CN114214465A - 一种缩短新型冠状病毒检测时间的引物、探针、试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种缩短新型冠状病毒检测时间的引物、探针、试剂盒及检测方法 Download PDF

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CN114214465A CN202210093181.1A CN202210093181A CN114214465A CN 114214465 A CN114214465 A CN 114214465A CN 202210093181 A CN202210093181 A CN 202210093181A CN 114214465 A CN114214465 A CN 114214465A
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Abstract

本发明涉及一种缩短新型冠状病毒检测时间的引物、探针。所述引物、探针使延伸温度满足Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度，从而有效缩短扩增时间。另外，改进后的long‑ORF1ab降低了PCR反应体系的背景荧光，消除了探针过长导致的猝灭效率降低的问题。此外，通过优化进一步缩短了反转录和变性时间，在不降低检测性能的前提下，将整个PCR检测时间从74min缩短到37min。本发明还涉及包含所述引物和探针的试剂盒和使用所述引物和探针进行检测的方法。

Description

一种缩短新型冠状病毒检测时间的引物、探针、试剂盒及检测 方法
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术及分子诊断领域，特别涉及一种缩短新型冠状病毒检测时间的引物、探针、试剂盒及检测方法。
背景技术
由于在全球广泛接种SARS-CoV-2疫苗需要相当长的时间，因此对COVID-19感染人群的快速诊断仍然是疫情防控的主要手段。但是现有的检测技术仍难以满足检测需求，特别是在局部地区突发个例时，需要对整个地区进行大规模筛查，寻找潜在的感染者和密切接触者，这就需要现有的检测技术进一步完善，缩短检测时间，提高检测效率。
当前，核酸检测和抗原检测是确诊COVID-19感染的两种主要方法。根据技术原理，核酸检测可分为两类:一类是靶向核酸扩增检测(TNAAT)，主要包括荧光定量逆转录 PCR(RT-qPCR)和等温扩增；另一种是直接核酸检测，无需靶向扩增，如核酸杂交、基因芯片等。大量临床病例的调查数据显示，至少35％的感染者属于无症状感染者。这些无症状个体和早期感染者的病毒载量较低，靶向核酸的扩增检测无疑更有利于诊断。虽然等温扩增已被证明灵敏度高，不需要精密的控温仪器，前景非常广阔，但大多数等温扩增体系由多种酶和引物组成，反应体系复杂，因此技术要求也较高。与等温扩增相比， RT-qPCR技术更加成熟，且普及率较高。医院和第三方检测机构均有成熟的PCR操作人员。因此，RT-qPCR检测仍是现阶段最流行的核酸检测技术。
快速、有效的病毒检测在新冠疫情时期格外重要，它可以追踪密切接触者，延长治疗窗口，支持靶向治疗。由于SARS-CoV-2的不断变异，现有疫苗的实际保护期需要时间去证明，但在此之前，我们需要不断改进现有的检测方法。为了缩短检测时间，研究人员对RT-qPCR反应中的Taq DNA聚合酶进行了大量的改进工作，如提高其反转录活性进行一步检测、进行点突变和修饰以增大其延伸速率，然而到目前为止，Taq DNA聚合酶的活性已经达到很高，想要再通过提高Taq DNA聚合酶活性来缩短检测时间不太可行；也有研究人员通过使用特殊仪器和更小的反应系统来提高温度变化的速率，如液滴数字PCR(ddPCR)，但是这种方式降低了检测的稳定性和通量。
RT-qPCR作为一种高灵敏度、高特异性的检测方法，在临床多种病原体和病毒的检测中发挥了重要作用。RT-qPCR检测包括逆转录和PCR循环扩增两个过程，PCR循环扩增又包括变性、退火和延伸三个过程。现有的核酸检测试剂盒都是将PCR循环扩增步骤中的退火和延伸合二为一，采用两步循环扩增来减少升温和降温的频率，这就需要在引物的退火温度和Taq DNA聚合酶的延伸温度之间取一个平衡。常规方法是将Taq DNA聚合酶的退火延伸温度设置为探针的退火温度－5℃(约60℃)，但是现有这种方法存在以下缺点：Taq DNA聚合酶在工作过程中没有达到最高活性状态，因此扩增速率未达到最高，从而造成检测耗时较长。因此，开发一种使Taq DNA聚合酶能够以更快的延伸速率工作，同时不降低检测稳定性和通量，有效缩短新型冠状病毒检测时间的一种引物、探针、试剂盒颇为重要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的上述缺陷，提供一种缩短新型冠状病毒检测时间的引物、探针、试剂盒及检测方法。
本发明的第一方面提供了一种使Taq DNA聚合酶能够以更快的延伸速率工作，从而缩短新型冠状病毒检测时间的引物、探针；所述引物两端延长，且延长引物采用检测靶基因中的其中一段序列，所述延长引物与基因组模板完全互补配对。
在一个实施方案中，对于新型冠状病毒检测，其由2条引物和1条探针组成，2条引物分别为上游引物long-ORF1ab PF、下游引物long-ORF1ab PR，1条探针为TaqMan探针long-ORF1ab FQS Probe或long-ORF1ab FQQ Probe，
上游引物long-ORF1ab PF的碱基序列是SEQ ID NO：4，
下游引物long-ORF1ab PR的碱基序列是SEQ ID NO：5，
TaqMan探针long-ORF1ab FQS Probe的碱基序列是SEQ ID NO：8，
TaqMan探针long-ORF1ab FQQ Probe的碱基序列是SEQ ID NO：7。
在一个实施方案中，上述TaqMan探针long-ORF1ab FQS Probe为经过荧光标记的，其5'端标记有荧光基团，在距离5'端第6个碱基的T碱基上标记有猝灭基团，3'端通过Spacer C3进行封闭。
在一个实施方案中，上述荧光基团为Fam，上述猝灭基团为BHQ1。
在一个实施方案中，上述TaqMan探针long-ORF1ab FQQ Probe为经过荧光标记的，其5'端标记有荧光基团，在距离5'端6个碱基的T碱基上标记有第一猝灭基团，3'端标记有第二猝灭基团。
在一个实施方案中，上述荧光基团为Fam，上述第一猝灭基团和第二猝灭基团均为BHQ1。
本发明的第二方面提供了一种缩短新型冠状病毒检测时间的荧光PCR检测方法。所述检测方法包括通过采用上述引物、探针对待测样品RNA进行实时荧光定量逆转录 PCR检测的步骤。
本发明的第三方面提供了一种缩短新型冠状病毒检测时间的检测试剂盒。所述试剂盒包括本发明用于检测新型冠状病毒的引物、探针。
本发明的有益效果是：
1、本发明另辟蹊径从Taq DNA聚合酶的另一角度(非常规提高活性)对RT-qPCR 反应中的引物和探针进行了科学的退火延伸和进一步优化，使其退火温度满足Taq DNA 聚合酶的最佳延伸温度，保证了Taq DNA聚合酶的最高工作效率，进而将退火和延伸时间从传统的30s进一步缩短到13s。
2、本发明改进后的TaqMan探针long-ORF1ab FQS探针(5'-荧光基团，中间碱基 T-猝灭基团，3'-Spacer C3)和long-ORF1ab FQQ探针(5'-荧光基团，中间碱基T-猝灭基团，3'-猝灭基团)均降低了PCR反应体系的背景荧光，消除了探针伸长导致的猝灭效率降低以及反应体系信噪比下降的问题。
3、本发明还通过进一步优化逆转录和变性时间，在不降低新型冠状病毒检测性能的前提下，将整个PCR检测时间从74min缩短到37min。与标准的中国CDC检测相比，本发明延长优化的引物和探针在检测SARS-COV-2方面表现出相当高的灵敏度和准确性，并且也表现出更高的效率。
4、本发明的延长引物采用检测靶基因中的其中一段序列，该延长引物与基因组模板完全互补配对，有效避免了与其它病原菌基因组模板发生退火结合，在一定程度上影响扩增进程的隐患，在前几轮扩增中，如果引物与初始模板不完全匹配，则只能采用低退火温度和三步法扩增，这样则会拉大了PCR变温范围，延长了反应时间。然而本发明的延长引物与基因组模板完全匹配，且Tm值达到70℃左右，可使退火延伸同时在 70℃开始进行，从一开始就可以直接采用两步法扩增，减少升降温过程，有效缩短检测时间。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本发明进一步详细说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或者按照制造厂商意见的条件。
用于对新型冠状病毒进行检测的实时荧光PCR引物和探针
以SARS-CoV-2的ORF1ab基因为检测靶标，分别使用Primer press 5.0，snapgene和primer express 3.0这三个软件对引物序列进行Tm值的预测，选择合适的引物探针。Chinese-CDC引物和探针分别命名为CDC-ORF1ab PF、CDC-ORF1ab PR、CDC-ORF1ab Probe，延长优化后的ORF1ab基因检测引物和探针分别命名为long-ORF1ab PF、 long-ORF1ab PR、long-ORF1ab Probe、long-ORF1ab FQQ Probe和long-ORF1ab FQS Probe，Chinese-CDC引物和探针以及延长优化后的引物和探针序列如下表1：
Figure RE-GDA0003514463100000041
RT-qPCR RNA模板的制备
将SARS-CoV-2 ORF1ab基因假病毒(初始浓度为108copies/ml)添加到健康人咽拭子上，放入保存液(25mM Tris-HCl pH 7.6，1mM EDTA，20mM异硫氰酸胍)中，然后置于56℃30min，模拟灭活的临床阳性样品。取200μL保存液，使用MiniBEST 病毒RNA/DNA提取试剂盒(TaKaRa)提取RNA。RNA模板用无酶水稀释至107 copies/mL、106copies/mL、105copies/mL和104copies/mL、5000copies/mL、1000copies/mL、 700copies/mL、500copies/mL、300copies/mL和100copies/mL。(此处模板浓度是否应与后面实验对应起来)
探针淬灭效率的测定
待测探针和仅5'-荧光基团标记的相应探针由生工生物技术有限公司合成并稀释至 10μM。使用酶标仪(Tecan Spark)测量探针的荧光，探针浓度为250nM(RT-qPCR反应中常使用的探针浓度)，通过比较待测探针与仅5'-荧光基团标记的相应探针的荧光强度来评估探针的淬灭效率。
RT-qPCR实验
实施例1：
反应体系设置如下：10.0μL 2×TaqMan Fast Master Mix(Novizan)、1.0μL TaqDNA聚合酶(Novizan)、0.5μL正向引物long-ORF1ab PF(10μM)、0.5μL反向引物 long-ORF1ab PR(10μM)、0.5μL探针long-ORF1ab FQS probe(10μM)组成,1.5μL 无核酸酶水和6.0μL核酸样品。RT-qPCR反应在qTOWER3(Analytik jena)上进行，反应程序为55℃逆转录2min，95℃预变性30s，95℃变性2s，70℃退火延伸13s， 45个循环。
实施例2：
反应体系设置如下：10μL 2×TaqMan Fast Master Mix(Novizan)、1.0μL TaqDNA 聚合酶(Novizan)、0.5μL正向引物long-ORF1ab PF(10μM)、0.5μL反向引物 long-ORF1ab PR(10μM)、0.5μL探针long-ORF1ab FQS probe(10μM)组成,1.5μL 无核酸酶水和6.0μL核酸样品。RT-qPCR反应在qTOWER3(Analytik jena)上进行，反应程序为55℃逆转录15min，95℃预变性30s，95℃变性10s，72℃退火延伸 30s，45个循环。
实施例3：
反应体系设置如下：10.0μL 2×TaqMan Fast Master Mix(Novizan)、1.0μL TaqDNA聚合酶(Novizan)、0.5μL正向引物long-ORF1ab PF(10μM)、0.5μL反向引物 long-ORF1ab PR(10μM)、0.5μL探针long-ORF1ab FQS probe(10μM)组成,1.5μL 无核酸酶水和6.0μL核酸样品。RT-qPCR反应在qTOWER3(Analytik jena)上进行，反应程序为55℃逆转录15min，95℃预变性30s，95℃变性10s，71℃退火延伸 30s，45个循环。
实施例4：
反应体系设置如下：10.0μL 2×TaqMan Fast Master Mix(Novizan)、1.0μL TaqDNA聚合酶(Novizan)、0.5μL正向引物long-ORF1ab PF(10μM)、0.5μL反向引物 long-ORF1ab PR(10μM)、0.5μL探针long-ORF1ab FQS probe(10μM)组成,1.5μL 无核酸酶水和6.0μL核酸样品。RT-qPCR反应在qTOWER3(Analytik jena)上进行，反应程序为55℃逆转录15min，95℃预变性30s，95℃变性10s，70℃退火延伸 30s，45个循环。同实施例2和3相比，只是退火延伸温度不同。
实施例5：
反应体系设置如下：10.0μL 2×TaqMan Fast Master Mix(Novizan)、1.0μL TaqDNA聚合酶(Novizan)、0.5μL正向引物long-ORF1ab PF(10μM)、0.5μL反向引物 long-ORF1ab PR(10μM)、0.5μL探针long-ORF1ab FQS probe(10μM)组成,1.5μL 无核酸酶水和6.0μL核酸样品。RT-qPCR反应在qTOWER3(Analytik jena)上进行，反应程序为55℃逆转录15min，95℃预变性30s，95℃变性10s，70℃退火延伸 20s，45个循环。同实施例4相比，只是退火延伸时间不同。
实施例6：
反应体系设置如下：10.0μL 2×TaqMan Fast Master Mix(Novizan)、1.0μL TaqDNA聚合酶(Novizan)、0.5μL正向引物long-ORF1ab PF(10μM)、0.5μL反向引物 long-ORF1ab PR(10μM)、0.5μL探针long-ORF1ab FQS probe(10μM)组成,1.5μL 无核酸酶水和6.0μL核酸样品。RT-qPCR反应在qTOWER3(Analytik jena)上进行，反应程序为55℃逆转录15min，95℃预变性30s，95℃变性10s，70℃退火延伸 15s，45个循环。同实施例4相比，只是退火延伸时间不同。
实施例7：
反应体系设置如下：10.0μL 2×TaqMan Fast Master Mix(Novizan)、1.0μL TaqDNA聚合酶(Novizan)、0.5μL正向引物long-ORF1ab PF(10μM)、0.5μL反向引物 long-ORF1ab PR(10μM)、0.5μL探针long-ORF1ab FQS probe(10μM)组成,1.5μL 无核酸酶水和6.0μL核酸样品。RT-qPCR反应在qTOWER3(Analytik jena)上进行，反应程序为55℃逆转录15min，95℃预变性30s，95℃变性10s，70℃退火延伸 13s，45个循环。同实施例4相比，只是退火延伸时间不同。
实施例8：
反应体系设置如下：10.0μL 2×TaqMan Fast Master Mix(Novizan)、1.0μL TaqDNA聚合酶(Novizan)、0.5μL正向引物long-ORF1ab PF(10μM)、0.5μL反向引物 long-ORF1ab PR(10μM)、0.5μL探针long-ORF1ab FQS probe(10μM)组成,1.5μL 无核酸酶水和6.0μL核酸样品。RT-qPCR反应在qTOWER3(Analytik jena)上进行，反应程序为55℃逆转录15min，95℃预变性30s，95℃变性10s，70℃退火延伸12s，45个循环。同实施例4相比，只是退火延伸时间不同。
实施例9：
反应体系设置如下：10.0μL 2×TaqMan Fast Master Mix(Novizan)、1.0μL TaqDNA聚合酶(Novizan)、0.5μL正向引物long-ORF1ab PF(10μM)、0.5μL反向引物 long-ORF1ab PR(10μM)、0.5μL探针long-ORF1ab FQQ probe(10μM)组成,1.5μL 无核酸酶水和6.0μL核酸样品。RT-qPCR反应在qTOWER3(Analytik jena)上进行，反应程序为55℃逆转录15min，95℃预变性30s，95℃变性10s，70℃退火延伸 13s，45个循环。同实施例7相比，只是所用探针不同。
对比实施例1：
反应体系设置如下：10.0μL 2×TaqMan Fast Master Mix(Novizan)、1.0μL TaqDNA聚合酶(Novizan)、0.5μL正向引物CDC-ORF1ab PF(10μM)、0.5μL反向引物 CDC-ORF1abPR(10μM)、0.5μL探针CDC-ORF1ab Probe(10μM)组成,1.5μL无核酸酶水和6.0μL核酸样品。RT-qPCR反应在qTOWER3(Analytik jena)上进行，反应程序为55℃逆转录15min，95℃预变性30s，95℃变性10s，70℃退火延伸13s， 45个循环。同实施例7相比，只是引物和探针不同。
对比实施例2：
反应体系设置如下：10.0μL 2×TaqMan Fast Master Mix(Novizan)、1.0μL TaqDNA聚合酶(Novizan)、0.5μL正向引物CDC-ORF1ab PF(10μM)、0.5μL反向引物 CDC-ORF1abPR(10μM)、0.5μL探针CDC-ORF1ab Probe(10μM)组成,1.5μL无核酸酶水和6.0μL核酸样品。RT-qPCR反应在qTOWER3(Analytik jena)上进行，反应程序为55℃逆转录15min，95℃预变性30s，95℃变性10s，60℃退火延伸30s， 45个循环。同对比实施例1相比，只是退火延伸温度不同。
对比实施例3：
反应体系设置如下：10.0μL 2×TaqMan Fast Master Mix(Novizan)、1.0μL TaqDNA聚合酶(Novizan)、0.5μL正向引物long-ORF1ab PF(10μM)、0.5μL反向引物 long-ORF1ab PR(10μM)、0.5μL探针long-ORF1ab Probe(10μM)组成,1.5μL无核酸酶水和6.0μL核酸样品。RT-qPCR反应在qTOWER3(Analytik jena)上进行，反应程序为55℃逆转录15min，95℃预变性30s，95℃变性10s，70℃退火延伸13s， 45个循环。同实施例7相比，只是所用探针不同。
检测限的确定
在5000copies/ml、1000copies/ml、700copies/ml、500copies/ml、300copies/ml和 100copies/ml 6个模板浓度下进行测定，每个浓度重复20次。结果判定：Ct值≤38判定为阳性结果，Ct值>38或无Ct判定为阴性结果。
将阳性率大于95％(19次)的模板浓度定义为检测限。
表2上述实施例和对比实施例的6个模板浓度下的阳性率
Figure RE-GDA0003514463100000081
从表2可以得出以下结论：
实施例1-9的检测限分别为500、5000、700、500、500、500、500、700、500；对比实施例1-3的检测限分别为检测不到、500、5000。
上述实施例和对比实施例的RT-qPCR实验结果如下表3：
Figure RE-GDA0003514463100000082
Figure RE-GDA0003514463100000091
从表3可以得到以下结论：
1、对比实施例1中在较高的延伸温度(70℃)下使用Chinese-CDC引物和探针SEQID NO：1、2、3进行扩增，45个循环后结果为无扩增曲线，检测不到，说明在70℃下Chinese-CDC引物未与DNA模板结合。对比实施例2中在较低的延伸温度(60℃)下使用Chinese-CDC引物和探针SEQ ID NO：1、2、3进行扩增，45个循环后结果为有扩增曲线，说明在60℃下Chinese-CDC引物与DNA模板结合，但是扩增速度较慢，检测时间较长。而实施例7中在较高的延伸温度(70℃)下使用延长优化的引物和探针SEQ ID NO：4、5、8进行扩增，45个循环后结果为有扩增曲线，说明在70℃下延长优化的引物SEQ ID NO：4、5与DNA模板有效结合，且扩增速度更快，检测时间从74min (对比实施例2)缩短到了56min(实施例7)，比中国CDC的标准扩增时间缩短了 24％。Chinese-CDC的引物和探针已广泛应用于临床检测，反馈良好。由于本发明延长优化的引物和探针是在Chinese-CDC的引物和探针基础上改进的，具有更高的Tm值，实际检测中的退火和延伸温度更高，因此它们的检测特异性优于中国CDC引物和探针。因此可以使用本发明改进的具有高Tm值的引物和探针来缩短新型冠状病毒检测时间。
2、从实施例2结果可以看出，延长优化后的引物和探针用于72℃延伸时，检测限为5000copies/ml，灵敏度极低，用于71℃延伸时，检测限为700copies/ml，灵敏度也较低，但70℃延伸检测限为500copies/ml，可以使用，这接近Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度。因此本发明改进的延长优化后的引物和探针可用于70℃延伸以接近Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度，进而缩短新型冠状病毒检测时间。
3、从实施例7、9和对比实施例3结果可得：long-ORF1ab FQS探针SEQ ID NO： 8和long-ORF1ab FQQ探针SEQ ID NO：7猝灭效率相当，均可达到99％。而long-ORF1ab 探针SEQID NO：6猝灭效率较低，仅为71％。另外，在相同的反应条件下，long-ORF1ab FQS探针SEQID NO：8的背景信号和long-ORF1ab FQQ探针SEQ ID NO：7一致，可达到一致的检测限，但是由于long-ORF1ab探针的背景信号明显高于long-ORF1ab FQQ 和long-ORF1ab FQS两种探针，因此long-ORF1ab探针最低检测限明显高于long-ORF1ab FQQ探针和long-ORF1ab FQS探针。另外Spacer C3基团的成本远低于BHQ1基团，因此优选long-ORF1ab FQS探针SEQ IDNO：8。
4、从实施例4-7结果可知，在6个模板浓度下，当延伸时间从30s缩短到13s，检测靶标的Ct值不变，检测限均为500copies/ml。从实施例8结果可知，当延伸时间短于13s时，检测靶标的Ct值增大，检测限为700copies/ml，这表明当延伸时间为13s 时，Taq DNA聚合酶达到了它的极限扩增速率。
5、从实施例1结果可知，Taq DNA聚合酶在70℃下确实具有更快的延伸率，另外当逆转录时间从15min缩短到2min，变性时间从10s缩短到2s时，最低检测限仍然可以达到500copies/ml。在检测时间方面，实施例1的PCR扩增时间和总检测时间分别缩短为35min和37min，比对比实施例2缩短41％和50％。
综上所述，本发明另辟蹊径从Taq DNA聚合酶的另一角度(非常规提高活性)对RT-qPCR反应中的引物和探针进行了科学的延伸和进一步优化，使其退火温度满足Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度，保证了Taq DNA聚合酶的最高工作效率，进而将退火和延伸时间从传统的30s进一步缩短到13s。另外，本发明改进后的TaqMan探针FQS 探针(5'-荧光基团，中间碱基T-猝灭基团，3'-Spacer C3)降低了PCR反应体系的背景荧光，消除了探针伸长导致的猝灭效率降低以及反应体系信噪比下降的问题。此外，本发明还通过进一步优化逆转录和变性时间，在不降低新型冠状病毒检测性能的前提下，将整个PCR检测时间从74min缩短到37min。与标准的中国CDC检测相比，本发明延长优化的引物和探针在检测SARS-COV-2方面表现出相当高的灵敏度和准确性，并且也表现出更高的效率。最后，本发明的延长引物采用检测靶基因中的其中一段序列，该延长引物与基因组模板完全互补配对，有效避免了与其它病原菌基因组模板发生退火结合，在一定程度上影响扩增进程的隐患，本发明的延长引物与基因组模板完全匹配，且 Tm值达到70℃左右，可使退火延伸同时在70℃开始进行，从一开始就可以直接采用两步法扩增，减少升降温过程，有效缩短新型冠状病毒检测时间。
上述具体实施方式仅是本发明的具体个案，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施方式。但是凡是未脱离本发明技术原理的前提下，依据本发明的技术实质对以上实施方式所作的任何简单修改、等同变化与改型，皆应落入本发明的专利保护范围。
序列表
<110> 山东仕达思生物产业有限公司 山东仕达思医疗科技有限公司
<120> 一种缩短新型冠状病毒检测时间的引物、探针、试剂盒及检测方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
ccctgtgggt tttacactta a 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
acgattgtgc atcagctga 19
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
ccgtctgcgg tatgtggaaa ggttatgg 28
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
gaccctgtgg gttttacact taaaaacaca gtctgt 36
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
aacgattgtg catcagctga ctgaagcatg ggt 33
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
ccgtctgcgg tatgtggaaa ggttatggct gtagttgtga tcaactccgc 50
<210> 7
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
ccgtctgcgg tatgtggaaa ggttatggct gtagttgtga tcaactccgc 50
<210> 8
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
ccgtctgcgg tatgtggaaa ggttatggct gtagttgtga tcaactccgc 50

Claims (9)

1.一种缩短新型冠状病毒检测时间的引物、探针，其特征在于：所述新型冠状病毒引物的碱基序列是SEQ ID NO：4和5，探针的碱基序列是SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8。
2.如权利要求1所述的一种缩短新型冠状病毒检测时间的引物、探针，其特征在于：所述引物两端延长，且延长引物采用检测靶基因中的其中一段序列，所述延长引物与基因组模板完全互补配对。
3.如权利要求1所述的一种缩短新型冠状病毒检测时间的引物、探针，其特征在于：所述探针为经过荧光标记的，其5'端标记有荧光基团，在距离5'端第6个碱基的T碱基上标记有猝灭基团，3'端通过Spacer C3进行封闭。
4.如权利要求3所述的一种缩短新型冠状病毒检测时间的引物、探针，其特征在于：所述荧光基团为Fam，所述猝灭基团为BHQ1。
5.如权利要求1所述的一种缩短新型冠状病毒检测时间的引物、探针，其特征在于：所述探针为经过荧光标记的，其5'端标记有荧光基团，在距离5'端第6个碱基的T碱基上标记有第一猝灭基团，3'端标记有第二猝灭基团。
6.如权利要求5所述的一种缩短新型冠状病毒检测时间的引物、探针，其特征在于：所述荧光基团为Fam，所述第一猝灭基团和第二猝灭基团均为BHQ1。
7.一种缩短新型冠状病毒检测时间的荧光PCR检测方法，其特征在于：所述方法包括以权利要求1-6任一项所述的引物、探针对待测样品RNA进行实时荧光定量逆转录PCR检测，产生S型扩增曲线则为阳性。
8.如权利要求7所述的一种缩短新型冠状病毒检测时间的荧光PCR检测方法，其特征在于：所述实时荧光定量逆转录PCR反应程序包括：
55℃反转录2min；
95℃预变性30s；
95℃变性2s，70℃退火延伸13s，45个循环。
9.一种缩短新型冠状病毒检测时间的检测试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1-6任一所述的引物、探针。
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