CN113278730A - 一种新型冠状病毒检测试剂盒、用途及其使用方法 - Google Patents

一种新型冠状病毒检测试剂盒、用途及其使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113278730A
CN113278730A CN202010105196.6A CN202010105196A CN113278730A CN 113278730 A CN113278730 A CN 113278730A CN 202010105196 A CN202010105196 A CN 202010105196A CN 113278730 A CN113278730 A CN 113278730A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
kit
sequence
seq
probe
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010105196.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113278730B (zh
Inventor
董璐
陈威
汪瑶
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chongqing Zhongyuan Huiji Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Chongqing Zhongyuan Huiji Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chongqing Zhongyuan Huiji Biotechnology Co Ltd filed Critical Chongqing Zhongyuan Huiji Biotechnology Co Ltd
Priority to CN202010105196.6A priority Critical patent/CN113278730B/zh
Publication of CN113278730A publication Critical patent/CN113278730A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113278730B publication Critical patent/CN113278730B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种新型冠状病毒检测试剂盒、用途及其使用方法，试剂盒主要包括引物探针混合物，所述引物探针混合物由Orf1ab基因、N基因和S基因特异性的正、反向引物及特异性的探针组成，采用本发明中的试剂盒具有快速、灵敏度高、特异性好以及具有良好重现性的优点；本发明中的内质控品的引物序列中扩增片段为人基因组中基因，可增加判断采样是否成功的敏感性，能够避免检测结果假阴性，让潜在病患得到及时的隔离以及救治；研发人员在研发过程中偶然发现新型冠状病毒中的S基因具有很好的保守性，对于新型冠状病毒的检测具有很好的特异性。

Description

一种新型冠状病毒检测试剂盒、用途及其使用方法
技术领域
本发明属于基因检测领域，涉及一种利用多重实时荧光RT-PCR技术检测新型冠状病毒的试剂盒、用途及这种试剂盒的使用方法。
背景技术
冬季和早春为流行性感冒的爆发季节，每年这个时候成人中的普通感冒主要由冠状病毒所引起。冠状病毒是在动物和人体中发现的一个大型病毒家族，最早由鸡胚中分离出来，到目前为止，大约有15中不同的冠状病毒被发现。其中，能感染人的冠状病毒有六种，HCoV-229E，HCoV-0C43，HCoV-NL63，HCoV- HKU1，SARS-CoV和MERS-CoV。在这6中病毒里，前四种只会引起普通的感冒，普通的病毒性感冒2-5天即会出现相应症状，经过治疗1-2周可以恢复。后两种是引起全球恐惧的严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)MERS-CoV，这两种病毒可引起全球范围内大范围的流行。
2019新型冠状病毒的序列已先后被中国疾控中心以及世界卫生健康组织 WTO先后公布，新型冠状病毒和其他冠状病毒一样是一种ssRNA病毒，测序结果显示，其全长约30Kb，新型冠状病毒属于RNA病毒，现在针对该病毒的研究刚刚开始，现目前，多数厂家都是采用两个区域进行检测，但是，在实际检测中，存在一定比例单个靶标区域阳性的结果，说明试剂对不同区域的敏感性存在差异，也可能是靶标之间的相互竞争所导致，此外，试剂盒的其他成分、反应体系以及样本的加入量都会影响检测分析敏感性、特异性以及检测重现性。
目前，大多数检测试剂盒里面都有内质控品，这些质控品都是取样后直接向样本中添加，内质控品只能检测整个提取以及检测过程操作是否正确，但是却不能保证采样过程是否成功，而样本采集的是否成功关乎患者检测结果，采样量的多少又与样本能够成功检测息息相关。使用外源内标进行检测会导致大量的潜在的冠状病毒因取样失败漏检，患者得不到及时的隔离以及救治，最终导致病人的死亡以及健康者的传染。
因此，开发一种检测快速、灵敏度高、特异性好、能够避免假阴性以及具有良好重现性的新型冠状病毒检测试剂盒。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种快速、灵敏度高、特异性好、能够避免假阴性以及具有良好重现性的检测新型冠状病毒的RT-PCR检测试剂盒。
本发明提供了一种新型冠状病毒检测试剂盒，所述试剂盒主要包括引物探针混合物，所述引物探针混合物由Orf1ab基因、N基因和S基因特异性的正、反向引物及特异性的探针组成。
进一步的，本发明中Orf1ab基因的正向引物的序列如SEQ ID NO：1所示；所述Orf1ab基因的反向引物的序列如SEQ ID NO：2所示；
本发明中N基因的的正向引物的序列如SEQ ID NO：3所示；所述N基因的反向引物的序列如SEQ ID NO：4所示；
本发明中S基因的正向引物的序列如SEQ ID NO：5所示；所述S基因的反向引物的序列如SEQ ID NO：6所示。
进一步的，本发明中Orf1ab基因的探针的序列如SEQ ID NO：7所示；
本发明中N基因的探针的序列如SEQ ID NO：8所示；
本发明中S基因的探针的序列如SEQ ID NO：9所示。
进一步的，本发明试剂盒中还包括内质控品，所述内质控品的正向引物的序列如SEQ ID NO：10所示，所述内质控品的反向引物的序列如SEQ ID NO：11 所示。
进一步的，本发明中内质控品的探针序列如SEQ ID NO：12所示。
进一步的，本发明中探针的两端分别带有荧光基团和猝灭基团，所述荧光基团为FAM、ROX、VIC、TET和CY5中的一种，所述猝灭基团为BHQ1、BHQ2、 BHQ3和MGBNFQ中的一种。
进一步的，本发明试剂盒还包括PCR反应液，所述反应液主要由如下组分组成：Tris-HCl pH＝8.5 1-10mM，KCl 1-5mM，MgCl2 6-12mM，dATP 0.5-2 mM，dCTP 0.5-2mM，dGTP 0.5-2mM，dUTP 2-4mM，DTT 1-5mM。
进一步的，本发明中PCR反应液主要由如下成分组成：Tris-HCl pH＝8.5 5 mM，KCl 4mM，MgCl2 8mM，dATP 0.8mM，dCTP 0.8mM，dGTP 0.8mM，dUTP 2mM，DTT2 mM。
进一步的，本发明试剂盒还包括PCR酶液，PCR酶液主要由如下成分组成： HotStart Taq 10-50％，UNG 1-20％，HiScript Reverse Transcriptase1％-10％， TaqSSB10-50％，甘油10-50％，Anti-Taq 1-50％。
进一步的，本发明试剂盒中PCR酶液主要由如下成分组成：Hot Start Taq 15％；Anti-Taq 15％；UNG 7％；HiScript Reverse Transcriptase 8％；TaqSSB 15％；甘油40％。
本发明还提供采用如上任意一项所述的试剂盒来检测新冠状病毒的用途。
本发明还提供使用如上任意一项所述的试剂盒的使用方法，所述方法包括如下步骤：
1)核酸提取：采用核酸提取试剂对样本中的RNA进行提取，得核酸提取产物；
2)PCR扩增：PCR反应体系如下：PCR反应液10-50％；PCR酶液5-20％；单基因和内质控品的正向引物和反向引物分别0.1-4μM；探针0.05-0.8μM；核酸提取产物10-50％。
进一步的，本发明中PCR反应体系如下：PCR反应液25％；PCR酶液10％；单项目和内质控品的正向引物和反向引物分别0.8μM；探针0.5μM；核酸提取产物30％。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：采用本发明中的试剂盒，通过试剂盒中的引物探针、PCR反应液、PCR酶液以及其他成分的结合、协同，最后得到一种快速、灵敏度高、特异性好以及具有良好重现性的检测新型冠状病毒的RT- PCR检测试剂盒；本发明中的内质控品为人基因组中的基因，不需要另外添加，样本中即含有，针对这个反应体系，我们设置了特异性的内质控品的引物和探针，能够增加判断采样是否成功的敏感性，能够避免检测结果假阴性，让潜在病患得到及时的隔离以及救治；研发人员在研发过程中偶然发现新型冠状病毒中的S基因具有很好的保守性，对于新型冠状病毒的检测具有很好的特异性。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再做进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术属于本发明的内容。
附图说明
图1为本发明试剂盒对不同浓度样本中N基因的扩增图；
图2为本发明试剂盒对不同浓度样本中Orf1ab基因的扩增图；
图3为本发明试剂盒对不同浓度样本中S基因的扩增图；
图4为为本发明试剂盒特异性扩增图；
图5为本发明试剂盒对除新冠病毒外的病原体中N基因的扩增图；
图6为本发明试剂盒对除新冠病毒外的病原体中Orf1ab基因的扩增图；
图7为本发明试剂盒对除新冠病毒外的病原体中S基因的扩增图。
具体实施方式
说明：本发明中核酸提取试剂采用重庆中元汇吉生物技术有限公司生产的产品。
实施例1一种新型冠状病毒检测试剂盒
1、PCR反应液：Tris-HCl pH＝8.5 1mM，KCl 1mM，MgCl2 6mM，dATP 0.5mM，dCTP0.5mM，dGTP 0.5mM，dUTP 2mM，DTT 1mM。
2、PCR酶液：Hot Start Taq 10％，UNG 1％，HiScript Reverse Transcriptase1％，TaqSSB 10％，Anti-Taq 1％，甘油10％。
3、基因引物对以及探针序列如下：
Orf1ab基因的正向引物的序列如SEQ ID NO：1所示；Orf1ab基因的反向引物的序列如SEQ ID NO：2所示；
N基因的的正向引物的序列如SEQ ID NO：3所示；N基因的反向引物的序列如SEQID NO：4所示；
S基因的正向引物的序列如SEQ ID NO：5所示；S基因的反向引物的序列如SEQ IDNO：6所示；
Orf1ab基因的探针的序列如SEQ ID NO：7所示；
N基因的探针的序列如SEQ ID NO：8所示；
S基因的探针的序列如SEQ ID NO：9所示；
Orf1ab基因、N基因、S基因分别对应的荧光基团是TET、CY5、VIC，对应的猝灭基团都为MGBNFQ。
4、内质控品的引物和探针序列如下所示：
内质控品的正向引物的序列如SEQ ID NO：10所示；
内质控品的反向引物的序列如SEQ ID NO：11所示；
内质控品的探针序列如SEQ ID NO：12所示，内控品的荧光探针是ROX。
其中PCR反应体系如下：PCR反应液10％，PCR酶液5％，单基因和内质控品的正向引物和反向引物分别为0.1μM，探针都为0.05μM，核酸提取产物 10％。
实施例2一种新型冠状病毒检测试剂盒
1、PCR反应液：Tris-HCl pH＝8.5 10mM，KCl 5mM，MgCl2 12mM，dATP 2mM，dCTP2mM，dGTP 2mM，dUTP 4mM，DTT 5mM。
2、PCR酶液：Hot Start Taq 50％，UNG 20％，HiScript Reverse Transcriptase10％，TaqSSB 50％，甘油50％，Anti-Taq 50％。
3、基因引物对以及探针序列(与实施例1中相同)
Orf1ab基因、N基因、S基因分别对应的荧光基团是ROX、TET、CY5，对应的猝灭基团都为BHQ3。
4、内质控品的引物和探针序列(与实施例1中相同)
内质控品对应的荧光基团为VIC。
其中PCR反应体系如下：PCR反应液50％，PCR酶液20％，单基因和内质控品的正向引物和反向引物分别为4μM，探针都为为0.8μM，核酸提取产物 30％。
实施例3一种新型冠状病毒检测试剂盒
1、PCR反应液：Tris-HCl pH＝8.5 5mM，KCl 4mM，MgCl2 8mM，dATP 0.8mM，dCTP0.8mM，dGTP 0.8mM，dUTP 2mM，DTT 2mM。
2、PCR酶液：Hot Start Taq 15％，UNG 7％，HiScript Reverse Transcriptase8％，TaqSSB 15％，Anti-Taq 15％，甘油40％。
3、基因引物对以及探针序列(与实施例1中相同)
Orf1ab基因、N基因、S基因分别对应的荧光基团是ROX,FAM,CY5，对应的猝灭基团都为BHQ1。
4、内质控品的引物和探针序列(与实施例1中相同)
荧光基团为VIC。
其中PCR反应体系如下：PCR反应液25％，PCR酶液10％，单基因和内质控品的正向引物和反向引物分别为0.8μM，探针都为0.5μM，核酸提取产物 20％。
实施例4新型冠状病毒检测试剂盒灵敏度、精密度以及特异性
1、基本实验过程
A、采样：我们提取的样本为企业阳性参考品，样本储存于-20℃或者-70℃冰箱中。
B、核酸提取：采用重庆中元汇吉生物技术有限公司生产的核酸提取试剂，配套奥胜半自动核酸提取仪，主要步骤如下：
1)将采取的样本加入第一列，每孔200μL；
2)将核酸提取试剂中的各种成分按照比例加入第一列，每孔加入500μL；
3)将核酸提取试剂中的洗涤液加入第三列，每孔600μL；
4)将洗脱液加入第六列，每孔65ul；
5)操作奥胜半自动核酸提取仪中，按照以下程序进行提取，最后获得核酸提提取产物；
Figure RE-GDA0002464468780000061
C、PCR扩增：
使用上海宏石SLAN 96P PCR仪，采用实施例3中所述的PCR反应体系， PCR反应程序如下：
Figure RE-GDA0002464468780000062
使用一个PCR管占用4个荧光通道，其中N基因占用FAM，Orf1ab占用 ROX通道，S基因占用CY5通道，内标占用VIC通道。三个靶标基因出现两个或以上起即可判定为阳性。
2、灵敏度
1)实验过程：
选择新型冠状病毒企业阳性参考品，使用阴性样本基质稀释成5个梯度(2000copies/mL、1000copies/mL、500copies/mL、250copies/mL、125copies/mL)，其余实验步骤按照1中的基本实验过程进行操作。
2)实验结果
实验结果见图1、图2和图3以及表1
表1灵敏度实验结果统计
浓度(copies/mL) 阳性检出数 总测试数/次 检出率
2000 4 4/4 100.00％
1000 4 4/4 100.00％
500 4 4/4 100.00％
250 3 3/4 75％
125 3 3/4 75％
分析：从图1、图2和图3可以看出，2000copies/mL、1000copies/mL、 500copies/mL、250copies/mL这四个浓度的检测结果较好，曲线形态呈较好的S 型，当浓度低于500copies/mL时，曲线形态已不正常；从表1中看出，浓度大于等于500copies/mL时，可以全部检出，而当浓度低于500copies/mL时，检出率只有75％，由此可知试剂盒的灵敏度线在500copies/mL附近。
3、特异性
1)实验过程：
以企业阴性参考品作为基质，选择含有甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、肺炎克雷伯杆菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌、百日咳杆菌、嗜肺军团菌、金黄色葡萄球菌、肺炎支原体、肺炎衣原体的病原体作为交叉反应样本，其余的核酸提取以及 PCR扩增按照1中的基本实验过程进行操作。
2)实验结果：
分析：实验结果见图4，由图4中可以看出对含有甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、肺炎克雷伯杆菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌、百日咳杆菌、嗜肺军团菌、金黄色葡萄球菌、肺炎支原体、肺炎衣原体的样本，本发明检测试剂盒并未发现特异性扩增，表明本发明检测试剂盒对新冠状病毒具有特异性。
4、精密度
1)实验过程：
将新型冠状病毒企业精密度参考品稀释至1000copies/mL作为样本，平行测 8次，其余实验步骤按照1中的基本实验过程进行操作。
2)实验结果
分析：实验结果见图5、图6和图7所示，从图中可以看出，曲线形态呈较好的S型，并且曲线的CtCV％见下表2，可知CtCV(％)均小于1％，说明本发明中的试剂盒的精密度较好，具有良好的稳定性。
表2各个通道的Ct和CtCV(％)值
Figure RE-GDA0002464468780000081
实施例5对比实施例(内质控品)
1)实验过程：
采用实施例3中的PCR反应体系；
对比反应体系：采用质粒作为内质控品的引物以及探针(上游引物序列：GGTTGTATCACATCGATCACCT、下游引物序列： TGACAGCAATTTCTCGACCTAT、探针序列：TCCAGCTTCTGAGTCGCTCGGTCTA)；
其余实验步骤按照实施例4中第1步中的基本实验过程进行操作
2)实验结果如表3和表4所示。使用两个企业阳性参考品基质为样本进行检测发现自研试剂盒内标为阴性，此时可将样本判断为取样失败。而竞品试剂盒对企业阳性参考品基质为样本进行检测发现内标正常，判断样本为阴性样本。因此相比于对比的外源添加内标，本发明的内源性内标可以快速判断样本是否为假阴性。
表3本发明试剂盒检测结果
样本 Orf1ab N S 内标
企业阳性参考品 阳性 阳性 阳性 阳性
企业阴性参考品 阴性 阴性 阴性 阳性
阳性参考品基质 阴性 阴性 阴性 阴性
表4对比试剂盒检测结果
样本 Orf1ab N S 内标
企业阳性参考品 阳性 阳性 / 阳性
企业阴性参考品 阴性 阴性 / 阳性
阳性参考品基质 阴性 阴性 / 阳性
实施例6对比实施例(与其他厂家的检测试剂盒进行对比)
1)实验过程：
对患者的同一部位三次采样，然后对三次样本(样本A、样本B、样本 C进行核酸检测)；
采用实施例3中的PCR反应体系；
对比厂家：某厂家生产的新型冠状病毒Orf1ab/N基因RT-PCR检测试剂盒；
其余实验步骤按照实施例4中第1步中的基本实验过程进行操作。
2)实验结果：
实验结果见下表5：
表5本发明与竞品检测结果
Figure RE-GDA0002464468780000091
Figure RE-GDA0002464468780000101
分析：从上表中看出，对同一个样本进行检测时本发明的Ct值比竞品试剂盒普遍提前2-3个Ct值，并且本发明试剂盒具有更高的检出率。
序列表
<110> 重庆中元汇吉生物技术有限公司
<120> 一种新冠状病毒检测试剂盒、用途及其使用方法
<130> 2020.2.20
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成(artificially synthesized )
<400> 1
cagaggacgc gcagggaat 19
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成(artificially synthesized)
<400> 2
atctgtgtgg ccaacctctt ct 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成(artificially synthesized)
<400> 3
agcgaaatgc accccgcatt a 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成(artificially synthesized)
<400> 4
tcttggttca ccgctctcac t 21
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成(artificially synthesized)
<400> 5
agatcgatcc tgtcacctct gac 23
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(artificially synthesized)
<400> 6
atccgtctac gctgcagtct 20
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成(artificially synthesized)
<400> 7
tgatgtttca actggttttg tgctc 25
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成(artificially synthesized)
<400> 8
ccgacgttgt tttgatcgcg cccc 24
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成(artificially synthesized)
<400> 9
acgctcagcc tgcctagtga gcc 23
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成(artificially synthesized)
<400> 10
cagatgtgga tcagcaagca ggag 24
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成(artificially synthesized)
<400> 11
tgtcaagaaa gggtgtaacg caactaa 27
<210> 12
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成(artificially synthesized)
<400> 12
cgagtccggc ccctccatcg tccaccgcaa at 32

Claims (10)

1.一种新型冠状病毒检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒主要包括引物探针混合物，所述引物探针混合物由Orf1ab基因、N基因和S基因特异性的正、反向引物及特异性的探针组成。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：
所述Orf1ab基因的正向引物的序列如SEQ ID NO：1所示；所述Orf1ab基因的反向引物的序列如SEQ ID NO：2所示；
所述N基因的的正向引物的序列如SEQ ID NO：3所示；所述N基因的反向引物的序列如SEQ ID NO：4所示；
所述S基因的正向引物的序列如SEQ ID NO：5所示；所述S基因的反向引物的序列如SEQID NO：6所示。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：
所述Orf1ab基因的探针的序列如SEQ ID NO：7所示；
所述N基因的探针的序列如SEQ ID NO：8所示；
所述S基因的探针的序列如SEQ ID NO：9所示；
4.如权利要求1-3任意一项所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括内质控品，所述内质控品的正向引物的序列如SEQ ID NO：10所示，所述内质控品的反向引物的序列如SEQ ID NO：11所示，优选的，所述内质控品的探针序列如SEQ ID NO：12所示，
5.如权利要求1-4任意一项所述的试剂盒，其特征在于：所述探针的两端分别带有荧光基团和猝灭基团，所述荧光基团为FAM、ROX、VIC、TET和CY5中的一种，所述猝灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3和MGBNFQ中的一种。
6.如权利要求1-5任意一项所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括PCR反应液，所述反应液主要由如下组分组成：Tris-HCl pH＝8.5 1-10mM，KCl 1-5mM，MgCl26-12mM，dATP 0.5-2mM，dCTP 0.5-2mM，dGTP 0.5-2mM，dUTP 2-4mM，DTT 1-5mM；优选的，所述反应液主要由如下成分组成：Tris-HCl pH＝8.5 5mM，KCl 4mM，MgCl2 8mM，dATP 0.8mM，dCTP0.8mM，dGTP 0.8mM，dUTP 2mM，DTT 2mM。
7.如权利要求1-6任意一项所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括PCR酶液，所述PCR酶液主要由如下成分组成：Hot Start Taq 10-50％，UNG 1-20％，HiScript ReverseTranscriptase1％-10％，TaqSSB 10-50％，Anti-Taq 1-50％，甘油10-50％，优选的，所述PCR酶液主要由如下成分组成：Hot Start Taq 15％；Anti-Taq 15％；UNG 7％；HiScriptReverse Transcriptase 8％；TaqSSB 15％；甘油40％。
8.一种采用如权利要求1-7任意一项所述的试剂盒用于检测新冠状病毒的用途。
9.一种使用如权利要求1-7任意一项所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
1)核酸提取：采用核酸提取试剂对样本中的RNA进行提取，得核酸提取产物；
2)PCR扩增：PCR反应体系如下：PCR反应液10-50％；PCR酶液5-20％；单基因和内质控品的正向引物和反向引物分别0.1-4μM；探针0.05-0.8μM；核酸提取产物10-30％。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述PCR反应体系如下：PCR反应液25％；PCR酶液10％；单项目和内质控品的正向引物和反向引物分别0.8μM；探针0.5μM；核酸提取产物20％。
CN202010105196.6A 2020-02-20 2020-02-20 一种新型冠状病毒检测试剂盒、用途及其使用方法 Active CN113278730B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010105196.6A CN113278730B (zh) 2020-02-20 2020-02-20 一种新型冠状病毒检测试剂盒、用途及其使用方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010105196.6A CN113278730B (zh) 2020-02-20 2020-02-20 一种新型冠状病毒检测试剂盒、用途及其使用方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113278730A true CN113278730A (zh) 2021-08-20
CN113278730B CN113278730B (zh) 2022-03-25

Family

ID=77275089

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010105196.6A Active CN113278730B (zh) 2020-02-20 2020-02-20 一种新型冠状病毒检测试剂盒、用途及其使用方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113278730B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111304368A (zh) * 2020-03-19 2020-06-19 艾康生物技术(杭州)有限公司 用于检测新型冠状病毒的方法、寡核苷酸和试剂盒
CN114214465A (zh) * 2022-01-26 2022-03-22 山东仕达思生物产业有限公司 一种缩短新型冠状病毒检测时间的引物、探针、试剂盒及检测方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107245095A (zh) * 2017-06-15 2017-10-13 武汉大学 用于抑制十种冠状病毒的多肽抑制剂
WO2018126009A1 (en) * 2016-12-29 2018-07-05 University Of Miami Method for modulating inflammasome activity and inflammation in the lung

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018126009A1 (en) * 2016-12-29 2018-07-05 University Of Miami Method for modulating inflammasome activity and inflammation in the lung
CN107245095A (zh) * 2017-06-15 2017-10-13 武汉大学 用于抑制十种冠状病毒的多肽抑制剂

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHANG,Y.-Z. 等: "NCBI Reference Sequence: NC_045512.1", 《GENBANK》 *
陈炜 等: "4例新型冠状病毒感染病例咽拭子与痰标本病毒核酸检测的比较", 《中国人兽共患病学报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111304368A (zh) * 2020-03-19 2020-06-19 艾康生物技术(杭州)有限公司 用于检测新型冠状病毒的方法、寡核苷酸和试剂盒
CN114214465A (zh) * 2022-01-26 2022-03-22 山东仕达思生物产业有限公司 一种缩短新型冠状病毒检测时间的引物、探针、试剂盒及检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN113278730B (zh) 2022-03-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111020064B (zh) 新型冠状病毒ORF1ab基因核酸检测试剂盒
CN111254228B (zh) 一种检测新型冠状病毒和流感病毒的试剂盒
CN111394511B (zh) 2019新型冠状病毒的检测引物组、探针组及检测试剂盒
CN111270013A (zh) 一种检测2019新型冠状病毒的多重实时荧光定量pcr试剂盒、方法及引物探针组合物
CN111321249A (zh) 一种SARS-CoV-2的环介导等温扩增检测引物组、试剂盒及方法
CN111004870A (zh) 新型冠状病毒n基因核酸检测试剂盒
CN111534576B (zh) 用于荧光定量pcr的方法、组合物、试剂盒及其用途
CN111334615A (zh) 一种新型冠状病毒检测方法与试剂盒
CN111518960A (zh) 一种用于冠状病毒分型检测的多重RT-qPCR试剂盒、引物探针组合物及其使用方法
CN111235320A (zh) 新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒
CN111394513A (zh) 新型冠状病毒SARS-CoV-2荧光定量PCR检测方法及其应用
CN113493856B (zh) 一种用于冠状病毒检测分型的多重rt-pcr试剂盒、方法及引物组
CN113005226A (zh) 检测SARS-CoV-2的寡核苷酸和试剂盒
CN113278730B (zh) 一种新型冠状病毒检测试剂盒、用途及其使用方法
CN111270017A (zh) 一种基于数字pcr检测新型冠状病毒的引物探针组合及其应用
CN111593142A (zh) 一种同时检测包括SARS-CoV-2的九种呼吸道病毒的检测试剂盒
CN113462820A (zh) 实时荧光定量检测四种猪腹泻病毒的多重rt-pcr引物探针组、试剂盒及其检测方法
CN113652505A (zh) 检测新型冠状病毒及其voc-202012/01突变株的方法和试剂盒
CN113388701A (zh) 引物探针组合物及其在制备副流感病毒分型检测试剂盒中的应用
CN117551812A (zh) 用于检测PaBV 2型、4型和5型的组合物及其试剂盒与应用
CN112226539A (zh) 一种诺如病毒核酸检测试剂盒
CN111676315A (zh) 检测新型冠状病毒ORF1ab基因的引物和探针及其试剂盒和方法
CN116287475A (zh) 芸薹黄化病毒rt-lamp-crispr等温检测的核酸序列组合、试剂盒及应用
CN116479177A (zh) 一种用于新型冠状病毒s基因6种突变位点检测的引物探针组合
CN113817870B (zh) 同时检测七种呼吸道相关病毒的引物组合物及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: 6 / F, no.1-400000, industrial park, Taikang District, Chongqing

Applicant after: Zhongyuan Huiji Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 6 / F, no.1-400000, industrial park, Taikang District, Chongqing

Applicant before: CHONGQING ZHONGYUAN HUIJI BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant