CN112852928A - 一种多重核酸扩增产物检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于酸检测技术领域，公开一种多重核酸扩增产物检测方法，包括：建立包含显示剂的扩增反应体系，所述扩增反应体系中还包含待测样本、引物和扩增试剂；然后通过显色染料法判读扩增反应体系扩增结果；再根据判读的扩增结果判断是否进行试纸条检测。该方法将显色染料检测法与试纸条检测相结合，通过在多重核酸扩增体系中加入显色剂和不同的修饰引物，先利用显色剂的显色反应实现可视化判读核酸扩增结果，判断待测液是否成功扩增，扩增成功的待测液再通过免疫层析试纸条实现目标核酸的检测。由此可以剔除阳性样本中的假阳性样本，从而降低假阳率，提高检测的准确度，同时试纸条的检测线可全部用于检测指标，保证了扩增体系的多重检测能力。
Description
技术领域
本发明涉及核酸检测技术领域，具体涉及一种多重核酸扩增产物检测方法及试剂盒。
背景技术
病原体感染导致的传染性疾病的诊断往往需要结合病原学检查进行确诊，而对于传染性高或致死率高的病原体(如新型冠状病毒(SARS-COV-2))的检测，以及复杂病情(疑似多重感染)的病原体检测，往往需要用到多靶标联检。
在中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所发布的新型冠状病毒核酸检测引物和探针序列中，说明新冠病毒检测试剂盒的目标序列分别为开放读码框1ab(open readingframe，ORF1ab)、核壳蛋白(nucleoprotein，N)基因区域；同时检测需以人的基因作为内参，用于监控样本采集和提取效果，避免假阴性结果。而采用单靶标检测技术对某份待检样品中的多种可疑靶标进行检测，需要对一份样品进行反复的操作，不但大幅增加了工作量，延长了检测周期，增加了失误概率，同时可能带来样品污染及样品生物危害等，而且对检测结果可靠性、检测人员/环境生物安全均带来问题。因此基于检测性能(敏感性、特异性、样品耐受性)与操作性能(简便、快速)等多个方面的因素，需要对一份样本中存在的多个靶标进行同步检测，即多重检测。多重扩增在单个反应管中同时进行多个反应，既保留了传统扩增的相对高的灵敏度，又能一次性扩增多个靶基因，可节省大量的时间和试剂成本，操作简单，具有巨大的时效性和经济性。
目前市场上多靶标病原体核酸检测主要是利用多重PCR实现扩增，对应的PCR探针法、多重扩增-杂交、多重扩增-毛细管电泳、多重扩增-质谱等检测技术只适用于大医院、疫控中心等大型医疗机构，因为设备成本高、操作环境和人员要求高等原因，很难用在基层现场快检以及用于病原体流行的早期筛查。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多重核酸扩增产物检测方法，该方法将显色染料检测法与试纸条检测相结合，通过在多重核酸扩增体系中加入显色剂和不同的修饰引物，先利用显色剂的显色反应实现可视化判读核酸扩增结果，之后再利用核酸试纸条实现特定核酸产物的检测，有效提高检测效率和检测准确度。
本发明的另一目的在于提供一种多重核酸扩增产物检测试剂盒，有效提高检测效率和检测准确度。
具体地，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种多重核酸扩增产物检测方法，包括：建立包含显示剂的扩增反应体系，所述扩增反应体系中还包含待测样本、引物和扩增液；然后通过显色染料法判读扩增反应体系扩增结果；再根据判读的扩增结果判断是否进行试纸条检测。
根据本发明提供的一些实施方式，所述多重核酸扩增产物检测方法包括步骤：
S1：建立扩增反应体系：提供待测样本，所述待测样本含有内参核酸；提供引物，所述引物包括内参引物和目标核酸修饰引物，将待测样本、内参引物、目标核酸修饰引物、显色剂和扩增液混合形成混合液，进行扩增反应，得到待测液；
S2：显色染料法判读扩增结果：观察待测液中显色剂的显色反应，如未发生显色变化，停止检测，如发生显色变化，进行下一步；
S3：试纸条检测：将待测液转移至试纸条进行检测。
本发明的多重核酸扩增产物检测方法的待测样本是可能含有目标核酸的离体样品，如血液、血液制品、唾液或药品等。所述多重核酸扩增产物检测方法仅限于对离体样品的检测，直接结果是目标核酸的存在与否。即使对于利用本发明的检测方法检测人或动物的血液样品中病原体(如，病毒)上的目标核酸，也只能直接得出目标核酸的存在与否，还需要有经验的医生或取样人员判断，而不能直接得到疾病的诊断结果或健康状况。
在本文中，“多重检测”指的是同时检测的核酸有多种，即至少两种。在本发明的具体实施方式中，每种核酸可以是RNA，也可以是DNA。在本发明的具体实施方式中，优选进行二重检测、三重检测、四重检测、或五重检测。
本发明中显色染料法判读扩增结果主要是通过显色反应判断反应体系中的核酸是否成功扩增，如未扩增成功，表明为检测结果无效，停止检测，如扩增成功，则可进行下一步试纸条检测。
其中，显色剂判断扩增结果的原理是：扩增过程中产生的副产物如焦磷酸盐(PPi)等能与显色剂发生反应，反应前后待测液会呈现出颜色变化或者产生沉淀，从而可以对扩增结果进行判读，实现肉眼观察颜色变化即可实现对核酸扩增结果的检测。由此无需借助仪器设备，通过肉眼观察颜色变化即可判读检测结果，操作简便。只有扩增成功的待测液才能得出有效的检测结果，进行下一步试纸条检测，提高检测的准确性。
根据本发明提供的一些实施方式，所述试纸条为免疫层析试纸条。
免疫层析试纸条中，包括质控线(C线)和检测线(T线)，判断检测结果时，若试纸条质控线无条带，则判定试纸条失效；若试纸条质控线有条带，则试纸条正常工作，各检测线处出现条带则表明存在与检测线相对应的靶标，表明检测结果为阳性，待测样本含有目标核酸；试纸条仅在质控线出现条带，表明检测结果呈阴性，待测样本不含目标核酸。即只有当质控线和检测线同时出现条带才表明该检测结果为阳性，如果仅出现质控线表明检测结果为阴性。
免疫层析试纸条检测主要是利用蛋白胶体金原理，通常在修饰引物两端修饰双重标记物，同时在试纸条上检测线相应位置标记上对应的特异配体，在将扩增后待测液点在试纸条上时，当有待测核酸的扩增产物时，待测核酸上修饰的标记物与金标上修饰的特异配体结合，到达检测线时，检测线上固定的特异配体将标有标记物的产物捕获，从而显色；多余的胶体金向质控线时与生物素结合而显色。
而使用免疫层析试纸条检测核酸时一个缺点是无法规避假阳性的出现。这是由于在使用试纸条检测核酸时，理想情况下，只有核酸经过扩增后，待测样本中才会出现待测物质A-核酸-B，并与试纸条上的a、b结合得到阳性检测结果。但抗原A和抗原B本身是修饰在引物(核酸片段)上的，且生产过程中无可避免的会存在一些游离的抗原A和抗原B，这就导致了抗原A和抗原B因理化或其他原因组成了A-连接体-B的非待测物质，成为假阳性样本，并且在试纸条上与a、b结合得到假阳性检测结果。
使用免疫层析试纸条检测核酸时另一个缺点是检测指标少于检测线数量。目前市面上较为常见的进行核酸检测的免疫层析试纸条有单靶标试纸条、双靶标试纸条、和三靶标试纸条。在单靶标试纸条中，包括质控线(C线)和检测线(T线)两条线，质控线用于层析过程的质控，无法实现内参质控，因此单靶标试纸条仅能检测单靶标，无内参质控所以准确度最低。在双靶标试纸条中，包括质控线(C线)、第一检测线(T1线)和第二检测线(T2线)三条线，在三靶标试纸条中，包括质控线(C线)、第一检测线(T1线)、第二检测线(T2线)和第三检测线(T3线)四条线，通常会使用其中一条检测线作为内参检测，因而使检测指标少于检测线数量。
本发明中将显色染料法与试纸条检测方式相结合，显色剂显色反应可以判断待测液中内参核酸是否成功扩增，而无需在免疫层析试纸条再次进行内参检测，一方面，有效降低了试纸条的假阳率，另一方面，检测线可全部用于检测指标，即增加了一条可用检测线。
根据本发明提供的一些实施方式，所述待测样本中含有内参核酸和可能含有目标核酸。本发明的检测方法主要是通过显色反应判断反应体系中的内参核酸是否成功扩增，如未显色则未扩增成功，表明为检测结果无效，停止检测，如显色则扩增成功，可进行下一步试纸条检测。
本发明中，内参核酸是指在一般细胞当中表达量较为稳定的基因，作用是校验待测样本中RNA是否降解、纠正样本加样的差异、校正cDNA合成速率差异及校正PCR抑制剂的影响等，检测时需要将目标核酸与内参核酸其进行比较以及校正。这是由于每次测试的样品不同，因此必须要有内参核酸进行校正。如内参核酸没有扩增(扩增失败)，则得到检测数据为无效数据。本发明中，将在人体各器官组织细胞中普遍存在，能够代表人体来源样本被检测到的基因片段作为内参核酸。因此，所述待测样本中至少包含内参核酸，若扩增体系成功扩增，则内参核酸必然会显色，若扩增体系未变色，则表明扩增体系未成功扩增，只有扩增成功才能进行下一步的试纸条检测。一般情况下，内参核酸是取样时即被包含在待测样本中，当然，内参核酸也可以是在扩增前以试剂的方式添加入扩增体系中，同样是作为待测样本的一部分。
进一步的，本发明通过显色反应判断内参核酸是否扩增的方式，还能对核酸提取、扩增及检测等步骤进行监控，以防止技术性的假阴性。一般呼吸道疾病、肠道系统疾病，这些病毒感染性疾病最早感染的部位都是在咽喉部，因此在PCR诊断中若需要咽拭子的样本，特别是采集婴幼儿的咽拭子样本，往往会因为年龄小而控制能力不足所造成不愿配合或其咽喉窄小，增加了采集者在采集到有效、高质的临床咽拭子样本的难度。如果显色染料法判读扩增结果阶段没有出现颜色变化，说明采集到的样本质量有可能出现问题(如咽拭子未刮到上皮细胞、采样失败)或因为实验操作不当(核酸提取过程RNA降解，体系配置失误、荧光检测失败等)而出现假阴性。因此通过加入本发明的方法可有效监测整个实验操作过程的准确性，减少检测结果假阴性现象，保障检测结果的准确性。根据本发明提供的一些实施方式，在建立扩增反应体系时，扩增反应进行到设定的扩增反应时间的1/3-1/2时即可进行显色染料法判读扩增检测结果，如待测液中的显色剂未发生显色反应，停止扩增反应；如待测液中的显色剂发生显色反应，继续反应至扩增反应结束。
通常情况下，扩增反应体系需要预先设定好一定的扩增反应时间进行反应，扩增反应是持续进行的，因此显色剂发生显色反应也是随着扩增反应持续进行的，当扩增反应进行1/3-1/2时，已经足以观察到显色剂的浓度变化引起的显色反应，如果此时扩增反应体系显示剂仍无颜色变化，即可判断扩增反应体系未发生扩增反应，判定为无效检测结果，停止检测，以减少无效的检测时间，由此可以提前去除无效样本，提高检测效率。
根据本发明提供的一些实施方式，所述待测样本中含有内参核酸和可能含有目标核酸，所述引物包括内参引物和修饰引物。修饰引物也称为目标核酸修饰引物，其为通过标记物进行修饰的引物，不同的目标核酸与不同的修饰引物相对应，通过相对应的修饰引物可以检测出相应的目标核酸。例如，第一目标核酸修饰引物与第一目标核酸相对应，用于检测待测样本中是否含有第一目标核酸。由于至少检测了内参核酸和一种目标核酸，因此本发明的检测方法所检测的核酸至少有两种。
根据本发明提供的一些实施方式，所述建立扩增反应体系时将待测样本、目标核酸修饰引物、内参引物、显色剂和扩增液合形成混合液，进行扩增反应，得到待测液。由此，建立一个多重的扩增反应体系，使得扩增反应操作更简单方便。
根据本发明提供的一些实施方式，所述建立扩增反应体系时将目标核酸修饰引物与内参引物分别置于不同的扩增反应体系中得到目标核酸待测液与内参核酸待测液。
根据本发明提供的一些实施方式，所述建立扩增反应体系包括：
将待测样本、目标核酸修饰引物、显色剂和扩增液混合形成混合液，进行扩增反应，得到目标核酸待测液；
将待测样本、内参引物、显色剂和扩增液混合形成混合液，进行扩增反应，得到内参核酸待测液。
根据本发明提供的一些实施方式，所述显色染料法判读扩增结果包括：
观察内参核酸待测液的显色变化，如未反生显色变化，停止检测；如发生显色变化，将目标核酸待测液进行下一步试纸条检测。
根据本发明提供的一些实施方式，所述多重核酸扩增产物检测方法包括步骤：
S1：建立扩增反应体系：提供待测样本，所述待测样本含有内参核酸；提供引物，所述引物包括内参引物和目标核酸修饰引物；
将待测样本、目标核酸修饰引物、显色剂和扩增液混合形成混合液，进行扩增反应，得到目标核酸待测液；
将待测样本、内参引物、显色剂和扩增液混合形成混合液，进行扩增反应，得到内参核酸待测液；
S2：显色染料法判读扩增结果：观察内参核酸待测液中显色剂的显色反应，如未发生显色变化，停止检测，如发生显色变化，进行下一步；
S3：试纸条检测：将目标核酸待测液转移至试纸条进行检测。
通过将目标核酸修饰引物与内参引物分别置于不同的扩增反应体系中，并分别进行显色染料法判读扩增结果，可单独在内参核酸待测液中观察显色反应，能更准确的判断内参核酸是否成功发生扩增。如果内参核酸待测液发生显色变化，表明内参核酸成功发生扩增，扩增完成后即可进行下一步试纸条检测，如果内参核酸待测液未发生显色变化，表明内参核酸未发生扩增，检测结果无效，无需再进行下一步试纸条检测。
根据本发明提供的一些实施方式，所述待测样本中含有至少两种不同的目标核酸，将不同的目标核酸修饰引物及内参引物分别置于不同的扩增反应体系中得到不同的目标核酸待测液及内参核酸待测液。当不同的目标核酸为两种时，则制备得到两种不同的目标核酸待测液，当不同的目标核酸为三种时，则制备得到三种不同的目标核酸待测液。不同的目标核酸修饰引物分别用不同的标记物标记。如，在多重扩增反应体系，一组目标核酸修饰引物使用一组标记物标记，另一组目标核酸修饰引物使用另一标记物标记。
根据本发明提供的一些实施方式，所述建立扩增反应体系包括：
分别将至少两种不同的目标核酸修饰引物与待测样本、显色剂和扩增液混合形成混合液，进行扩增反应，得到不同的目标核酸待测液，得到的目标核酸待测液的数量与目标核酸种类数量相对应；
将待测样本、内参引物、显色剂和扩增液混合形成混合液，进行扩增反应，得到内参核酸待测液。
根据本发明提供的一些实施方式，所述显色染料法判读扩增结果包括：
先观察内参核酸待测液的显色反应，如未内参核酸待测液反生显色变化，停止检测；如内参核酸待测液反生显色变化，再观察各不同的目标核酸待测液的显色反应，如目标核酸待测液反生显色变化，检测结束；如目标核酸待测液未反生显色变化，混合待测液后进行下一步试纸条检测。
在一些具体实施方式中，如目标核酸待测液未反生显色变化，混合目标核酸待测液后进行下一步试纸条检测。
在一些具体实施方式中，如目标核酸待测液未反生显色变化，混合未反生显色变化的目标核酸待测液后进行下一步试纸条检测。
根据本发明提供的一些实施方式，所述多重核酸扩增产物检测方法包括步骤：
S1：建立扩增反应体系：提供待测样本，所述待测样本含有内参核酸；提供引物，所述引物包括内参引物和目标核酸修饰引物；
分别将至少两种不同的目标核酸修饰引物与待测样本、显色剂和扩增液混合形成混合液，进行扩增反应，得到不同的目标核酸待测液，得到的目标核酸待测液的数量与目标核酸种类数量相对应；
将待测样本、内参引物、显色剂和扩增液混合形成混合液，进行扩增反应，得到内参核酸待测液；
S2：显色染料法判读扩增结果：先观察内参核酸待测液的显色反应，如内参核酸待测液未反生显色变化，停止检测；如内参核酸待测液反生显色变化，再观察各不同的目标核酸待测液的显色反应，如目标核酸待测液全部反生显色变化，检测结束；如目标核酸待测液未全部反生显色变化，进行下一步；
S3：试纸条检测：将未反生显色反应的目标核酸待测液混合后转移至试纸条进行检测。
具体的，通过将不同的目标核酸修饰引物和内参引物分别置于不同的扩增反应体系中，形成多个单一的扩增体系，通过观察不同的目标核酸待测液的显色反应，可提前得出检测结果。例如，当待测样本中含有较高浓度的目标核酸(≥1000copy/μL)时，如果目标核酸成功发生扩增，则目标核酸待测液中的显色剂会发生颜色变化，由此可以判定待测样本中含有目标核酸，此时无需再进行下一步试纸条检测即可提前得出检测结果；当待测样本中不含有目标核酸或者含有较低浓度的目标核酸(≤1000copy/μL)时，由于显色染料法检测精度的限制，即使目标核酸成功发生扩增，目标核酸待测液中的显色剂发生颜色变化不足以被观察到，此时，则需要进行下一步试纸条检测，以确认待测样本中是否含有目标核酸。
另一方面，通过将不同的目标核酸修饰引物和内参引物分别置于不同的扩增反应体系中，可以提高扩增效率，由于多重反应体系存在多对特异性引物，不可避免地会产生引物间互相干扰等问题，要建立合格的多重核酸扩增反应体系需要较长的研发周期，不适用于类似新冠病毒等突发性感染性病原体的应急平台使用。
根据本发明提供的一些实施方式，所述显色剂为荧光染料或金属离子指示剂中的任意一种。
根据本发明提供的一些实施方式，所述荧光染料为SYBR Green I或PicoGreen中的任意一种。
根据本发明提供的一些实施方式，所述金属离子指示剂为钙黄绿素或羟基萘酚蓝中的任意一种。
在一些具体实施方式中，所述显色剂为羟基萘酚蓝。当使用羟基萘酚蓝(HNB)作为显色剂时，扩增体系中需要同时加入Mg2+。羟基萘酚蓝作为一种金属离子指示剂，可以和Mg2 +结合形成HNB-Mg复合物，使得待测液初始颜色为紫罗兰色，随着扩增反应的进行，扩增反应产生的焦磷酸盐(PPi)会结合Mg2+产生沉淀，消耗了多重扩增反应体系中的Mg2+，HNB-Mg复合物比例降低，羟基萘酚蓝失去了Mg2+使得多重扩增体系颜色变为天蓝色，因此可通过观察待测液的颜色发生变化，判断是否成功扩增。若待测液颜色不变(依旧为紫色)，则表明未成功扩增，若待测液颜色变为蓝色，则表明成功扩增。
在一些具体实施方式中，所述显色剂为SYBR Green I。若待测液颜色不变(依旧为橙色)，则表明未成功扩增，若待测液颜色变为黄绿色，则表明成功扩增。
根据本发明提供的一些实施方式，所述待测液中还包括有显色剂发生显色反应所需的其他试剂。
根据本发明提供的一些实施方式，同一目标核酸修饰引物中的上下游引物分别用不同的标记物标记。如，在一组目标核酸中，上游引物的5’端使用一种标记物标记，下游引物的5’端使用另一种标记物标记。
根据本发明提供的一些实施方式，所述标记物为荧光素、半抗原或化学发光探针中的任意一种或其组合。
在一些具体实施方式中，所述半抗原为生物素或地高辛。
根据本发明提供的一些实施方式，所述扩增液包括有核酸扩增所需的其他试剂，如缓冲剂和盐。
根据本发明提供的一些实施方式，免疫层析试纸条检测线标记有与标记物对应的特异配体。
在一些具体实施方式中，免疫层析试纸条上的胶体金以及检测线处各自独立的标记有链霉亲和素、抗荧光素抗体、生物素配体中的任意一种或其组合。
在一些具体实施方式中，目标核酸修饰引物的两端修饰双重标记物，标记物为生物素或地高辛，免疫层析纸条上的胶体金以及检测线处与标记物对应的标记有链霉亲和素、抗荧光素抗体、生物素配体中的任意一种或其组合。
根据本发明提供的一些实施方式，所述进行多重扩增是将混合液置于恒温环境中进行扩增反应，反应温度为37-65℃，反应时间为15-80min。
第二方面，本发明提供一种用于上述检测方法的多重核酸扩增产物检测试剂盒，包括透明容器和试纸条，其中，待测样本、引物、显色剂和扩增液放置于透明容器中以便于观察显色反应。
根据本发明提供的一些实施方式，不同的目标核酸修饰引物及内参引物分别与待测样本、显色剂和扩增液置于不同的所述透明容器内。
根据本发明提供的一些实施方式，所述透明容器为全透明容器、半透明容器、局部透明容器或局部半透明容器中的一种或其组合。
本发明具有以下技术效果：
本发明提供的多重核酸扩增产物检测方法中，先通过显色染料法中显色剂的显色反应实现可视化判读扩增结果，判断待测液是否成功扩增，扩增成功的待测液再通过免疫层析试纸条实现目标核酸的检测。由此可以剔除阳性样本中的假阳性样本，从而降低假阳率，提高检测的准确度，同时试纸条的检测线可全部用于检测指标，保证了扩增体系的多重检测能力。
本发明提供的多重核酸扩增产物检测方法中通过将不同的目标核酸和内参核酸分别置于不同的扩增反应体系中，并分别进行显示染料法判读，一方面，可以提高扩增效率，另一方面可以通过显色染料检测就可提前判断强阳性结果。
具体实施方式
除非另外说明，本发明所使用的所有科技术语具有与本发明所属领域技术人员的通常理解相同的含义。本发明涉及的所有专利和公开出版物通过引用方式整体并入本发明。
根据本发明提供的实施方式，本发明提供一种多重核酸扩增产物检测方法，包括步骤：
S1：建立扩增反应体系：提供待测样本，所述待测样本含有内参核酸；提供引物，所述引物包括内参引物和目标核酸修饰引物，将待测样本、内参引物、目标核酸修饰引物、显色剂和扩增液混合形成混合液，进行扩增反应，得到待测液；
S2：显色染料法判读扩增结果：观察待测液中显色剂的显色反应，如未发生显色变化，停止检测，如发生显色变化，进行下一步；
S3：试纸条检测：将待测液转移至试纸条进行检测。
在一些实施方式中，一种多重核酸扩增产物检测方法，包括步骤：
S1：建立扩增反应体系：
提供待测样本，所述待测样本含有内参核酸；提供引物，所述引物包括内参引物和目标核酸修饰引物；
将待测样本、目标核酸修饰引物、显色剂和扩增液混合形成混合液，进行扩增反应，得到目标核酸待测液；
将待测样本、内参引物、显色剂和扩增液混合形成混合液，进行扩增反应，得到内参核酸待测液；
S2：显色染料法判读扩增结果：
观察内参核酸待测液的显色变化，如未反生显色变化，停止检测；如发生显色变化，进行下一步；
S3：试纸条检测：将目标核酸待测液转移至试纸条进行检测。
进一步的，一种多重核酸扩增产物检测方法，当目标核酸数量为三个时，包括步骤：
S1：建立扩增反应体系：
提供待测样本，所述待测样本含有内参核酸；提供引物，所述引物包括内参引物和目标核酸修饰引物；
将待测样本、第一目标核酸修饰引物、显色剂和扩增液混合形成混合液，进行扩增反应，得到第一目标核酸待测液，
将待测样本、第二目标核酸修饰引物、显色剂和扩增液混合形成混合液，进行扩增反应，得到第二目标核酸待测液，
将待测样本、第三目标核酸修饰引物、显色剂和扩增液混合形成混合液，进行扩增反应，得到第三目标核酸待测液，
将待测样本、内参引物、显色剂和扩增液混合形成混合液，进行扩增反应，得到内参核酸待测液；
S2：显色染料法判读扩增结果：
先观察内参核酸待测液的显色反应，如内参核酸待测液未反生显色变化，停止检测；如内参核酸待测液反生显色变化，再观察各不同的目标核酸待测液的显色反应，如目标核酸待测液全部反生显色变化，检测结束；如目标核酸待测液未全部反生显色变化，进行下一步；
S3：试纸条检测：将未反生显色反应的目标核酸待测液混合后转移至试纸条进行检测。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照说明书记载的条件或按照常规条件或按照制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
基于多重LAMP扩增的SARS-COV-2N、S基因联检
所采用的LAMP引物包括两对内引物FIP-1/BIP-1和FIP-2/BIP-2、两对外引物F3-1/B3-1和F3-2/B3-2，以及两对环引物LF-1/LB-1和LF-2/LB-2，其中LF-1和LB-1的5′末端分别用异硫氰酸荧光素标记与生物素标记，LF-2和LB-2的5′末端被异硫氰酸荧光素标记与地高辛标记。本实施例的多重核酸扩增产物检测方法的具体步骤包括：
1、根据新型冠状病毒N和S基因序列设计下述用于多重LAMP扩增的引物，包括：内引物：FIP-1/BIP-1和FIP-2/BIP-2；外引物：F3-1/B3-1和F3-2/B3-2，环引物：LF-1/LB-1和LF-2/LB-2，本实施例中的引物来源于中国专利CN111270014A，此外在LF-1和LB-1的5′末端分别用异硫氰酸荧光素标记与生物素标记，LF-2和LB-2的5′末端被异硫氰酸荧光素标记与地高辛标记；各引物的序列如表1中所列：
表1
2、多重LAMP扩增反应体系的建立：
25μL反应体系包括：引物组2μL，dNTP mix 4μL，甜菜碱3μL，MgSO4 3μL，体积分数6％甲酰胺溶液，10×Buffer 2.5μL，Bst DNA大片段聚合酶2μL，AMV逆转录酶1μL，HNB染料1μL；待检样本5μL，振荡形成均匀混合液，得到待测液；
所述的LAMP引物组的比例为：终浓度为FIP/BIP：LF/LB：F3/B3＝1.6μM：0.8μM：0.4μM；
将上述混合均匀的反应液短暂离心后，置于水浴锅或者恒温加热器中进行扩增，反应温度为65℃，反应时间为30min，得到待测液。
3、显色染料法判读扩增结果：采用HNB染料检测法对获得的待测液进行判读扩增结果，具体实施步骤为：
在白色背景下观察扩增产物的颜色：待测液颜色变为蓝色，表明结果为阳性，DNA成功扩增。
4、试纸条检测
将显色染料法中显色检测结果为阳性的反应混合液中吸取5μL混合液加入到100μL Buffer中混匀，将试纸条浸入其中，反应5min肉眼观察试纸条显色结果，
检测结果试纸条仅在质控线出现条带，表明检测结果呈阴性，待测样本中不含SARS-COV-2。
实施例2
基于多重RPA扩增的磺胺耐药基因sul1、sul2和sul3联检
1、引物设计与筛选，根据sul1、sul2和sul3基因序列设计下述用于多重RPA扩增和试纸条检测的修饰引物，本实施例中的引物来源于中国计量大学学报第30卷30期论文《多重RPA-LFD技术快速检测磺胺类耐药基因研究》且引物设计和筛选按照文中所述的条件进行，此外，在上下游引物的5'末端进行不同的修饰，包括(5'-3')：
sul-1-F1:Digoxin-AAGACGCTCGACGAGATTGTGCGGTTCTT；
sul-1-R1:Biotin-AATAGCGGAAGCCCCAACGCCGACTTCAGCT；
sul-2-F1:TAMRA-CATCGTCAACATAACCTCGGACAGTTTCTCG；
sul-2-R1:Biotin-GGTTGATAACTGTCGAGCGAGACGGGAATG；
sul-3-F1:FAM-GCCGCTTCCAGTAATCCTGATACAACTGAA；
sul-3-R1:Biotin-TTTCTGGATTAGAGCCTAAAAAGAAGCCCATAC；
2、多重RPA扩增反应体系的建立：
采用RT-RAA核酸扩增试剂盒(试纸条法)推荐的50μL体系，以制备的RNA或(DNA质粒)为模板，进行三重恒温RPA反应。50μL反应体系包括：Buffer A 29.4μL，上游引物sul-1-F1、sul-2-F1、sul-3-F1各0.8μL(10μM)，下游引物sul-1-R1、sul-2-R1、sul-3-R1各0.8μL(10μM)，核酸模板5μL，ddH2O 8.2μL，Buffer B 2.5μL，SYBR Green I染料0.1μL。置于水浴锅中42℃反应30min，混合均匀后得到待测液。
3、显色染料法判读扩增结果：采用SYBR Green I核酸染料显色对获得的待测液进行判读扩增结果，具体实施步骤为：
在白色背景下观察扩增产物的颜色：待测液颜色变为黄绿色，则表明结果为阳性，DNA成功扩增。
4、试纸条检测
将显色染料法中显色测结果为阳性的反应混合液中吸取5μL混合液加入到100μLBuffer中混匀，将试纸条浸入其中，反应5min肉眼观察试纸条显色结果，
检测结果试纸条仅在质控线出现条带，表明检测结果呈阴性，待测样本中不含磺胺耐药基因sul1、sul2和sul3。
实施例3
基于多体系LAMP扩增的SARS-COV-2N、S基因联检
所采用的LAMP引物包括3对内引物FIP-NC/BIP-NC、FIP-1/BIP-1和FIP-2/BIP-2、3对外引物F3-NC/B3-NC、F3-1/B3-1和F3-2/B3-2，以及3对环引物LF-NC/LB-NC、LF-1/LB-1和LF-2/LB-2，其中LF-1和LB-1的5′末端分别用异硫氰酸荧光素标记与生物素标记，LF-2和LB-2的5′末端被异硫氰酸荧光素标记与地高辛标记。本实施例的多重核酸扩增产物检测方法的具体步骤包括：
1、根据新型冠状病毒N和S基因序列以及GAPDH基因序列设计下述用于多体系LAMP扩增的引物，包括：内引物：FIP-NC/BIP-NC、FIP-1/BIP-1和FIP-2/BIP-2；外引物：F3-NC/B3-NC、F3-1/B3-1和F3-2/B3-2，环引物：LF-NC/LB-NC、LF-1/LB-1和LF-2/LB-2，本实施例中的引物来源于中国专利CN111270014A，此外在LF-1和LB-1的5′末端分别用异硫氰酸荧光素标记与生物素标记，LF-2和LB-2的5′末端被异硫氰酸荧光素标记与地高辛标记；各引物的序列如表2中所列：
表2
2、多个LAMP扩增反应体系的建立：
N基因反应体系：引物组2μL(FIP/BIP-1：LF/LB-1：F3/B3-1＝1.6μM：0.8μM：0.4μM)，dNTP mix 4μL，甜菜碱3μL，MgSO4 3μL，体积分数6％甲酰胺溶液，10×Buffer 2.5μL，Bst DNA大片段聚合酶2μL，AMV逆转录酶1μL，HNB染料1μL；待检样本5μL，总共25μL反应体系；
S基因反应体系：引物组2μL(FIP/BIP-2：LF/LB-2：F3/B3-2＝1.6μM：0.8μM：0.4μM)，dNTP mix 4μL，甜菜碱3μL，MgSO4 3μL，体积分数6％甲酰胺溶液，10×Buffer 2.5μL，Bst DNA大片段聚合酶2μL，AMV逆转录酶1μL，HNB染料1μL；待检样本5μL，总共25μL反应体系；
GAPDH基因反应体系：引物组2μL(FIP/BIP-NC：LF/LB-NC：F3/B3-NC＝1.6μM：0.8μM：0.4μM)，dNTP mix 4μL，甜菜碱3μL，MgSO4 3μL，体积分数6％甲酰胺溶液，10×Buffer2.5μL，Bst DNA大片段聚合酶2μL，AMV逆转录酶1μL，HNB染料1μL；待检样本5μL，总共25μL反应体系；
将N基因、S基因和GAPDH基因3个扩增反应体系分别置于不同的透明容器内，在同一恒温条件下进行扩增，反应温度为64℃，反应时间为30min，得到3个扩增反应体系待测液。
3、显色染料法判读扩增结果：采用HNB染料检测法对获得的待测液进行检测，具体实施步骤为：
在白色背景下观察各扩增体系待测液的颜色变化，内参基因待测液扩增结束后扩增产物的颜色变为蓝色，表明结果为阳性，DNA成功扩增；N基因待测液和S基因待测液未显色，表明结果为阴性。
4、试纸条检测
将显色染料法判读扩增结果内参为阳性的N基因待测液和S基因待测液中各吸取5μL加入到100μL Buffer中混匀，将试纸条浸入其中，反应5min肉眼观察试纸条显色结果，检测结果试纸条仅在质控线出现条带，表明检测结果呈阴性，待测样本中不含SARS-COV-2。
对比例1
采用琼脂糖凝胶电泳检测法对实施例1中的待测液进行检测，判断是否成功扩增。
琼脂糖凝胶电泳检测法具体的步骤为：使用浓度为2％的琼脂糖凝胶进行电泳。电泳时，点样量为5μL，电压为130V，电泳时间为30min。电泳后的凝胶置于凝胶成像系统中紫外成像。成像后的电泳条带为特殊的梯状结构，表明扩增结果为阳性，待测液成功扩增。
其检测原理是：LAMP反应扩增后的产物是若干个不同长度的茎环DNA混合物，其在琼脂糖凝胶电泳的中的条带呈现特殊的梯状结构，而如果不发生扩增，则电泳后的成像结果中无条带出现。
对比例2
采用qPCR方法对实施例2中的扩增体系进行检测，判断是否成功扩增。
50μL反应体系包括：Buffer A 29.4μL，上游引物sul-1-F1、sul-2-F1、sul-3-F1各0.8μL(10μM)，下游引物sul-1-R1、sul-2-R1、sul-3-R1各0.8μL(10μM)，核酸模板5μL，ddH2O8.2μL，Buffer B 2.5μL，SYBR Green I染料0.1μL。将上述反应体系置于反应管内，42℃反应30min，反应过程借助荧光定量PCR仪SYBR通道实时监测，从软件生成的荧光曲线判断扩增结果为阳性，待测液成功扩增。
由实施例和对比例结果可知，对比例的判断结果与本发明实施例的判断结果一致，说明本发明的方法准确可靠，同时本发明的方法操作简单，能降低试纸条检测的假阳性以及增加试纸条的检测能力。
在本说明书的描述中，参考术语“一些实施方式”、“另一些实施方式”、“实施例”、“示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施方案以及实施例，可以理解的是，上述实施方案、实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施方案、实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种多重核酸扩增产物检测方法，其特征在于，包括：建立包含显示剂的扩增反应体系，所述扩增反应体系中还包含待测样本、引物和扩增液；然后通过显色染料法判读扩增反应体系扩增结果；再根据判读的扩增结果判断是否进行试纸条检测。
2.根据权利要求1所述多重核酸扩增产物检测方法，其特征在于，包括步骤：
S1：建立扩增反应体系：提供待测样本，所述待测样本含有内参核酸；提供引物，所述引物包括内参引物和目标核酸修饰引物，将待测样本、内参引物、目标核酸修饰引物、显色剂和扩增液混合形成混合液，进行扩增反应，得到待测液；
S2：显色染料法判读扩增结果：观察待测液中显色剂的显色反应，如未发生显色变化，停止检测，如发生显色变化，进行下一步；
S3：试纸条检测：将待测液转移至试纸条进行检测。
3.根据权利要求1所述多重核酸扩增产物检测方法，其特征在于，包括步骤：
S1：建立扩增反应体系：提供待测样本，所述待测样本含有内参核酸；提供引物，所述引物包括内参引物和目标核酸修饰引物；
将待测样本、目标核酸修饰引物、显色剂和扩增液混合形成混合液，进行扩增反应，得到目标核酸待测液；
将待测样本、内参引物、显色剂和扩增液混合形成混合液，进行扩增反应，得到内参核酸待测液；
S2：显色染料法判读扩增结果：观察内参核酸待测液中显色剂的显色反应，如未发生显色变化，停止检测，如发生显色变化，进行下一步；
S3：试纸条检测：将目标核酸待测液转移至试纸条进行检测。
4.根据权利要求1所述多重核酸扩增产物检测方法，其特征在于，包括步骤：
S1：建立扩增反应体系：提供待测样本，所述待测样本含有内参核酸；提供引物，所述引物包括内参引物和目标核酸修饰引物；
分别将至少两种不同的目标核酸修饰引物与待测样本、显色剂和扩增液混合形成混合液，进行扩增反应，得到不同的目标核酸待测液，得到的目标核酸待测液的数量与目标核酸种类数量相对应；
将待测样本、内参引物、显色剂和扩增液混合形成混合液，进行扩增反应，得到内参核酸待测液；
S2：显色染料法判读扩增结果：先观察内参核酸待测液的显色反应，如内参核酸待测液未反生显色变化，停止检测；如内参核酸待测液反生显色变化，再观察各不同的目标核酸待测液的显色反应，如目标核酸待测液全部反生显色变化，检测结束；如目标核酸待测液未全部反生显色变化，进行下一步；
S3：试纸条检测：将未反生显色反应的目标核酸待测液混合后转移至试纸条进行检测。
5.根据权利要求1所述多重核酸扩增产物检测方法，其特征在于，在建立扩增反应体系时，扩增反应进行到设定的扩增反应时间的1/3-1/2时即可进行显色染料法判读扩增检测结果，如待测液中的显色剂未发生显色反应，停止扩增反应；如待测液中的显色剂发生显色反应，继续反应至扩增反应结束。
6.根据权利要求1所述多重核酸产物扩增检测方法，其特征在于，所述引物包括内参引物和目标核酸修饰引物，所述目标核酸修饰引物使用标记物标记，所述标记物为荧光素、半抗原、化学发光探针中的任意一种或其组合。
7.根据权利要求1所述多重核酸扩增产物检测方法，其特征在于，所述显色剂为荧光染料或金属离子指示剂。
8.根据权利要求7所述多重核酸扩增产物检测方法，其特征在于，所述荧光染料为SYBRGreen I或PicoGreen，所述金属离子指示剂为钙黄绿素或羟基萘酚蓝。
9.一种多重核酸扩增产物检测试剂盒，使用权利要求1-8任意一项所述的多重核酸扩增检测方法进行检测，包括透明容器和试纸条，所述透明容器内设置有待测样本、引物、显色剂和扩增液。
10.根据权利要求9所述多重核酸扩增产物检测试剂盒，其特征在于，不同的目标核酸修饰引物及内参引物分别与待测样本、显色剂和扩增液置于不同的所述透明容器内。
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