CN111270013A - 一种检测2019新型冠状病毒的多重实时荧光定量pcr试剂盒、方法及引物探针组合物 - Google Patents

一种检测2019新型冠状病毒的多重实时荧光定量pcr试剂盒、方法及引物探针组合物 Download PDF

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Abstract

本发明是一种用于同步检测2019新型冠状病毒ORF1ab基因、N基因、S基因和人B2M基因的多重反转录实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物和探针组合，该试剂盒采用单管四荧光通道同时检测三个2019新型冠状病毒基因和一个人内参基因，能检测呼吸道和血液样本中2019新型冠状病毒RNA的存在。本发明检测周期短、特异性强、灵敏度高、漏检率低、重复性好，能通过对人内参基因的检测结果对样本的提取和扩增过程进行质量监控，并通过dUTP‑UNG酶防污染体系降低由气溶胶污染导致的假阳性结果出现。

Description

一种检测2019新型冠状病毒的多重实时荧光定量PCR试剂盒、 方法及引物探针组合物
技术领域
本发明涉及核酸检测技术领域，具体涉及一种检测2019新型冠状 病毒的多重实时荧光定量PCR试剂盒、方法及引物探针组合物。
背景技术
人感染2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)后导致的肺炎称为新 型冠状病毒肺炎(COVID-19)，常见体征包括呼吸道症状、发热、咳 嗽、气促和呼吸困难，在重症病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼 吸综合征、肾衰竭甚至死亡，截止目前尚无特异性治疗方法，因此早 发现早隔离是最为有效的遏制疫情发展的措施。国家卫健委发布的 《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南》中明确指出，新型 冠状病毒感染的检测方法为反转录实时荧光定量PCR，且检测方法主 要针对新型冠状病毒基因组开放阅读框1ab(open readingframe 1ab， ORF1ab)和核壳蛋白(nucleocapsid protein，N)，若同一份标本中新 型冠状病毒两个靶标特异性反转录实时荧光定量PCR检测结果均为 阳性，则判定病例为阳性，但是同时指南也指出，由于病毒变异导致 阴性情况的存在，阴性结果也不能排除新型冠状病毒感染。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服背景技术的技术缺陷，提供一 种检测2019新型冠状病毒的多重实时荧光定量PCR试剂盒、方法及 引物探针组合物。本发明试剂盒采用单管四荧光通道同时检测三个 2019新型冠状病毒基因(ORF1ab基因、N基因和S基因)和一个人 内参基因(B2M基因)，设计检测针对呼吸道和血液等样本中的2019 新型冠状病毒RNA。本发明检测周期短、特异性强、灵敏度高、漏 检率低、重复性好，使用人内参基因内标可以做到对检测中样本的提 取和扩增全过程进行质量监控，并通过dUTP-UNG酶防污染体系降 低由气溶胶污染导致的假阳性结果出现。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
本发明所提供的用于对2019新型冠状病毒ORF1ab基因、N基 因、S基因和人B2M基因的多重反转录实时荧光定量PCR检测试剂 盒主要包括2019新型冠状病毒检测预混液、RT-PCR酶液(包含逆转 录酶、热启动rTaq酶以及UNG酶)、2019新型冠状病毒阳性对照、2019新型冠状病毒阴性对照。
2019新型冠状病毒检测预混液中包括多重反转录实时荧光定量 PCR反应所需的dNTP、dUTP、Mg2+、缓冲液、用于扩增2019新型 冠状病毒ORFlab基因、N基因、S基因和人B2M基因的引物、用 于检测2019新型冠状病毒ORFlab基因、N基因、S基因和人B2M 基因的探针(表1)。用于扩增和检测2019新型冠状病毒的正反向引 物序列和探针序列信息如表2所示；其中，用于检测2019新型冠状 病毒ORFlab基因的探针5’端添加荧光报告基团FAM，3’端添加荧光 猝灭基团BHQ-1；用于检测2019新型冠状病毒N基因的探针5’端添 加荧光报道基团Cy5，3’端添加荧光猝灭就团BHQ-2；用于检测2019 新型冠状病毒S基因的探针5’端添加荧光报道基团ROX，3’端添加 荧光猝灭基团BHQ-2；用于检测人B2M基因的探针5’端添加荧光报 道基团VIC，3’端添加荧光猝灭基团BHQ-2。由上述正反向引物和探 针序列的衍生序列也属于本发明内容，所述衍生序列是指在SEQ ID NO：1～12的基础上在序列的5’端或3’端添加或减少一个或多个碱基 得到的序列。为避免多重反转录实时荧光定量PCR过程中被延伸， 所述探针的3’端已经过磷酸化处理。
表1 2019新型冠状病毒检测预混液各组分配比(单次反应)
Figure BDA0002408933990000031
表2 用于扩增和检测2019新型冠状病毒的引物和探针序列
Figure BDA0002408933990000041
RT-PCR酶液中包含逆转录酶、热启动rTaq酶以及UNG酶，其 组分配比详见表3。
表3 RT-PCR酶液各组分配比(单次反应)
Figure BDA0002408933990000051
2019新型冠状病毒阳性对照为包含2019新冠状病毒ORF1ab基 因、N基因和S基因序列的质粒。2019新型冠状病毒阴性对照为H2O。
进一步地，所述试剂盒的检测方法为通过对疑似患者呼吸道、血 液等样本进行RNA提取，配制扩增反应体系后进行多重反转录实时 荧光定量PCR扩增，并对得到的扩增曲线进行分析，并作出阴阳性 判断。具体使用方法包括以下步骤：
(1)采用核酸自动提取仪对样本总核酸进行提取；
(2)取提取得到的核酸，按照表4配制多重反转录实时荧光定 量PCR反应体系；
表4 多重反转录实时荧光定量PCR反应体系
RT-PCR反应试剂 加样量(μL)
2019新型冠状病毒检测预混液 14
RT-PCR酶液 1
待检测的核酸样本/阴阳对照品 5
总体积 20
(3)根据表5设定反应程序进行多重反转录实时荧光定量PCR 反应。
表5 多重反转录实时荧光定量PCR反应程序
Figure BDA0002408933990000061
(4)根据多重反转录实时荧光定量PCR扩增结果，对检测结果 进行判读，其判定依据如下：阴性结果判读标准为：VIC通道的Ct 值≤38，且其他荧光信号通道的Ct值结果≥38或显示为 Undetermined/No Ct；阳性结果判读标准为：当检测结果 FAM/ROX/Cy5通道中有2个或3个通道的扩增曲线呈明显S型曲线， 且Ct值≤38，则样本判断为阳性；灰区结果判读标准为：当检测结果 FAM/ROX/Cy5通道只有1个通道的扩增曲线呈明显S型曲线且Ct 值≤38，则需重新检测；当检测FAM/ROX/Cy5通道的Ct值在38～40 之间，且扩增曲线呈典型S型，则需再次复合，若结果依然为灰区结 果或阳性结果，且扩增曲线呈现S型，则判定为阳性，否则判定为阴 性。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明公开了一种检测2019新型冠状病毒的多重实时荧光定量 PCR试剂盒、方法及引物探针组合物，该试剂盒采用单管四荧光通道 同时检测三个2019新型冠状病毒基因和一个人内参基因，能检测疑 似患者呼吸道样本、血液等样本中2019新型冠状病毒RNA的存在。 本发明检测周期短、特异性强、灵敏度高、漏检率低、重复性好，能 通过对人内参基因的检测结果对样本的提取和扩增过程进行质量监 控，并通过dUTP-UNG酶防污染体系降低由气溶胶污染导致的假阳 性判定出现。
附图说明
图1为样本A1多重反转录实时荧光定量PCR Cy5通道扩增曲线；
图2为样本A1多重反转录实时荧光定量PCR FAM通道扩增曲线；
图3为样本A1多重反转录实时荧光定量PCR ROX通道扩增曲线；
图4为样本A1多重反转录实时荧光定量PCR VIC通道扩增曲线；
图5为样本A2多重反转录实时荧光定量PCR Cy5通道扩增曲线；
图6为样本A2多重反转录实时荧光定量PCR FAM通道扩增曲线；
图7为样本A2多重反转录实时荧光定量PCR ROX通道扩增曲线；
图8为样本A2多重反转录实时荧光定量PCR VIC通道扩增曲线；
图9为样本B1多重反转录实时荧光定量PCR Cy5通道扩增曲线；
图10为样本B1多重反转录实时荧光定量PCR FAM通道扩增曲 线；
图11为样本B1多重反转录实时荧光定量PCR ROX通道扩增曲 线；
图12为样本B1多重反转录实时荧光定量PCR VIC通道扩增曲线；
图13为样本B2多重反转录实时荧光定量PCR Cy5通道扩增曲线；
图14为样本B2多重反转录实时荧光定量PCR FAM通道扩增曲 线；
图15为样本B2多重反转录实时荧光定量PCR ROX通道扩增曲 线；
图16为样本B2多重反转录实时荧光定量PCR VIC通道扩增曲线；
图17为实施例2中新型冠状病毒S基因多重反转录实时荧光定量 PCR灵敏度检测结果，其中，1为1×108拷贝的阳性重组质粒；2为1×107拷贝的阳性重组质粒；3为1×106拷贝的阳性重组质粒；4为1×105拷贝 的阳性重组质粒；5为1×104拷贝的阳性重组质粒；6为1×103拷贝的阳 性重组质粒；7为1×102拷贝的阳性重组质粒；
图18为实施例2中新型冠状病毒ORF1ab基因多重反转录实时荧 光定量PCR灵敏度检测结果，其中，1为1×108拷贝的阳性重组质粒； 2为1×107拷贝的阳性重组质粒；3为1×106拷贝的阳性重组质粒；4为 1×105拷贝的阳性重组质粒；5为1×104拷贝的阳性重组质粒；6为1×103拷贝的阳性重组质粒；7为1×102拷贝的阳性重组质粒；
图19为实施例2中新型冠状病毒N基因多重反转录实时荧光定量 PCR灵敏度检测结果，其中，1为1×108拷贝的阳性重组质粒；2为1×107拷贝的阳性重组质粒；3为1×106拷贝的阳性重组质粒；4为1×105拷贝 的阳性重组质粒；5为1×104拷贝的阳性重组质粒；6为1×103拷贝的阳 性重组质粒；7为1×102拷贝的阳性重组质粒；
图20为实施例2中新型冠状病毒B2M基因多重反转录实时荧光定 量PCR灵敏度检测结果，其中，1为1×108拷贝的阳性重组质粒；2为 1×107拷贝的阳性重组质粒；3为1×106拷贝的阳性重组质粒；4为1×105拷贝的阳性重组质粒；5为1×104拷贝的阳性重组质粒；6为1×103拷贝 的阳性重组质粒；7为1×102拷贝的阳性重组质粒。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施例和附图作进 一步说明。应理解，这些实施例仅用于对本发明进一步说明，而不用 于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明所述的内容后， 该领域的技术人员对本发明作出一些非本质的改动或调整，仍属于本 发明的保护范围。
实施例1～3所述2019新型冠状病毒的多重反转录实时荧光定量 PCR检测试剂盒中的2019新型冠状病毒检测预混液各组分配比如表1 所示。
实施例1～3所述2019新型冠状病毒的多重反转录实时荧光定量 PCR检测试剂盒中的用于扩增和检测2019新型冠状病毒的引物和探 针序列如表2所示；其中，用于检测2019新型冠状病毒ORF1ab基因的 探针5’端添加荧光报告基团FAM，3’端添加荧光猝灭基团BHQ-1；用 于检测2019新型冠状病毒N基因的探针5’端添加荧光报道基团Cy5，3’ 端添加荧光猝灭就团BHQ-2；用于检测2019新型冠状病毒S基因的探 针5’端添加荧光报道基团ROX，3’端添加荧光猝灭基团BHQ-2；用于 检测人B2M基因的探针5’端添加荧光报道基团VIC，3’端添加荧光猝 灭基团BHQ-2。
实施例1～3所述2019新型冠状病毒的多重反转录实时荧光定量 PCR检测试剂盒中的RT-PCR酶液各组分配比如表3所示。
实施例1～3用于检测2019新型冠状病毒的多重反转录实时荧光定 量PCR反应体系如表4所示。
实施例1～3用于检测2019新型冠状病毒的多重反转录实时荧光定 量PCR反应程序如表5所示。
实施例1
分别应用2019新型冠状病毒的多重反转录实时荧光定量PCR检 测试剂盒检测疑似患者和非疑似患者呼吸道和血液样本中2019新型 冠状病毒RNA的存在(疑似患者呼吸道样本编号为A1，疑似患者血 液样本编号为A2，非疑似患者呼吸道样本编号为B1，非疑似患者血 液样本编号为B2)：
1.核酸提取：使用核酸提取试剂在全自动核酸提取仪上同时对样 本A1、A2、B1、B2进行核酸自动提取，将完成提取的核酸样本置于 -20℃保存。
2.配制RT-PCR体系：根据每个反应14μL 2019新型冠状病毒检测 预混液、1μL RT-PCR酶液以及5μL待检测核酸样本配制RT-PCR反应 体系(表4)。配置完成后将反应管瞬时离心10s，并竖直置于冰上。
3.RT-PCR扩增：将反应管置于实时荧光定量PCR仪上，设定反 应程序：25℃2min；50℃30min；95℃2min；95℃15s，60℃60s， 循环45次，并在60℃时收集荧光信号(表5)。
4.结果判读：根据结果判读标准，判读样本中是否含有2019新型 冠状病毒RNA。对于样本A1，其Cy5/FAM/ROX/VIC通道Ct值分 别为31.38/34.51/32.56/32.16(图1～4)，达到了阳性样本判定标准， 判定样本A1包含2019新型冠状病毒RNA；对于样本A2其Cy5/FAM/ROX/VIC通道Ct值分别为28.07/28.96/29.24/28.09(图5～8)，同样 达到了阳性样本判定标准，判定样本A2包含2019新型冠状病毒RNA， 且判定结果与样本A1一致，说明本发明试剂盒能够准确的判定来自 呼吸道和血液样本中是否包含2019新型冠状病毒RNA。对于样本B1， 其Cy5/FAM/ROX/VIC通道Ct值分别为无/无/无/23.12(图 9～12)，VIC通道出现荧光信号，表明取样和扩增过程正常，故可判 定样本B1不包含2019新型冠状病毒RNA。对于样本B2，其Cy5/FAM /ROX/VIC通道Ct值分别为无/无/无/27.49(图13～16)，VIC通 道出现荧光信号，表明取样和扩增过程正常，故可判定样本B2不包含 2019新型冠状病毒RNA，与样本B1判定结果一致。
实施例2
2019新型冠状病毒的多重反转录实时荧光定量PCR检测试剂盒 标准曲线建立和灵敏度试验：
1.分别将测定浓度和纯度后的包含S基因、ORF1ab基因、N基因 和B2M基因的阳性重组质粒分别做10倍梯度稀释，得到从 1×102～1×108copies/μL共7个稀释度的阳性质粒作为标准模版。根据表 4配制反应体系，根据表5进行多重反转录实时荧光定量PCR，获得荧光扩增曲线并绘制标准曲线。
2.对于S基因(图17)，在浓度1×102～1×108copies/μL范围内扩增 曲线呈现较为典型的S型，各曲线间距均匀，具有良好的相关性，线 性方程式为y＝-2.9351x+41.435，R2＝0.9981，其最低检出限为1×102 copies。对于ORF1ab基因(图18)，在浓度1×102～1×108copies/μL范围 内扩增曲线呈现较为典型的S型，各曲线间距均匀，具有良好的相关性，线性方程式为y＝-3.0515x+40.145，R2＝0.9945，其最低检出限为 1×102copies。对于N基因(图19)，在浓度1×102～1×108copies/μL范围 内扩增曲线呈现较为典型的S型，各曲线间距均匀，具有良好的相关 性，线性方程式为y＝-3.2453x+39.329，R2＝0.9985，其最低检出限为 1×102copies。对于B2M基因(图20)，在浓度1×102～1×108copies/μL 范围内扩增曲线呈现较为典型的S型，各曲线间距均匀，具有良好的 相关性，线性方程式为y＝-2.9454x+41.335，R2＝0.9979，其最低检出 限为1×102copies。从4个靶基因的灵敏度比较看，4个靶基因的扩增 效率相近，引物间干扰少，试剂盒检测性能稳定。
实施例3
2019新型冠状病毒的多重反转录实时荧光定量PCR检测试剂盒 特异性试验：
1.分别利用常见呼吸道疾病病原微生物(包括人冠状病毒229E、 人冠状病毒NL63、人冠状病毒OC43、人冠状病毒HKU1、甲型流感 病毒、副流感病毒、偏肺病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻 病毒、博卡病毒、肺炎衣原体、沙眼衣原体、肺炎支原体以及腺病毒) 的基因组作为模版，对试剂盒特异性进行试验。
2.试验结果如表6所示。结果表明，2019新型冠状病毒的多重反 转录实时荧光定量PCR检测试剂盒对常见呼吸道疾病病原微生物检 测结果均为阴性，证明该试剂盒特异性好。
表6 试剂盒特异性验证
Figure BDA0002408933990000111
Figure BDA0002408933990000121
本发明在国家卫健委发布的《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检 测技术指南》推荐的两个靶标(ORF1ab和N)基础上又添加了突刺蛋 白(spike protein，S)检测靶点，新增靶点序列上同样具有高度的特 异性，在由于基因突变使原来的靶点不能有效地探测到病毒时，新增 靶点则代为履行检测职责，如此可以大大降低因突变或类似原因导致 的假阴性的机率；另一方面也使与SARS病毒能有更好的区分。检测 结果的灵敏度和可靠性都有显著的提升。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本 技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、 添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 宁波海尔施基因科技有限公司、 中国科学院大学宁波华美医院
<120> 一种检测2019新型冠状病毒的多重实时荧光定量PCR试剂盒、方法及引物探针组合物
<130> 2020-03-12
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<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 12
atgatgctgc ttacatgtct cgatcc 26

Claims (10)

1.一种检测2019新型冠状病毒的引物探针组合物，其特征在于，
包括用于扩增2019新型冠状病毒ORF1ab基因、N基因、S基因和人B2M基因的引物、以及用于检测2019新型冠状病毒ORF1ab基因、N基因、S基因和人B2M基因的相应探针；
所述用于扩增2019新型冠状病毒ORF1ab基因的正向引物序列为5’-TGTTAATGCCTATATTAACCTTGACCA-3’，如SEQ ID NO：1所示，用于扩增2019新型冠状病毒ORF1ab基因的反向引物序列为5’-GTGAGTTTTAACCTCTCTTCCGTG-3’，如SEQ ID NO：2所示；
所述用于扩增2019新型冠状病毒N基因的正向引物序列为5’-GACAAGGCGTTCCAATTAACAC-3’，如SEQ ID NO：3所示，用于扩增2019新型冠状病毒N基因的反向引物序列为5’-GAGATCTTTCATTTTACCGTCACC-3’，如SEQ ID NO：4所示；
所述用于扩增2019新型冠状病毒S基因的正向引物序列为5’-TCCATTTTTGGGTGTTTATTACCACA-3’，如SEQ ID NO：5所示，用于扩增2019新型冠状病毒S基因的反向引物序列为5’-GTGAGACATATTCAAAAGTGCAATTATTCG-3’，如SEQ ID NO：6所示；
所述用于扩增人B2M基因的正向引物序列为5’-GTTGAGTATGCCTGCCGTGT-3’，如SEQ IDNO：7所示，用于扩增人B2M基因的反向引物序列为5’-ATGCGGCATCTTCAAACCT-3’，如SEQ IDNO：8所示；
所述用于检测2019新型冠状病毒ORF1ab基因的探针序列为5’-TTGACACTGACTTAACAAAGCCTTACATTAAG-3’，如SEQ ID NO：9所示；
所述用于检测2019新型冠状病毒N基因的探针序列为5’-ACTACCGAAGAGCTACCAGACGA-3’，如SEQ ID NO：10所示；
所述用于检测2019新型冠状病毒S基因的探针序列为5’-AAACTCTGAACTCACTTTCCATCCAACT-3’，如SEQ ID NO：11所示；
所述用于检测人B2M基因的探针序列为5’-ATGATGCTGCTTACATGTCTCGATCC-3’，如SEQID NO：12所示。
2.如权利要求1所述的一种检测2019新型冠状病毒的引物探针组合物，其特征在于，用于检测2019新型冠状病毒ORF1ab基因的探针序列为如SEQ ID NO：9所示，探针5’端添加荧光报告基团FAM，3’端添加荧光猝灭基团BHQ-1；用于检测2019新型冠状病毒N基因的探针序列如SEQ ID NO：10所示，探针5’端添加荧光报道基团Cy5，3’端添加荧光猝灭就团BHQ-2；用于检测2019新型冠状病毒S基因的探针序列如SEQ ID NO：11所示，探针5’端添加荧光报道基团ROX，3’端添加荧光猝灭基团BHQ-2；用于检测人B2M基因的探针序列如SEQ ID NO：12所示，探针5’端添加荧光报道基团VIC，3’端添加荧光猝灭基团BHQ-2。
3.一种检测2019新型冠状病毒的多重实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包括2019新型冠状病毒检测预混液、RT-PCR酶液、2019新型冠状病毒阳性对照、2019新型冠状病毒阴性对照；所述2019新型冠状病毒检测预混液包含如权利要求1或2所述的引物探针组合物。
4.如权利要求3所述的一种检测2019新型冠状病毒的多重实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述2019新型冠状病毒检测预混液包括多重反转录实时荧光定量PCR反应所需的dNTP、dUTP、Mg2+、缓冲液。
5.如权利要求4所述的一种检测2019新型冠状病毒的多重实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR酶液包含逆转录酶、热启动rTaq酶以及UNG酶。
6.如权利要求5所述的一种检测2019新型冠状病毒的多重实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述2019新型冠状病毒阳性对照为包含2019新冠状病毒ORF1ab基因、N基因和S基因及人B2M基因序列的质粒；所述2019新型冠状病毒阴性对照为H2O。
7.一种非疾病诊断目的的2019新型冠状病毒多重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，通过对疑似患者呼吸道和血液样本进行RNA提取，应用权利要求3～6任意一项所述的多重实时荧光定量PCR试剂盒配制扩增反应体系后进行多重实时荧光定量PCR扩增，并对得到的扩增曲线进行分析，并作出阴阳性判断。
8.如权利要求7所述的一种非疾病诊断目的的2019新型冠状病毒多重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，扩增体系包含14μL2019新型冠状病毒检测预混液、1μLRT-PCR酶液、5μL待检测的核酸样品或5μL阴/阳性对照。
9.如权利要求8所述的一种非疾病诊断目的的2019新型冠状病毒多重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，扩增程序为：25℃2min；50℃30min；95℃2min；95℃15s，60℃60s，循环45次，并在60℃时收集荧光信号。
10.如权利要求9所述的一种非疾病诊断目的的2019新型冠状病毒多重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述阴阳性判断，其特征在于：阴性结果判定条件为：VIC通道的Ct值≤38，且其他荧光信号通道的Ct值结果≥38或显示为Undetermined/No Ct；阳性结果判定条件为：当检测结果FAM/ROX/Cy5通道中有2个或3个通道的扩增曲线呈明显S型曲线，且Ct值≤38，则样本判断为阳性；灰区结果判断条件为：当检测结果FAM/ROX/Cy5通道只有1个通道的扩增曲线呈明显S型曲线且Ct值≤38，则需重新检测；当检测FAM/ROX/Cy5通道的Ct值在38～40之间，且扩增曲线呈典型S型，则需再次复合，若结果依然为灰区结果或阳性结果，且扩增曲线呈现S型，则判定为阳性，否则判定为阴性。
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