂盒及方法 | |
CN107760766A (zh) | 多重qPCR快速检测五种致泻大肠埃希氏菌的方法、试剂盒及其应用 | |
CN106222298B (zh) | 一种rna病毒的lamp检测试剂盒、检测方法及应用 | |
CN110885900B (zh) | 用于鉴别猪蓝耳病毒经典株与NADC30-Like株的冻干微芯片、试剂盒及方法 | |
CN112280898A (zh) | 一种高效二联检测兔瘟和兔瘟2型的引物以及试剂盒 | |
CN113930529A (zh) | 用于肺炎支原体检测的核酸片段、引物探针组、试剂盒及其应用 | |
CN111676316B (zh) | 一种快速区分非洲猪瘟病毒基因ii型与其它基因型的引物、探针及其检测方法 | |
CN110885902B (zh) | 用于检测猪蓝耳病毒并鉴别从中猪蓝耳病毒高致病经典变异株的冻干微芯片、试剂盒及方法 | |
CN112029909A (zh) | 一种检测对虾白斑综合征病毒的引物以及试剂盒 | |
CN111996293A (zh) | 一种高效检测猪流行性乙型脑炎病毒的引物以及试剂盒 | |
CN111850173A (zh) | 一种高效检测猪圆环病毒2型的引物以及试剂盒 | |
CN111961755A (zh) | 一种高效检测猪细小病毒的引物以及试剂盒 | |
CN106191310A (zh) | 一种同时鉴别3种牛腹泻病病原体的引物组合及GeXP检测方法 | |
WO2021192370A1 (ja) | 新型コロナウイルスの検査方法および検査試薬 | |
CN112094945A (zh) | 一种高效检测猪流行性腹泻病毒的引物以及试剂盒 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20201120 |