CN113930529A

CN113930529A - 用于肺炎支原体检测的核酸片段、引物探针组、试剂盒及其应用

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Publication number: CN113930529A
Application number: CN202111112375.3A
Authority: CN
Inventors: 李春明; 朱兆奎; 孔君尧
Original assignee: Shanghai Bojie Medical Technology Co ltd; Shanghai Berger Medical Technology Co ltd Beijing Branch
Current assignee: Shanghai Bojie Medical Technology Co ltd; Shanghai Berger Medical Technology Co ltd Beijing Branch
Priority date: 2021-09-18
Filing date: 2021-09-18
Publication date: 2022-01-14
Anticipated expiration: 2041-09-18
Also published as: CN113930529B

Abstract

本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及用于肺炎支原体检测的核酸片段、引物探针组、试剂盒及其应用。本发明提供的针对肺炎支原体的特异性引物探针组、试剂盒的灵敏度及特异性均较好，能够特异性地检测肺炎支原体，检测限可达100copies/mL，对于低浓度样本的检测灵敏度明显更高，且具有操作简单、检测时间短的优势，具有较好的应用前景。

Description

用于肺炎支原体检测的核酸片段、引物探针组、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及用于肺炎支原体检测的核酸片段、引物探针组、试剂盒及其应用。

背景技术

肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae，MP)是大小介于细菌和病毒之间的一种病原微生物，主要通过飞沫以气溶胶微粒的形式传播，于1962年首次分离和培养。MP感染不仅引起肺部疾病，还能侵犯心、脑、肝、肾等其他器官，已成为小儿肺炎的重要病原体。在社区获得性肺炎(CAP)中MP是重要病原，尤其在5岁以上儿童中，MP在非流行年占CAP病原的10～20％。此外，因MP生长缓慢、潜伏期及带菌时间长，极易形成间歇期发病、长时期传播的流行特点。由于MP感染常无特异性临床表现，很容易与一般的病毒性感冒相混淆，因此MP感染需要及时确诊，做到早发现早治疗，减少儿童急性肺炎病情恶化，这其中早期诊断极为重要。

目前，肺炎支原体的检测方法主要分为以下3种：

1、病原体分离培养法：用咽拭子、痰液、胸腔积液、肺泡灌洗液等进行体外肺炎支原体分离培养，是诊断MP感染最可靠的方法，是微生物检测的“金标准”。但是MP分离培养需3至4周，且灵敏度低，耗时长，费力，技术要求高，不能满足快速诊断的需求，从而限制了其临床应用。

2、血清学检测：血清学检测方法较多，分为以下几种：

(1)ELISA：ELISA法可用于检测患者急性期和恢复期血清中特异性IgM、IgG抗体，该方法特异性高、快速经济，是目前诊断支原体感染的可靠方法之一，但灵敏度低，容易出现假阴性。

(2)补体结合试验：补体结合抗体在MP感染后7至9小时开始上升，3至4周达高峰。该方法灵敏度和特异性都较高，缺点为主要检测IgM抗体，易受机体免疫系统的影响而出现假阴性，多用于早期诊断。

(3)间接血凝试验：试验原理与补体结合试验相似，但灵敏度高于补体结合试验。在肺炎支原体感染后7小时即可呈现阳性，10至30小时达到高峰。缺点为特异性较差。

(4)冷凝集试验：人体感染MP后，血清中除了出现特异性抗体外还存在冷凝素，患者的稀释血清与O型红细胞在4℃条件下可发生凝集，此为IgM抗体，抗体效价越高或双份血清呈4倍以上升高，提示受检者近期MP感染的可能性越大，但该检测无特异性。冷凝集试验是诊断MP感染的传统方法，其灵敏度和特异性均不理想。

3、分子生物学检测：PCR是目前直接病原体检测的首选方法，这些技术包括实时PCR、巢式PCR、多重PCR、熔解曲线等。此外，还有等温扩增技术，包括SAT、LAMP等。PCR方法具有快速、灵敏、特异性强等特点，大大地提高了检测效率。荧光PCR技术是基于传统PCR技术并结合光谱技术而发展起来的一种更灵敏、更特异、更精确的核酸检测技术。检测结果准确，重复性高，且整个过程中避免了传统PCR需后处理的问题，减少了污染。但是目前，针对MP鉴定的基因片段的选择和引物探针的设计存在特异性较低，与解脲脲原体、衣原体等存在交叉；部分检测试剂盒的灵敏度偏低，易造成部分样本漏检；还有些检测试剂存在无内参对照、或为外源性内参等问题；此外配套的检测体系成分复杂，不仅灵敏度低，且操作复杂，导致多数检测试剂无法实现准确、快速、灵敏的检测，这些都为肺炎支原体的检测带来了不便。

目前基于分子生物学检测肺炎支原体的方法主要有DNA和RNA检测两大类。MP死亡后其DNA仍可存在于部分患者体内，时间达7周～7个月，且不易降解，导致DNA检验结果不能很好地用于治疗效果的评估。肺炎支原体RNA在患者体内为多拷贝，其灵敏度和准确性与DNA检测方法相比都有很大提高，由于RNA随病原体死亡而降解，可作为评价MP感染转归、药物疗效的指标，其检测结果与MP的感染严重程度相关性较好，因此MP的RNA检测是目前早期快速诊断、判断疗效的最好方法之一。

目前基于RNA检测的方法采用SAT等温扩增技术，其余检测方法则基于DNA进行检测。目前市场上对于肺炎支原体的荧光定量PCR检测均为以DNA为靶标进行，在一定程度上会造成部分MP-RNA含量高的样本(MP-DNA含量过少)或感染早期的样本漏检，同时也不利于MP感染转归、药物疗效的判断，尤其对于感染肺炎支原体耐药菌株的患者的诊治更为不利。

发明内容

本发明的第一目的是提供用于检测肺炎支原体的核酸片段。

本发明的第二目的是提供用于检测肺炎支原体的特异性引物探针组。

本发明的第三目的是提供用于检测肺炎支原体的试剂盒。

本发明的第四目的是提供上述核酸片段、特异性引物探针组、试剂盒的应用。

为实现上述目的，本发明通过对NCBI数据库中的肺炎支原体的基因组下载并通过序列多重比对，找出在不同肺炎支原体中高度保守，且与其他病原体具有明显差异的区域，经筛选和验证，最终确定以toxA基因的上述区域作为肺炎支原体检测的靶标。针对上述检测靶标设计多组特异性引物探针，经筛选和优化，最终确定了最优的引物探针组，该引物探针组针对肺炎支原体的高度保守序列，能够检测不同肺炎支原体(包括肺炎支原体I型、肺炎支原体II型等)，且具有较高的灵敏度，同时与其他病原体无交叉反应。

具体地，本发明提供以下技术方案：

第一方面，本发明提供用于检测肺炎支原体的核酸片段，其核苷酸序列如肺炎支原体基因组的第442739位至442841位所示，基因组的参考序列号为Genbank：CP039761。

以上所述的肺炎支原体基因组的参考序列号为CP039761。

以上所述的核酸片段位于toxA基因，该基因为肺炎支原体的毒素基因。

上述DNA片段为以肺炎支原体的核酸为模板、由核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示的引物扩增得到。

第二方面，本发明提供用于检测肺炎支原体的特异性引物探针组，其包含一对特异性引物和一条探针，所述特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

上述引物和探针的核苷酸序列具体如下：

SEQ ID NO 1(5’-3’)：CGTGCCGACCAACACTTT；

SEQ ID NO 2(5’-3’)：CCATTTCTCGATCACCAGAGTC；

SEQ ID NO 3(5’-3’)：CCCGCGCCACTGGGGAGAACTTGTTAGA。

上述引物探针组中，上游引物和下游引物是针对不同基因型肺炎支原体高度保守的序列设计的，确保不会因为肺炎支原体序列型别差异导致漏检或检测灵敏度低。

本发明对上述特异性引物探针组进行优化，以进一步提高其检测效果。首先，将探针中的淬灭基团放置于序列中部，使荧光基团和淬灭基团的距离更近，并针对本发明的探针序列对荧光基团和淬灭基团的位置进行了特异的选择，探针完整时，本底值更低，探针被水解后，产生的信号值更高，有利于提高检测的灵敏度，该探针与常规的将淬灭基团设计在3’末端的探针相比，淬灭效果更好，背景值更低。

以上所述的引物探针组中，所述探针含有荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团标记于SEQ ID NO.3所示序列的5’末端，所述淬灭基团标记于SEQ ID NO.3所示序列的5’端第10个碱基。

以上所述的荧光基团为选自FAM、VIC、ROX、CY5、TET、JOE、CY3、HEX中的一种。淬灭基团为选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL、NFQ中的一种。

优选地，SEQ ID NO.3所示序列的3’末端碱基经磷酸化处理，以防止探针3’端延伸。

进一步地，在特异性引物的特定位置引入锁核酸修饰以增强引物对靶序列结合强度，进一步提高检测特异性。

优选地，所述特异性引物中含有锁核酸修饰，其中，序列如SEQ ID NO.1所示的引物的锁核酸修饰位于5’端第13个碱基，序列如SEQ ID NO.2所示的引物的锁核酸修饰位于5’端第19个碱基。

上述特异性引物探针组经临床样本的验证，与解脲支原体、生殖支原体、人型支原体、肺炎链球菌、肺炎衣原体、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、嗜肺军团菌、铜绿假单胞菌、新型甲型流感H1N1(2009)、甲型流感H3N2、甲型流感H5N1、甲型流感H7N9、乙型流感病毒、鲍曼不动杆菌、副流感病毒、鼻病毒、呼吸道腺病毒、人偏肺病毒、呼吸道合胞病毒，均无交叉反应，特异性良好，且具有较高的灵敏度。

以上所述的特异性引物探针组的序列和修饰如表1所示。

表1特异性引物和探针的序列和修饰

第三方面，本发明提供所述核酸片段或所述特异性引物探针组的如下任一种应用：

(1)在制备用于检测肺炎支原体RNA的试剂盒中的应用；

(2)在肺炎支原体检测中的应用。

优选地，上述(2)中，肺炎支原体检测为采用逆转录Q-PCR方法特异性检测肺炎支原体RNA。

第四方面，本发明提供一种试剂盒，其包含所述特异性引物探针组。

优选地，所述试剂盒还包含用于扩增内参基因的引物探针组，所述引物探针组中引物的序列如SEQ ID NO.4-5所示，探针的序列如SEQ ID NO.6所示。

上述引物和探针的核苷酸序列具体如下：

SEQ ID NO.4(5’-3’)：CCTGCGAGCGGGTTCT；

SEQ ID NO.5(5’-3’)：AATAGCCAAGGTGAGCGGCT；

SEQ ID NO.6(5’-3’)：CCTGAAGGCTCTGCGCGGAC。

上述内参基因为人基因组内源性内参基因，使用该内参基因，无需额外添加，内参可用于对样本采集、保存和运输以及核酸提取、检测过程进行全程监控，避免假阴性结果的误判。

上述内参基因的引物探针组中，探针含有荧光基团和淬灭基团，荧光基团标记于SEQ ID NO.6所示序列的5’端第9个碱基，淬灭基团标记于SEQ ID NO.6所示序列的5’端第15个碱基。

其中，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的探针的荧光基团不相同。

优选地，SEQ ID NO.6所示序列的3’末端碱基经磷酸化处理，以防止探针3’端延伸。

上述探针的Tm值68.0℃-70.0℃，GC值40.0％-70.0％。

上述试剂盒中，用于检测肺炎支原体的一对引物和一条探针以及用于扩增内参基因的一对引物和一条探针可以混合液的形式存在，作为肺炎支原体反应液。

优选地，所述肺炎支原体反应液中，SEQ ID NO.1、2所示引物和SEQ ID NO.3所示探针的浓度比为2:2:1。SEQ ID NO.4、5所示引物和SEQ ID NO.6所示探针的浓度比为2:2:1。SEQ ID NO.1所示引物与SEQ ID NO.4所示引物的浓度比为5:1。

所述试剂盒还包含PCR增强剂，所述PCR增强剂包含如下组分：氯化锰1.0-3.0g/L，SSB单链结合蛋白0.5-1.0g/L，叠氮钠0.05-0.1g/L，BSA 0.5-1.2g/L。

上述PCR增强剂能够显著提高PCR扩增的效率。

上述PCR增强剂在荧光PCR的反应体系中的添加量为占反应体系总体积的10-15％。优选为12-13％。

进一步优选地，所述试剂盒还包含UDG酶。UDG酶搭配上述试剂盒的引物探针和其他试剂，防污染效果快速高效，在常温1min内即可完成反应，消化掉含有U的PCR产物，无需专门进行UDG酶防污染的反应步骤，能够有效避免气溶胶带来的污染。

上述UDG酶在荧光PCR的反应体系中的添加量为0.02-0.04U/μL。

上述试剂盒中，PCR增强剂、UDG酶可以单独包装，也可与缓冲液、dN(U)TP Mix、PCR增强剂、DNA聚合酶、逆转录酶、MgC_l2

以及DEPC水形成混合液，作为核酸扩增反应液。

作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒包括核酸扩增反应液、肺炎支原体反应液、阳性对照和阴性对照。

其中，所述阳性对照包括肺炎支原体阳性质粒、RNase P阳性质粒和TE Buffer，所述阴性对照为0.9％的氯化钠溶液。

阳性对照参与提取和RT-PCR扩增的过程，监控提取和扩增过程。

优选地，所述试剂盒在用于肺炎支原体检测时，PCR的反应体系中，SEQ ID NO.1、2所示引物和SEQ ID NO.3所示探针的浓度比为2:2:1。

作为本发明的一种实施方式，上述试剂盒可用于肺炎支原体的RNA(MP-RNA)检测，在进行肺炎支原体的RNA检测时，在提取总核酸后，进行Dnase I消化，消化提取的总核酸中的MP-DNA，获得肺炎支原体的RNA，以RNA为模板，先将RNA在逆转录酶的作用下进行逆转录反应再进行荧光PCR检测。本发明的试剂盒能够特异性检测MP-RNA，为肺炎支原体感染患者的预后治疗效果提供辅助检测方法，为解决感染早期的样本漏检问题提供有效方法。

作为本发明的另一种实施方式，上述试剂盒可同时用于肺炎支原体的RNA和DNA检测，在进行肺炎支原体的DNA检测时，在提取核酸后，不进行Dnase I消化，先在逆转录酶的作用下进行逆转录反应再进行荧光PCR检测。同时检测肺炎支原体的RNA和DNA对于肺炎支原体检测的灵敏度更高。

以上所述的试剂盒在用于肺炎支原体检测时，逆转录和荧光PCR的反应程序包括如下步骤：逆转录50℃、5min；预变性95℃、1min；变性95℃、1s，退火、延伸和检测荧光55℃、15s，40个循环。

第五方面，本发明提供一种检测肺炎支原体的方法，作为本发明的一种实施方式，该方法包括如下步骤：

(1)提取待测样本的核酸，并采用DnaseI消化核酸，获得RNA；

(2)以步骤(1)获得的RNA为模板进行逆转录反应后再进行荧光PCR扩增，根据扩增产物的荧光信号判断待测样本中是否含有肺炎支原体。

上述步骤(2)中，逆转录和荧光PCR扩增的25μL的反应体系为：核酸扩增反应液16μL，肺炎支原体反应液4μL，待测样本的RNA 5μL。

上述步骤(2)中，逆转录和荧光PCR的反应程序包括如下步骤：逆转录50℃、5min；预变性95℃、1min；变性95℃、1s，退火、延伸和检测荧光55℃、15s，40个循环。

作为本发明的另一种实施方式，该方法包括如下步骤：

(1)提取待测样本的总核酸；

(2)以步骤(1)提取的总核酸为模板先进行逆转录反应后再进行荧光PCR扩增，根据扩增产物的荧光信号判断待测样本中是否含有肺炎支原体。

上述步骤(2)中，荧光PCR扩增的25μL的反应体系为：核酸扩增反应液16μL，肺炎支原体反应液4μL，待测样本的RNA 5μL。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的针对肺炎支原体的特异性引物探针组、试剂盒的灵敏度及特异性均较好，与解脲支原体、生殖支原体、人型支原体、肺炎链球菌、肺炎衣原体、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、嗜肺军团菌、铜绿假单胞菌、新型甲型流感H1N1(2009)、甲型流感H3N2、甲型流感H5N1、甲型流感H7N9、乙型流感病毒、鲍曼不动杆菌、副流感病毒、鼻病毒、呼吸道腺病毒、人偏肺病毒、呼吸道合胞病毒，均无交叉反应，能够特异性地检测肺炎支原体；最低检测限可达100copies/mL，且检测各种肺炎支原体(包括肺炎支原体I型、肺炎支原体II型等)均能够达到100copies/mL的检出率≥95％，50copies/mL的检出率≥85％。

而且，针对部分MP-DNA检测为阴性的样本，利用本发明提供的试剂盒检测MP-RNA则为阳性。与其他针对MP-RNA的试剂盒相比，本发明的试剂盒对于低浓度样本的检测灵敏度明显更高。

此外，本发明提供的试剂盒检测快速，从获得样本到获得检测结果仅需40min左右，操作简单、快速。

附图说明

图1为本发明实施例1中不同靶基因上设计的引物探针的检测效果对比。

图2为本发明实施例1中同一引物探针不同修饰方式的检测效果对比。

图3为本发明实施例4中对肺炎支原体I型100copies/mL样本重复检测40次扩增结果图。

图4为本发明实施例4中对肺炎支原体II型100copies/mL样本重复检测40次扩增结果图。

图5为本发明实施例4中对肺炎支原体I型50copies/mL重复检测40次扩增结果图。

图6为本发明实施例4中对肺炎支原体II型50copies/mL重复检测40次扩增结果图。

图7为本发明实施例4对肺炎支原体I型样本的精密度效果图。

图8为本发明实施例4对肺炎支原体II型样本的精密度效果图。

图9为本发明实施例4中荧光PCR的反应体系中有无PCR增强剂的扩增对比结果。

图10为本发明实施例5中检测肺炎支原体和其他呼吸道病原体的扩增结果图。

图11为本发明实施例6中检测中、低阳性样本的扩增结果图，其中，中浓度：实施例6样本19号，低浓度：实施例6样本24号。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中，肺炎支原体I型和II型菌株ATCC29342、ATCC29085、ATCC15531、ATCC15492购自美国模式培养物集存库(American type culture collection，简称：ATCC)。

实施例1检测靶标的选择和引物探针组的设计

从NCBI数据库下载肺炎支原体全基因组序列，通过多重比对和分析，找出肺炎支原体基因组中的保守区域。从NCBI上下载其他呼吸道类病原体基因组，将该保守区域与其他病原体基因组进行比对，确定该保守区域于其他病原体相比具有显著差异，同时确定差异区域，对不同差异区域进行筛选和验证，最终确定toxin基因(toxA)为最佳检测区域(在参考序列号CP039761的442739-442841的位置)，在上述区域中存在肺炎支原体的高度保守区域，也存在肺炎支原体与其他病原体相区分的特异性区域。

以下列举几种筛选的靶标基因，包括最终确定的最佳的靶标基因toxA以及P1基因、P23基因、P116基因和N114基因，针对这些靶标基因序列设计引物和探针，并进行荧光定量PCR扩增，扩增结果如图1所示。结果显示，与其他靶标基因相比，以toxA基因区域作为检测靶标的灵敏度更高。

针对toxA基因靶序列设计多组引物和探针，经不断的筛选、优化和验证，确定灵敏度、特异性均较优的引物探针组，其中特异性引物的序列如SEQ ID NO.1-2所示，探针的序列如SEQ ID NO.3所示。

对上述引物和探针的修饰进行优化，设计多种不同的修饰方式，其中部分修饰如表2所示。经不断筛选，确定了最优的修饰方式(表2的组1)：其中，对于探针，将荧光基团和淬灭基团的距离缩小，确定了最优的荧光基团和淬灭基团的标记位置，即荧光基团标记于SEQ ID NO.3所示序列的5’末端，淬灭基团标记于5’端第10个碱基。对于特异性引物，在其中引入锁核酸修饰，并确定了锁核酸修饰的最佳位置，即序列如SEQ ID NO.1所示的引物的锁核酸修饰位于5’端第13个碱基，序列如SEQ ID NO.4所示的引物的锁核酸修饰位于5’端第19个碱基。

进一步地，选择人基因组内源性RNase P作为内参基因，针对该基因设计引物探针，其中，引物的序列如SEQ ID NO.4-5所示，探针的序列如SEQ ID NO.6所示，探针的荧光基团位于5’端第9位，淬灭基团位于5’端第15位，3’末端的被磷酸化处理。

经上述修饰后的针对toxA基因的特异性引物和探针以及内参基因的引物和探针如表2所示。利用表2中的引物和探针进行荧光定量PCR扩增的检测结果如图2所示。结果表明，与组2、组3和组4相比，组1在检测阳性样本时灵敏度更高。

表2特异性引物和探针的序列和修饰

实施例2用于检测肺炎支原体的试剂盒

本实施例提供一种用于检测肺炎支原体的试剂盒，该试剂盒包含如下组分：核酸扩增反应液、肺炎支原体反应液、阳性对照、阴性对照。

其中，核酸扩增反应液的组成如表3所示。

表3核酸扩增反应液的组成

试剂名称	加入体积(μL)/50人份
		缓冲液Buffer	250
dN(U)TP Mix(20μM)	15
		UDG酶(2U/μL)	15
PCR增强剂	125
		DNA聚合酶	15
逆转录酶(200U/μL)	15
		MgCl<sub>2</sub>	15
DEPC水	350

上述核酸扩增反应液中，PCR增强剂的组成如表4所示。

表4 PCR增强剂的组成

试剂名称	加入量(g/L)
		氯化锰	2.0
SSB单链结合蛋白	0.8
		叠氮钠	0.08
BSA	0.8

肺炎支原体反应液的组成如表5所示。

表5肺炎支原体反应液的组成

试剂名称	加入体积(μL)/50人份
		MP-F(100μM)	5
MP-R(100μM)	5
		MP-P(100μM)	2.5
RNase P-F(100μM)	1.0
		RNase P-R(100μM)	1.0
RnaseP-roxP(100μM)	0.5
		DEPC水	185
总计	200

阳性对照为百日咳杆菌阳性质粒、RNase P阳性质粒和TE Buffer，阴性对照为0.9％的氯化钠溶液。

实施例3一种检测肺炎支原体的方法

本实施例提供利用实施例2的试剂盒检测肺炎支原体的方法，包括如下步骤：

(1)试剂预处理：分别取出核酸扩增反应液、肺炎支原体反应液、阳性对照和阴性对照，并在室温下熔化，充分振荡混匀后瞬间离心；

(2)配制反应液并放在PCR反应管中，每个PCR反应管中20μL，包括核酸扩增反应液16μL/人份、肺炎支原体反应液4μL/人份；

(3)提取核酸：按照提取试剂盒说明书要求提取待测样本中的核酸，并用Dnase I消化核酸，获取RNA；

(4)加样：在步骤(2)配制的反应液中分别加入待测样本的RNA、阳性对照和阴性对照核酸各5μL，盖紧管盖，瞬时离心；

(5)荧光PCR扩增检测：将步骤(4)得到的PCR反应管放置在荧光定量PCR仪中进行扩增检测；荧光定量PCR仪的扩增检测循环参数如表6所示，根据检测的荧光信号判断待测样本中是否含有肺炎支原体，通过内参检测判断结果准确性。

表6荧光PCR的反应程序

实施例4试剂盒的灵敏度和精密度测试

对实施例2的试剂盒的最低检测限进行测试，具体如下：

取采购的ATCC标准菌株培养液，分别是ATCC29342、ATCC29085、ATCC15531、ATCC15492。已知ATCC29342、ATCC29085为PD-I基因型，ATCC15531、ATCC15492为PD-II基因型。采用数字PCR进行定量，根据定量结果，采用肺炎支原体阴性样本将标准菌株培养液稀释至100copies/mL和50copies/mL，利用实施例3的检测方法进行检测，统计检出率。

检测结果见图3、图4、图5和图6，结果表明，100copies/mL的不同型别的肺炎支原体的检出率均≥95％，对于50copies/mL的不同型别的肺炎支原体检出率均≥85％。

对浓度为10⁶copies/mL的肺炎支原体I型样本(ATCC29342)和肺炎支原体II型样本(ATCC15531)进行精密度测试，具体方法如下：将肺炎支原体I型样本和肺炎支原体II型样本按照数字PCR定量浓度，采用阴性样本稀释至10⁶copies/mL，每个样本重复提取检测20次，分别根据检测的Ct值计算Ct值间的精密度。检测Ct值及精密度结果如表7所示，测试结果扩增曲线图如图7和图8所示。

表7精密度检测结果

此外，对于500copies/mL浓度样本，同时设置在反应体系中加入PCR增强剂和不加PCR增强剂的实验组，均利用实施例3的方法进行检测，结果如表8和图9所示，结果表明，添加PCR增强剂能够显著提高检测灵敏度及信号值。

表8低浓度样本的检测效果对比

注：表8中，-代表阴性。

实施例5试剂盒的特异性评价

将肺炎支原体、解脲支原体、生殖支原体、人型支原体、肺炎链球菌、肺炎衣原体、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、嗜肺军团菌、铜绿假单胞菌、新型甲型流感H1N1(2009)、甲型流感H3N2、甲型流感H5N1、甲型流感H7N9、乙型流感病毒、鲍曼不动杆菌、副流感病毒、鼻病毒、呼吸道腺病毒、人偏肺病毒、呼吸道合胞病毒进行数字PCR定量后，根据定量结果，均分别稀释至10⁷copies/mL，利用实施例3的检测方法进行检测。

检测结果见图10，结果表明，该试剂盒检测10⁷copies/mL浓度的其他常见呼吸道病原体与肺炎支原体均无交叉。

实施例6试剂盒的准确度分析

将收集的24例已知肺炎支原体阳性样本和12例肺炎支原体阴性样本，利用实施例2的试剂盒和实施例3的检测方法进行检测，检测结果见图11和表9，结果显示，24例肺炎支原体样本结果均为阳性，12例阴性样本均为阴性。结果表明，该试剂盒能够有效检测样本中的肺炎支原体核酸，样本中内参均为阳性，表明内参能够有效质控样本采集、提取及检测整个过程。

表9试剂盒检测一批呼吸道样本的结果(Ct值)

样本名称	MP检测结果	内参结果	样本名称	MP检测结果	内参结果
						样本1	35.33	37.91	样本19	23.34	22.09
样本2	-	29.16	样本20	31.96	33.67
						样本3	-	34.71	样本21	-	28.55
样本4	-	31.13	样本22	-	31.83
						样本5	-	26.04	样本23	35.63	36.55
样本6	34.73	36.86	样本24	32.96	23.85
						样本7	32.30	31.81	样本25	-	31.30
样本8	-	29.73	样本26	-	29.92
						样本9	28.71	27.40	样本27	-	28.46
样本10	25.42	26.49	样本28	34.05	18.66
						样本11	32.74	31.56	样本29	19.43	19.61
样本12	-	36.26	样本30	25.17	28.71
						样本13	-	31.97	样本31	28.47	22.63
样本14	35.65	38.08	样本32	27.89	28.61
						样本15	32.54	27.09	样本33	31.53	23.66
样本16	33.14	30.50	样本34	32.53	29.81
						样本17	27.94	27.63	样本35	26.61	23.06
样本18	25.42	24.26	样本36	31.99	29.92

注：表8中，-代表阴性。

实施例7试剂盒检测MP-RNA的效果测试

利用实施例2的试剂盒，将收集的一批疑似MP感染的阳性样本，分别采用以下3种体系进行检测，其他检测方法同实施例3。

体系1：检测体系中不含逆转录酶；提取过程中核酸无Dnase I消化。该体系仅能检测MP-DNA。

体系2：检测体系中含有逆转录酶；提取过程中核酸无Dnase I消化。该体系检测MP-DNA和MP-RNA总核酸。

体系3：检测体系中含有逆转录酶，提取过程中核酸进行Dnase I消化。该体系仅能检测MP-RNA。

对比试剂：上海仁度生物科技有限公司生产的肺炎支原体核酸检测试剂盒(RNA恒温扩增)。

检测结果见表10，结果显示，样本5和样本7中的MP-RNA未检出，但MP-DNA为阳性，表明该样本中的肺炎支原体已死亡，患者正处于恢复期。样本12为阴性，其余阳性样本中均含有一定量的MP-RNA，且大多数样本中的MP-RNA的含量高于MP-DNA的含量。

目前已上市的专门用于检测MP-RNA的试剂盒为上海仁度生物科技有限公司生产的肺炎支原体核酸检测试剂盒(RNA恒温扩增)，采用该试剂盒作为对比试剂，与本发明同时检测同一批样本，结果表明，本发明实施例2的试剂盒对于低浓度样本的检测灵敏度显著高于对比试剂。

表10试剂盒检测一批呼吸道样本的结果(Ct值)

样本名称	体系1	体系2	体系3	对比试剂
					样本37	34.54	28.15	28.34	+
样本38	-	30.82	31.96	+
					样本39	-	33.78	33.24	-
样本40	-	35.78	34.92	-
					样本41	34.25	34.38	-	-
样本42	34.73	29.88	29.96	+
					样本43	36.32	36.22	-	-
样本44	-	32.45	32.11	-
					样本45	28.71	26.53	26.79	+
样本46	27.91	22.58	23.04	+
					样本47	33.71	30.56	30.63	+
样本48	-	-	-	-
					样本49	-	32.55	32.71	-
样本50	35.55	31.89	31.52	+
					样本51	21.58	19.26	20.11	+
样本52	33.17	29.58	29.53	+
					样本53	25.48	23.78	24.62	+
样本54	25.47	25.98	27.02	+
					样本55	35.39	23.22	23.34	+
样本56	-	33.78	34.49	-

注：表10中，+代表阳性，-代表阴性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 上海伯杰医疗科技有限公司北京分公司上海伯杰医疗科技有限公司

<120> 用于肺炎支原体检测的核酸片段、引物探针组、试剂盒及其应用

<130> KHP211118446.8

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgtgccgacc aacacttt 18

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccatttctcg atcaccagag tc 22

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cccgcgccac tggggagaac ttgttaga 28

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cctgcgagcg ggttct 16

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aatagccaag gtgagcggct 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cctgaaggct ctgcgcggac 20

Claims

1.用于检测肺炎支原体的核酸片段，其特征在于，其核苷酸序列如肺炎支原体基因组的第442739位至442841位所示，基因组的参考序列号为Genbank：CP039761。

2.根据权利要求1所述的核酸片段，其特征在于，其为以肺炎支原体的核酸为模板、由核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示的引物扩增得到。

3.用于检测肺炎支原体的特异性引物探针组，其特征在于，其包含一对特异性引物和一条探针，所述特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.根据权利要求3所述的特异性引物探针组，其特征在于，所述探针含有荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团标记于SEQ ID NO.3所示序列的5’末端，所述淬灭基团标记于SEQ IDNO.3所示序列的5’端第10个碱基。

5.根据权利要求3或4所述的特异性引物探针组，其特征在于，所述特异性引物中含有锁核酸修饰，其中，序列如SEQ ID NO.1所示的引物的锁核酸修饰位于5’端第13个碱基，序列如SEQ ID NO.2所示的引物的锁核酸修饰位于5’端第19个碱基。

6.权利要求1或2所述的核酸片段或权利要求3～5任一项所述的特异性引物探针组的如下任一种应用：

(1)在制备用于检测肺炎支原体RNA的试剂盒中的应用；

(2)在肺炎支原体检测中的应用。

7.试剂盒，其特征在于，包含权利要求3～5任一项所述的特异性引物探针组。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含用于扩增内参基因的引物探针组，所述引物探针组中引物的序列如SEQ ID NO.4-5所示，探针的序列如SEQ IDNO.6所示；

优选地，所述探针含有荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团标记于SEQ ID NO.6所示序列的5’端第9个碱基，所述淬灭基团标记于SEQ ID NO.6所示序列的5’端第15个碱基。

9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含PCR增强剂，所述PCR增强剂包含如下组分：氯化锰1.0-3.0g/L，SSB单链结合蛋白0.5-1.0g/L，叠氮钠0.05-0.1g/L，BSA 0.5-1.2g/L；

优选地，所述试剂盒还包含UDG酶。

10.根据权利要求7～9任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在用于肺炎支原体检测时，荧光PCR的反应体系中，SEQ ID NO.1、2所示引物和SEQ ID NO.3所示探针的浓度比为2:2:1；

和/或，所述试剂盒在用于肺炎支原体检测时，逆转录和荧光PCR的反应程序包括如下步骤：逆转录50℃、5min；预变性95℃、1min；变性95℃、1s，退火、延伸和检测荧光55℃、15s，40个循环。